門脈注射:肝臓への癌転移を研究する方法

Overview

このビデオは、門脈注射を介してマウス肝臓に乳腺腫瘍細胞を送達するための外科的処置を説明する。このモデルは、肝転移の後期の調査を可能にする。

Protocol

1. 手術領域と器具の準備

1. はさみ、鉗子、止まり止めを124°Cで30分間、1-2日前に準備します。手術後の回復のために、オートクレーブまたは無菌の寝具、ケージ、食品へのアクセスを確保します。
2. 無菌の外科領域を準備し、好ましくは層流フードに入れる。
   1. 加熱パッド、光源、麻酔管および鼻コーン、およびそれが行われている間に外科的処置に近い外科スイートの他の部分を含む10%の漂白剤で外科区域のすべての表面を拭き取る。
   2. 無菌手術領域に、滅菌ドレープ、光源、麻酔管および無セコネ、インスリン注射器、洗浄された加熱パッドを置き、 1 mlシリンジ、ブピバカイン、人工涙、滅菌生理食塩液、2 x 2インチ滅菌ガーゼスポンジ、4 x 4インチ無菌ガーゼ、0.5~1cm2個に切断された止血ガーゼ、ハサミ、鉗子、止血、4-0 mlクロルクセネ
   3. このスペースには、準備された腫瘍細胞が氷の上に保存される余地があることを確認してください。
   4. 手術領域に隣接するベンチで、第2の加熱パッドと滅菌寝具で清潔なケージで回復領域を準備します。
      注: このエリアには、ビーズの滅菌器などのアイテムを収納することもできます。

2. ポータル静脈注入

1. 計画された注射の1時間前に、8〜15週齢のバルブ/c雌マウスを、痛みの管理のために0.015mg/mlブプレノルフィンの100 μlで治療します。
   注: この注射プロトコルは、任意の年齢での女性または男性のマウスの任意の株に適用され得る、 株の変化に適切な細胞株を使用する。
2. 選択した細胞株または腫瘍外植のプロトコルに基づいて、腫瘍細胞を注射用に準備します。マウス病原体の存在について投与前にすべての腫瘍細胞株を試験し、このような病原体を動物コロニーに導入するリスクを低減する。
   1. D2A1、D2.OR、および4T1腫瘍細胞を含む同系Balb/c腫瘍細胞株については、細胞が翌日の細胞が〜90〜100%合流するように注射の3日前に10cm組織培養プレートに細胞を解凍する。
   2. 1日後の腫瘍細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄細胞を解凍し、5分間37°Cで0.05%トリプシンの2mlを使用してコンフルエント腫瘍細胞をトリプシン化した。8 mlの完全な培地(DMEM高グルコース、10%の牛血清、2 mM L-グルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン)を加え、1:10を完全な培地の10mlで新鮮な10cm皿に加えます。
   3. 注射の日に、1x PBSで細胞を1回洗浄し、上記のようにトリプシン化する。
   4. 8 ml の完全な培地でトリプシン化された細胞を再懸濁し、1,500 x g で 5 分間スピンし、培地を取り出し、5 ml 1x PBS で再中断します。
   5. 生存率評価のためにトリパンブルー排除を使用して、ヘモサイトメーター上の細胞を数えます。あらかじめ決められた濃度および容積で1x PBSで注入のための細胞を再懸濁する。
      注:5 - 10 μlは、小さな注入量が肝臓への不必要な損傷を防ぐので推奨されます。
   6. 注射の間、細胞を氷の上に置いてください。注射が完了した後、細胞のサンプルを実験室に戻し、培養液中に1日間培養して、生存率を確保します。
3. 酸素で送達される2-2.5%のイソフルラン(2-クロロ-2-(ジフルオロメトキシ)-1,1,1-トリフルオロエタン)を用いて、麻酔下にマウスを置きます。暖房パッドを使用して体温を維持します。 つま先ピンチに対する反応を評価することによって完全な麻酔を確実にし、2-2.5%のイオブルランで麻酔を維持します。
   注: 動物の呼吸速度を監視し、手順全体を通してそれに応じてイオブルランの流量を調整することが重要です。
4. 外科的処置中に目の過度の乾燥を避けるために、各目の上に少量の人工涙または獣医軟膏を置く。
5. マウスを腹腔の位置に置き、腹部を露出させた背中に置きます。
6. 化学脱毛で領域を拭くことによって、第4の肋骨空間から4番目のインギーム乳腺乳首までげっ歯類の腹側の髪を取り除きます。脱毛剤を1〜2分間座ってからガーゼとH2Oで完全に取り除く。多数の手術が計画されている場合、時間を節約するために、このステップは、1 - 2日前に行うことができます。
7. 1つの2 x 2"滅菌ガーゼスポンジ(2%クロルヘキシジンに浸した)を取り、脱毛部位でマウスを拭き取ります。尾部を含む周囲全域を殺菌し、器具の細菌汚染を最小限に抑えます。
8. アルコールの準備パッドで脱毛とその周辺のサイトを拭きます。
9. 2%クロルヘキシジンとアルコールステップをもう一度繰り返し、最終的なクロルヘキシジンを3つの2%クロルヘキシジンと2つのアルコール準備パッドのスリングで仕上げる。最終的なクロルヘキシジンは、内臓にクロルヘキシジンを得ることを避けるために、化学物質が外科部位の周りに滴り落ちないように拭きます.
   注: 皮膚および周囲の毛皮に大量のクロルヘキシジンおよびアルコールを塗布すると、体温が大幅に低下する可能性があります。手順 2.7 ~2.9 の間は、余分なボリュームで拭かないでください。暖房パッドで体温を維持します。
10. 滅菌手袋と滅菌ブレード付きの滅菌メスを使用して、マウスの左側の中央値と矢状の平面の間の皮膚に1インチの切開を行い、肋骨のすぐ下から始まり、4番目のうるさい乳腺の乳頭の平面のすぐ上で終わります。
11. オートクレーブまたはビーズ滅菌ハサミと鉗子を使用して、腹骨に同様の1インチの切開を行います。乳腺脂肪パッドに切り込むのを避け、腸、肝臓、または横隔膜を切断しないようにしてください。
12. 4 x 4インチのガーゼパッドをマウスの左側に無菌生理液に浸し、そこで切開を行い、内臓をガーゼに置き、周囲の皮膚または外科的領域に接触しないようにする。
13. 腫瘍細胞がマウスの調製中に落ち着くように上下に数回ピペットすることによって腫瘍細胞を準備する。25 μlの取り外し可能な針の注射器と32ゲージの針を腫瘍細胞と準備します。腫瘍細胞が針の先端にあり、プランジャーが注射に適した容積になるまで注射器を押す;気泡の注入を避ける。
14. 無菌アルコールパッドで針の外側を拭き取り、外部腫瘍細胞を取り除きます。針の棒を避けるために注意してください。
15. 皮膚および腹膜内層を含む切開の中央値側を保持し、鉗子を除き、滅菌綿棒を使用して大腸と小腸を慎重に引き出し、滅菌生理に浸した無菌ガーゼに置きます。門脈が可視化されるまで大腸と小腸を引き抜く。
16. 生理食い物の中の内臓を覆い、ガーゼを浸し、内部の水分と無菌性を維持します。
17. また、無菌手袋を着用したアシスタントを持ち、生理食音に浸したガーゼに包まれた腸を、無菌綿の先端綿棒でそっと邪魔にして、ポータルの静脈を完全に明らかにします。さらに、切開の中央部側に組織を脇に保持するために、オートクレーブ化止軟筋または鉗子を使用する必要がある場合があります。
18. 腫瘍細胞を装填した針をポータル静脈に3〜5mm、肝臓の下10mmの角度で<静脈に5°、ベベルを上に向けて挿入します。腫瘍細胞を含む全容をゆっくりと注入する。静脈から腫瘍細胞の逆流を避けるために、血液が針頭を通り過ぎて数秒間流れるようにします。注射中に静脈の針を動かすことを最小限に抑えます。ここでも、針のスティックを避けるために注意してください。
    注: 門脈の可視化は拡大せずに行われるが、好ましい場合はステレオ顕微鏡を用いてもよい。
19. 針を取り外し、同時に無菌綿の先端アプリケーターを静脈に圧力で置きます。アシスタントがまだ腸を脇に保持していると、静脈の注射部位の上に0.5〜1cm2の止血ガーゼの1個を置きます。
    注: 止血性粉末は、プロトコルのこのステップのためにも試みられたが、注射後の静脈失失を止めるのに有効ではなかった。
20. 無菌コットンチップアプリケーターからの圧力で注射部位の止血ガーゼを5分間保持します。
21. 注意深く止血ガーゼを持ち上げることによって静脈の閉鎖を評価し、ガーゼが周囲の組織に付着する場合、少量の無菌生理食動物を使用してガーゼを浸し、持ち上げることができる。
22. この時点で失血が発生した場合は、さらに5分間の圧力で部位に止血ガーゼを追加します。血流が完全に止まったら、マウスからガーゼを取り除く。
    注: 外科的処置中の失血は慎重に評価する必要があり、許容される失血量の合計が満たされるか、または超過した場合(研究者の機関審査委員会の規制標準手術手順に基づく)、マウスは心臓灌流による麻酔下で安楽死させなければならない。
23. 注射部位が無傷とみなされたら、注射部位を離れる血液を持たない状態で、内臓を腹腔に静かに戻します。
24. 腹膜内層を縫合し、次に、単純な連続または中断縫合パターンを使用して、滅菌4-0ビクリル縫合糸とテーパーニーと皮膚を縫合する。典型的には、切開を閉じるには10〜15の縫合糸が必要である。
25. インスリン注射器を用いた局所疼痛管理のために、切開部位に沿って100μlのブピバカイン(5mg/ml)を注入する。水和のために26ゲージの針と1 mlの注射器を使用して、皮下に0.5mlの滅菌生理食塩水を注入します。手術は完了するまでに15〜25分かかります。
26. 手術中の無菌状態を維持するために、手袋をした手を含むマウスに接触するすべてのツールと材料が接触する前に適切に洗浄されるようにしてください。可能な場合は滅菌材および手袋を使用するか、または70%エタノール溶液または10%漂白液を最小限に利用して洗浄する。
27. 1回のセッションで複数の手術が計画されている場合、新鮮な滅菌ドレープ、インスリン注射器、1ml注射器、滅菌生理食塩水、2 x 2インチ滅菌ガーゼスポンジ、4 x 4インチ滅菌ガーゼ、ヘモスタティックガーゼを0.5-1 cm2ピースにカットし、4-0ビニル縫合糸をタパー針で2%塩素ゼで最初の手術領域にリメイクします。手術の合間にハサミ、鉗子、止まり金をビード殺菌し、再使用前に十分に冷まします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery