Dissecção da glândula do anel larval: isolamento de órgãos endócrinos do desenvolvimento de Drosophila

Overview

Este vídeo descreve a glândula anel de Drosophila, uma estrutura endócrina complexa importante para a biosíntese e secreção de ecdysteróides e outros hormônios. O protocolo em destaque demonstra sua dissecção, fixação e imunostaining.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Imura et al., Protocolos para Visualização de Órgãos EsteróidesOgênicos e Seus Órgãos Interativos com Imunostaining na Mosca da Fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: O esquema geral dos protocolos é mostrado na Figura 1.

1. A Dissecção da Glândula do Anel Larval (RG)

NOTA: Em D. melanogaster, que pertence ao ciclorrhaphous Diptera, o PG está dentro de um órgão endócrino composto chamado glândula anelar (RG, Figura 2D). Como é inviável que o PG seja cirurgicamente separado de outros tipos de células (discutido posteriormente), um alvo prático é isolar um RG intacto e não danificado por dissecção.

1. Preparação de larvas nos estágios de desenvolvimento adequados
   NOTA: Para sincronizar os estágios de desenvolvimento das larvas D. melanogaster, é necessário coletar ovos dentro de uma janela de tempo estreita e coletar larvas nos momentos apropriados.
   1. Colete ovos por 2h em um prato de ágar suco de uva a 25 °C.
   2. Colete larvas recém-eclodidas 1^st instar sob um microscópio dissecando com fórceps e transfira-as para um pequeno frasco contendo purê padrão de levedura/comida de mosca de fubá.
      NOTA: A idade das larvas é representada por "horas após a colocação de ovos (hAEL)", "horas após a escotilha (hAH)", ou "horas após a ecdísis L3 (hAL3E)".
   3. No momento apropriado, colete as larvas encenadas com um laço plástico descartável para evitar ferimentos indesejáveis. Para minimizar a diferença na progressão do desenvolvimento das 3^rd instar larvas, colete as 2^ª larvas instar a 70 hAEL (48 hAH) e permita que elas se desarmem em intervalos de 2h. Em seguida, coletar as 3^rd larvas instar dentro de 2h após a ecdísis L3; este procedimento dá 0-2 hAL3E larvas.
   4. Transfira as larvas encenadas para um prato recheado com soro fisco tamponado de fosfato (PBS).
   5. Enxágüe as larvas com PBS para remover alimentos residuais do corpo.
2. Dissecção grosseira de larvas sob um microscópio dissecando
   1. Segure o gancho da boca de uma larva com fórceps. Corte o corpo larval no anterior um terço do comprimento do corpo usando micro tesoura.
   2. Segure a extremidade cortada do corpo larval anterior com um par de fórceps. Usando o outro par de fórceps, empurre suavemente a ponta da cabeça em direção ao interior do corpo; este procedimento transforma o corpo larval do avesso.
      NOTA: Este passo pode ser pulado para a dissecação de 1^st instar larvas.
   3. Repetir as etapas 1.2.1-1.2.2 com larvas adicionais por 5-10 min.
      NOTA: O número de larvas deve ser igual ou inferior a 20 para economizar tempo para dissecção.
3. Fixação e coloração de tecido com imunohistoquímica
   1. Coloque o terço anterior dos corpos larvais (passo 1.2.2) em um microtubo de 1,5 mL preenchido com 500 μL da solução fixa (4% de paraformaldeído em PBS). Fixar menos de 20 amostras ao mesmo tempo, caso contrário, o PBS anexado às amostras fixas pode causar uma diluição desfavorável do fixador. Para dissecção de filé, remova uma gota de PBS e, em seguida, adicione uma gota de solução de correção.
      NOTA: Para solução fixa, podem ser utilizados 3,7% formaldeído ou 4% de paraformaldeído.
   2. Incubar os tecidos dissecados na solução fixa por 30 minutos em temperatura ambiente (RT) ou, alternativamente, por 2h a 4 °C.
   3. Substitua a solução de correção por 500 μL PBS e enxágue rapidamente as amostras 3 vezes. Lave as amostras com 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% octilfenol ethoxylate) por 15 min em um roqueiro na RT. Para dissecção de filé, remova os pinos de inseto e transfira as amostras para um microtubo de 1,5 mL.
      NOTA: Para aumentar a permeabilidade dos anticorpos em tecidos, as amostras são tratadas com 500 μL 2,0% PBT para 1-2 h em um roqueiro em RT.
   4. Substitua o PBT por uma solução de bloqueio de 500 μL (2% de albumina de soro bovino em PBT). Incubar as amostras por 1,5 h em um roqueiro na RT.
   5. Substitua a solução de bloqueio por 50 μL a solução de anticorpos primários, ou seja, anticorpos diluídos na solução de bloqueio.
   6. Incubar as amostras durante a noite em um roqueiro a 4 °C.
   7. Substitua a solução de anticorpos primários por 500 μL 0,3% PBT e enxágue rapidamente as amostras 5 vezes. Lave as amostras 3 vezes com 500 μL 0,3% PBT por 15 minutos cada em um roqueiro na RT.
   8. Substitua 0,3% de PBT por 50 μL a solução de anticorpos secundários (anticorpos conjugados por corante diluídos na solução de bloqueio). Para coloração nuclear, 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenilômicos (DAPI, solução de estoque de 0,1 mg/mL) é adicionado à solução de 50 μL. Incubar as amostras em um roqueiro por 2 h no RT ou, alternativamente, a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Mantenha as amostras no escuro.
   9. Substitua a solução de anticorpos por 500 μL 0,3% PBT e enxágue 5 vezes. Lave as amostras 3 vezes com 500 μL 0,3% PBT por 15 min cada na RT.
4. Dissecção fina do complexo cérebro-RG contendo o PG e montagem
   1. Use uma tubulação descartável para transferir as amostras imunossuadas para um prato cheio de PBT de 0,3%.
      NOTA: Para evitar bolhas inconvenientes durante a dissecção e montagem, 0,3% de PBT pode ser substituído por PBS.
   2. Sob um microscópio dissecando, segure a cutícula ou gancho bucal com um par de fórceps. Usando uma agulha de 27 G presa a uma seringa de 1 mL como "faca", corte a ponta anterior do esôfago e discos oculares para remover o complexo de disco cérebro-RG-olho da cutícula corporal.
   3. Separe o esôfago e o intestino do complexo de disco cérebro-RG-olho com fórceps. Uma vez que o esôfago passa pelo cérebro acima do fio nervoso ventral (VNC), puxe o intestino para o lado posterior.
      NOTA: Para remover discos imagináveis extras das amostras, corte as conexões entre o cérebro, os discos oculares e os discos das pernas com uma faca de agulha.
   4. Repita as etapas 1.4.1-1.4.4 para outras amostras.
      NOTA: Para evitar que os detritos teciduais grudem nas amostras, transfira cada amostra completa para um prato limpo diferente, preenchido com 0,3% de PBT ou PBS.
   5. Transfira as amostras para o centro de uma lâmina de vidro limpa com uma micropipette.
      NOTA: Para 2^ou 3^º e 3º larvas instar, a ponta de uma ponta de micropipette deve ser truncada com uma lâmina de barbear.
   6. Sob um microscópio dissecando, alinhe amostras individuais com seu lado dorsal para cima usando fórceps.
      NOTA: O RG está localizado no lado dorsal do cérebro(Figura 2A). Esse alinhamento facilita a especificação de amostras individuais durante a imagem.
   7. Incline um slide de vidro e limpe o máximo de excesso de PBT possível. Coloque uma gota de reagente de montagem em um lado do slide. Coloque a borda de um deslizamento de cobertura do outro lado da gota e coloque o deslizamento da tampa sobre as amostras lentamente com fórceps.
      NOTA: Este procedimento impede que as amostras se movam para fora do deslizamento da tampa.
   8. Armazene as amostras a 4 °C. Mantenha as amostras no escuro.

Representative Results

Figura 1: O esquema geral dos protocolos. Dois métodos distintos de dissecção são aplicáveis a larvas e fêmeas adultas, dependendo da finalidade dos experimentos. Os métodos de montagem também são elaborados de acordo com as condições amostrais. Técnicas de fixação, coloração e imagem são basicamente comuns a todas as amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização do PG e dos Neurônios projetos de PG. (A e B) O complexo de glândulas cerebrais (RG) da larva instar tipo³ selvagem. Em (B), o PG é delineado por linhas pontilhadas. A estrutura filamentosa entre o cérebro e o RG é a traqueia. (C-E) A innervação do PG foi visualizada com mCD8::GFP conduzido por GMR45C06-GAL4 na coleção FlyLight. Os neurônios PG e GFP positivo foram rotulados com anticorpo anti-Sro (magenta) e anticorpo anti-GFP (verde), respectivamente. A imagem fluorescente é mesclada com a imagem de luz transmitida para especificar o contorno dos tecidos. Em (D),o PG, a corpora allata (CA) e a corpora cardiaca (CC) são ilustrados. Os neurônios projetantes pg são mais proeminentes na imagem de alta potência com lente objetiva 40X (setas em E) do que a imagem de baixa potência com lente objetiva 10X (C). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)