Overview
이 비디오는 Drosophila 반지 선, ecdysteroids 및 그밖 호르몬의 생합성 그리고 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조물을 기술합니다. 이 기능을 갖춘 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 스테인링을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 Imura 외.,스테로이드 성 장기를 시각화하기위한 프로토콜과 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터에서면역 염색과 그들의 대화 형 장기, J. Vis. Exp. (2017).
참고: 프로토콜의 전체 구성표는 그림 1에표시됩니다.
1. 라발 링 글랜드의 해부 (RG)
참고: D. 멜라노가스터에서,이는 사이클로라푸스 디테라에 속하는, PG는 링 선이라고 불리는 복합 내분비 기관 내에 있다 (RG, 도 2D). PG가 다른 유형의 세포(나중에 논의됨)와 외과적으로 분리되는 것은 불가능하기 때문에 실용적인 표적은 해부에 의해 손상되지 않은 손상되지 않은 RG를 분리하는 것입니다.
- 적절한 발달 단계에서 애벌레의 준비
참고: D. 멜라노가스터 애벌레의 발달 단계를 동기화하려면 좁은 시간 내에 계란을 수집하고 적절한 시기에 애벌레를 수집해야합니다.- 25°C에서 포도 주스 한천 접시에 2 시간 동안 계란을 수집합니다.
- 집게와 해부 현미경으로 새로 부화 된 1st 인스타 애벌레를 수집하고 으깬 표준 효모 / 옥수수 밀 플라이 푸드가 들어있는 작은 유리병으로 옮습니다.
참고: 애벌레의 나이는 "계란 누워 후 시간 (hAEL)", "해치 (hAH) 후 시간", 또는 "L3 절제술 (hAL3E) 후 시간"으로 표시됩니다. - 적절한 시점에서, 바람직하지 않은 부상을 방지하기 위해 일회용 플라스틱 루프와 함께 단계적 애벌레를 수집합니다. 3rd instar 애벌레의 발달 진행의 차이를 최소화하기 위해 70 hAEL (48 hAH)에서 2nd 인스타 애벌레를 수집하고 2 시간 간격으로 몰트 할 수 있습니다. 이어서, L3 절제술 후 2시간 이내에3rd 인스타 애벌레를 수집한다. 이 절차는 0-2 hAL3E 애벌레를 제공합니다.
- 단계적 유충을 인산염 완충식식염(PBS)으로 채워진 접시에 옮기다.
- 몸에서 잔류 식품을 제거하기 위해 PBS로 애벌레를 헹구는 다.
- 해부 현미경에서 애벌레의 거친 해부
- 집게로 애벌레의 입 갈고리를 잡습니다. 마이크로 가위를 사용하여 몸 길이의 앞쪽 에서 애벌레 몸을 분리하십시오.
- 앞쪽 애벌레 몸의 컷 끝을 한 쌍의 포셉으로 잡습니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 머리 끝을 몸 안쪽쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 이 절차는 애벌레 의 몸을 안쪽으로 바꿉니다.
참고: 이 단계는 1st 인스타 애벌레의 해부를 건너뛸 수 있습니다. - 5-10 분 동안 추가 애벌레와 함께 1.2.1-1.2.2 단계를 반복하십시오.
참고: 해부에 대한 시간을 절약하기 위해 애벌레의 수는 20 이하여야합니다.
- 면역 조직 화학을 가진 조직의 고정 및 염색
- 애벌레 몸의 전방 1/3(1.2.2단계)을 500 μL로 채워진 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 수정 용액(PBS의 4%파라포름알데히드). 한 번에 20개 미만의 샘플을 수정하면 고정 된 샘플에 부착 된 PBS가 고정 된 고수정의 불리한 희석을 일으킬 수 있습니다. 필렛 해부의 경우 PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션 한 방울을 추가합니다.
참고: 수정 용의 경우 3.7 % 포름알데히드 또는 4 % 파라 포름알데히드가 사용될 수 있습니다. - 실온(RT)에서 30분 또는 4°C에서 2시간 동안 수정 용액에서 해부된 조직을 배양한다.
- 수정 솔루션을 500 μL PBS로 교체하고 샘플을 3번 빠르게 헹구습니다. 500 μL 0.3% PBT(PBS + 0.3% 옥티펜놀 에톡시레이트)로 샘플을 RT로 로커에서 15분 간 세척합니다. 필렛 해부를 위해 곤충 핀을 제거하고 샘플을 1.5 mL 마이크로튜브로 옮겨넣습니다.
참고: 조직으로 항체의 투과성을 높이기 위해, 샘플은 RT에서 로커에 1-2 h에 대한 500 μL 2.0 % PBT로 처리됩니다. - PBT를 500 μL 차단 솔루션(PBT의 소 세럼 알부민 2%로 대체)으로 대체합니다. RT의 로커에서 1.5h의 샘플을 배양합니다.
- 차단 용액을 50μL로 대체하여 1차 항체 용액, 즉 차단 용액에서 희석된 항체를 교체한다.
- 4°C에서 로커에서 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다.
- 1차 항체 용액을 500 μL 0.3% PBT로 교체하고 샘플을 5회 빠르게 헹구는다. 500 μL 0.3% PBT로 샘플을 RT의 로커에서 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
- 0.3% PBT를 50μL로 교체하여 이차 항체 용액(차단 용액에서 희석된 염료-컨쥬게이트 항체). 핵 염색의 경우 0.5 μL 4', 6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI, 0.1 mg/mL 스톡 용액)이 50 μL 용액에 추가됩니다. 로커에서 2시간 동안 또는 하룻밤 사이에 4°C에서 샘플을 배양합니다.
참고: 샘플을 어둠 속에서 유지합니다. - 항체 용액을 500 μL 0.3% PBT로 교체하고 5회 헹구는 다. 500 μL 0.3% PBT로 샘플을 RT에서 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
- 애벌레 몸의 전방 1/3(1.2.2단계)을 500 μL로 채워진 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 수정 용액(PBS의 4%파라포름알데히드). 한 번에 20개 미만의 샘플을 수정하면 고정 된 샘플에 부착 된 PBS가 고정 된 고수정의 불리한 희석을 일으킬 수 있습니다. 필렛 해부의 경우 PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션 한 방울을 추가합니다.
- PG 및 장착을 포함하는 뇌-RG 복합체의 미세 해부
- 일회용 파이프를 사용하여 면역스테인드 샘플을 0.3% PBT로 채워진 접시로 옮기.
참고: 해부 및 장착 시 불편한 거품을 방지하기 위해 0.3 %의 PBT를 PBS로 대체 할 수 있습니다. - 해부 현미경에서, 포셉한 쌍으로 표피 또는 입 후크를 잡습니다. 1mL 주사기에 부착된 27G 바늘을 "나이프"로 사용하여 식도와 눈 디스크의 전방 끝을 잘라 체형에서 뇌-RG-아이 디스크 복합체를 제거합니다.
- 식도와 내장을 뇌-RG-눈 디스크 복합체에서 집게로 분리합니다. 식도는 복부 신경 코드 (VNC) 위의 뇌를 통과하기 때문에, 후방 측에 용기를 당깁니다.
참고: 샘플에서 여분의 상상 디스크를 제거하려면 바늘 칼로 뇌, 눈 디스크 및 다리 디스크 사이의 연결을 잘라냅니다. - 다른 샘플의 경우 1.4.1-1.4.4 단계를 반복합니다.
참고: 조직 파편이 시료에 달라붙는 것을 방지하기 위해 완료된 샘플을 0.3% PBT 또는 PBS로 채워진 다른 깨끗한 접시로 옮기습니다. - 마이크로 피펫으로 깨끗한 유리 슬라이드의 중심으로 샘플을 전송합니다.
참고: 2nd 또는 3rd instar 애벌레의 경우 마이크로 파이프 팁의 끝을 면도칼로 잘려야합니다. - 해부 현미경에서, 집게를 사용하여 그들의 등쪽 측으로 개별 견본을 정렬합니다.
참고: RG는 뇌의 등쪽 면에 위치하고있다(도 2A). 이 정렬은 이미징 중에 개별 샘플의 사양을 용이하게 합니다. - 유리 슬라이드를 기울이고 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아냅니다. 슬라이드 측면에 장착 시약 한 방울을 넣습니다. 커버의 가장자리를 드롭의 반대편에서 놓고 커버 슬립을 집게로 천천히 샘플에 놓습니다.
참고: 이 절차는 샘플이 덮개 미끄러짐 외부로 이동하는 것을 방지합니다. - 샘플을 4°C로 저장합니다. 샘플을 어둠 속에서 유지합니다.
- 일회용 파이프를 사용하여 면역스테인드 샘플을 0.3% PBT로 채워진 접시로 옮기.
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Representative Results
그림 1: 프로토콜의 전체 방식입니다. 두 개의 뚜렷한 해부 방법은 실험의 목적에 따라 애벌레와 성인 여성에게 적용됩니다. 마운팅 방법도 샘플 조건에 따라 고안된다. 고정, 염색 및 이미징 기술은 기본적으로 모든 샘플에서 일반적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PG 및 PG 프로젝팅 뉴런의 시각화. (A 와 B)야생형3rd 인스타 애벌레의 뇌링선(RG) 복합체. (B)에서PG는 점선으로 설명된다. 뇌와 RG 사이의 필라멘트 구조는 기관입니다. (C-E) PG의 내면은 플라이라이트 컬렉션에서 GMR45C06-GAL4가 구동하는 mCD8::GFP로 시각화되었습니다. PG 와 GFP 양성 뉴런은 각각 항스로 항체(magenta) 및 항GFP 항체(green)로 표지되었다. 형광 화상은 조직의 윤곽을 지정하기 위해 전송된 빛 이미지와 병합됩니다. (D),PG, 코포라 알라타(CA) 및 코포라 심장(CC)이 도시되어 있다. PG 프로젝팅 뉴런은 10X 목표 렌즈(C)가 있는 저전력 이미지보다 40X 목표 렌즈(E의 화살표)를 가진 고출력 이미지에서 더 두드러지다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | The recipe is on the website of Bloomington stock center. | ||
| Dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| Primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
