Summary
इस प्रक्रिया में उच्च उपज के साथ डीएनए टुकड़े की शुद्धि की अनुमति देता है.
Abstract
शुद्ध डीएनए टुकड़े आण्विक जीवविज्ञान में विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है और वे कई प्रक्रियाओं द्वारा तैयार किया जा सकता है. उनमें से ज्यादातर डीएनए टुकड़े के एक पिछले वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता है क्रम में करने के लिए ब्याज की बैंड अलग है. फिर, इस बैंड एक agarose या acrylamide जेल से बाहर excised है और का उपयोग करके शुद्ध या तो: बाध्यकारी और गिलास या सिलिका के कण, DEAE सेलूलोज़ झिल्ली से elution "को कुचलने और विधि सोख" electroelution या बहुत महंगी अक्सर वाणिज्यिक शुद्धि किट. इस प्रकार, एक विधि का चयन ज्यादातर क्या प्रयोगशाला में उपलब्ध है निर्भर करेगा. electroelution प्रक्रिया है एक बहुत साफ करने के लिए आवेदनों की एक बड़ी संख्या (अनुक्रमण, radiolabeling, enzymatic प्रतिबंध, enzymatic संशोधन, क्लोनिंग आदि) में इस्तेमाल किया जा डीएनए को शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रक्रिया को रखने में शामिल डीएनए बैंड electroeluter का नमूना कुओं, तो आवेदन वर्तमान में agarose या acrylamide स्लाइस युक्त डीएनए टुकड़ा agarose छोड़ने के लिए बनाने के लिए और इस तरह एक तकिया नमक में फंस जाएगा बाद में इथेनॉल तेज़ी से बरामद हो.
Protocol
- आदेश में शुद्ध ब्याज के डीएनए टुकड़े का चयन करने के लिए, इन agarose में हल किया जाना चाहिए या acrylamide जैल ethidium ब्रोमाइड के साथ 1 घंटे के लिए 120 वोल्ट पर 0.5X TBE बफर (Tris borate, EDTA) का उपयोग वैद्युतकणसंचलन द्वारा दाग जेल. इस के लिए, ~ प्लाज्मिड pProEx - GdMre11S के 700 एनजी (6000 बीपी) पहले NdeI और HindIII साथ पचा एक टुकड़ा 900 बीपी (टुकड़ा के प्लाज्मिड और 84 एनजी के 560 एनजी) जारी किया गया था.
- electroeluter टैंक (चित्रा 1) 0.5X मध्य पठार के प्रत्येक पक्ष में समान रूप से वितरित TBE से भरा होना चाहिए मध्य पठार पर इसे गिराना नहीं ख्याल रख रही है.
- चयनित बैंड (या बैंड) जेल के बाहर काट रहा है, और वी चैनल (अच्छी तरह से प्रति एक टुकड़ा) के रूप में संभव करीब के रूप में नमूना कक्ष में रखा. रनिंग बफर प्रत्येक कक्ष में जोड़ा जाना चाहिए, सिर्फ जेल टुकड़ा कवर पर्याप्त है.
- प्रत्येक चैनल वी इस्तेमाल किया पाश्चर विंदुक के साथ प्लावित किया जाना चाहिए किसी भी हवा बुलबुले फँस को खत्म करने.
- फिर 10 एम एनएच 4 एसीटेट के 100 उल (दृश्य को सुविधाजनक बनाने के bromophenol नीले रंग की एक छोटी राशि जोड़ा है, बस यह रंग के लिए पर्याप्त) धीरे वी चैनल के अंदर जोड़ रहे हैं.
- ढक्कन धीरे बंद किया जाना चाहिए उच्च नमक तकिया के किसी भी resuspension को रोकने.
- Electroelution 25 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर शुरू कर दिया है.
- जब electrolution पूरा हो गया है, 400 उल वी चैनल से हटा रहे हैं, और एक microfuge ट्यूब में रखा 4 में 2 ठंड इथेनॉल और ग्लाइकोजन (डीएनए वसूली में सुधार की सिफारिश की) की मात्रा ° सी के साथ एक घंटे या रात भर के लिए उपजी हो.
- 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 70% इथेनॉल के साथ धोने.
- ड्राई ट्यूब और आयुध डिपो 260 एनएम डीएनए यों.
- प्राप्त वसूली 75% (63 एनजी बरामद जब 84 एनजी वि चैनल पर रखा गया था) था.
चित्रा 1 Electroeluter आरेख. Anod एक कैथोड टैंक, कटा हुआ जेल में निहित डीएनए के प्रत्येक पक्ष पर संकेत कर रहे हैं (एक काले वर्ग के रूप में सचित्र) अपनी नकारात्मक चार्ज के कारण कैथोड की ओर पलायन होगा. तो यह नमक (एक औंधा काले त्रिकोण के रूप में प्रतिनिधित्व) वी चैनल में स्थित तकिया में फंस जाएगा.
Discussion
चलाने की अवधि के उच्च टुकड़े के आकार पर निर्भर करती है, अप करने के लिए टुकड़े के लिए सामान्य होगा 20 केबी 1 घंटे 50 मिनट के लिए पर्याप्त है, जबकि हर 10 मिनट की निगरानी के छोटे टुकड़ों के लिए यूवी प्रकाश टुकड़ा को रोकने के लिए के माध्यम से जाना आवश्यक है नमक तकिया और anodal बफर वसूली कम कक्ष करने के लिए फलस्वरूप. यह महत्वपूर्ण है लगता है कि जब आप 100 वोल्ट पर अपने बिजली की आपूर्ति सेट, वहाँ वर्तमान कम से कम 10 mAmp है है. डीएनए बैंड एक यूवी हाथ दीपक का उपयोग करके नजर रखी जा सकता है और पता लगाने जब इस जेल टुकड़ा छोड़ दिया. तकिया नमक 3 एम ना एसीटेट के साथ भी बनाया जा सकता है है.
यह प्रक्रिया अच्छी वसूली (~ 80%) के साथ अलग अलग आकार के डीएनए या शाही सेना के टुकड़े के शुद्धीकरण radiolabeled प्रतिबंध एंजाइमों से पच, संशोधित एंजाइमों, आदि द्वारा संसाधित की अनुमति देता है
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
डॉ. Bermudez प्रयोगशाला में काम Conacyt (# अनुदान 82,622) द्वारा वित्त पोषित किया गया था हम गुटियारे सोसा Gabriela, Eliuth रेयेस-मार्टिनेज और electroleution वीडियो रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के लिए Rodriguez टोरेस Ximena. धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
