Summary
Detta förfarande gör det möjligt för rening av DNA-fragment med hög avkastning.
Abstract
Renat DNA-fragment används för olika ändamål i molekylärbiologi och de kan tillagas av flera rutiner. De flesta av dem kräver en tidigare elektrofores av DNA-fragment för att skilja bandet av intresse. Då är här bandet skärs ut från en agaros eller akrylamid gel och renas med hjälp av antingen: bindande och elueringstid från glas eller kvarts partiklar, DEAE-cellulosa membran, "krossa och njuta metod", electroelution eller mycket ofta dyra kommersiella kit rening. Således kommer välja en metod beror till största delen av vad som finns tillgängligt i laboratoriet. Det electroelution Förfarandet gör att man kan rena mycket rena DNA som ska användas i ett stort antal ansökningar (sekvensering, radioaktiv inmärkning, enzymatiska begränsning, enzymatisk modifiering, kloning etc). Detta förfarande består i att placera DNA-bandet innehåller agaros eller akrylamid skivor i provbrunnar av electroeluter, sedan tillämpa nuvarande kommer att göra DNA-fragment för att lämna agaros och därmed fastna i en kudde salt som skall återbetalas senare av etanol nederbörd.
Protocol
- För att välja DNA-fragment av intresse som skall renas bör dessa lösas i agaros eller akrylamid gel gel färgas med etidiumbromid med elektrofores med 0,5 x TBE-buffert (Tris borat, EDTA) vid 120 volt i 1 timme. För detta, ~ 700 ng plasmid pProEx-GdMre11S (6000-bp) som tidigare kokas med NdeI och HindIII användes för att släppa en 900-bp-fragmentet (560 ng plasmid och 84 ng av fragment).
- Den electroeluter tanken (Figur 1) bör fyllas med 0,5 x TBE jämnt fördelade i varje sida av mitten av platån som tar hand om att spilla den på mitten av platån.
- Den valda bandet (eller band) skärs ut av gelen, och placeras i provkammaren så nära som möjligt till V-kanal (en skiva per brunn). Köra buffert bör läggas till varje kammare, precis tillräckligt för att täcka gelen slice.
- Varje V-kanal som används skall spolas med en pasteurpipett att eliminera alla luftbubbla fångade.
- Sedan 100 ul 10 M NH 4 acetat (för att underlätta visualisering en liten mängd Bromfenolblått läggs, precis tillräckligt för att färga det) är försiktigt läggas inne i V-kanal.
- Locket bör stängas försiktigt för att förhindra resuspension av den höga salt dynan.
- Electroelution påbörjas vid 100 volt i 25 minuter.
- När electrolution är klar, är 400 ul bort från V-kanal, och placeras i ett mikrofugrör som fälls ut med två volymer kall etanol och glykogen (rekommenderas för att förbättra DNA återvinning) vid 4 ° C under 1 timme eller över natten.
- Centrifugera i 20 minuter, ta supernatanten och tvätta med 70% etanol.
- Torrt rör och kvantifiera DNA vid OD 260 nm.
- Återhämtningen erhållas var 75% (63 ng återhämtat sig när 84 ng släpptes ut på V-kanal).
Figur 1. Electroeluter diagram. Anod en katod anges på varje sida av tanken, DNA som finns i skivade gel (illustreras som en svart fyrkant) kommer att vandra mot katoden på grund av dess negativa laddning. Då blir det fastna i saltet kudde (representerade en inverterad svart triangel) som ligger i V-kanal.
Discussion
Längden på sikt beror mycket på storleken på fragmenten, normalt för fragment upp till 20 kb 50 minuter till 1 timme räcker, medan det för små fragment UV-ljus uppföljning var 10 minuter krävs för att förhindra att fragmentet att gå igenom salt kudde och därmed till Anodal bufferten kammaren minskar återhämtning. Det är viktigt att se till att när du ställer in strömförsörjningen vid 100 volt, det är strömt på minst 10 MAMP. DNA-bandet kan övervakas med hjälp av en UV-handlampa och upptäcka när detta överger gelen slice. Kudden salt kan också göras med 3 M Na-acetat.
Detta förfarande gör det möjligt för rening av DNA eller RNA fragment av olika storlek med bra återhämtning (~ 80%) vara märkt, smältas av restriktionsenzymer, bearbetas av enzym, etc.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbete i Dr Bermudez laboratoriet har finansierats av Conacyt (Grant # 82.622). Vi tackar Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez och Ximena Rodriguez-Torres för videoinspelning det electroleution förfarande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
