Summary
Echografie Gerichte microbelletjes Destruction (UTMD) kan worden gebruikt om site-specifieke levering van bioactieve moleculen, waaronder therapeutische genen direct, hun organen toegankelijk is voor echografie, zoals het hart en de lever doel
Abstract
In UTMD, bioactieve moleculen, zoals negatief geladen plasmide DNA vectoren die coderen voor een gen van interesse, worden toegevoegd aan de kationische schelpen van lipide microbellen contrastmiddelen 7-9. Bij muizen deze vector-dragende microbellen kan intraveneus of direct worden toegediend aan de linker ventrikel van het hart. In grotere dieren die ze kunnen ook worden toegediend via een katheter intracoronaire. De nalevering uit de circulatie tot een doelorgaan vindt plaats door akoestische cavitatie op een resonantiefrequentie van de microbellen. Het lijkt waarschijnlijk dat de mechanische energie opgewekt door de microbellen vernieling leidt voorbijgaande porie formatie in of tussen de endotheelcellen van de microvasculatuur van de beoogde regio 10. Als gevolg van deze sonoporatie effect, is de transfectie-efficiëntie in en over de endotheelcellen verbeterd en transgen-coderende vectoren worden gestort in het omliggende weefsel. Plasmide DNA dat in de circulatie wordt snel afgebroken door nucleasen in het bloed, die verder de kans van de levering reduceert tot niet-gesoniceerd weefsels en leidt tot zeer specifieke target-orgaan transfectie.
Protocol
1. Microbellen voorraad voorbereiding
- In 10 ml van PBS mix 200 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine en 50 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylethanolamine met 1 g glucose.
- Verwarm het mengsel in bad met kokend water 20-30 minuten, pipet mengen om de 5 minuten.
- De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
2. Microbellen Voorbereiding
- Neem een 250 ul van de bereide microbellen voorraad-oplossing en incubeer bij 40 ° C gedurende 15 minuten.
- De voorverwarmde microbelletjes oplossing wordt vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml microbuisjes die 50 ul van glycerol.
- 1-2 mg gezuiverd plasmide DNA dat codeert voor een expressie-construct voor het gen van interesse (gezuiverd in dit voorbeeld door Qiagen Endotoxine gratis MegaPrep kit, Qiagen, Germantown, MD, met een optimale concentratie van 4mg/ml). 2.4) Fosfaat-gebufferde zoutoplossing wordt toegevoegd aan een eindvolume van 500 pi. Endotoxine vrij Qiagen maxipreps worden gebruikt, evenals steriele PBS om steriliteit te garanderen.
- De lucht in de microbuisjes wordt dan vervangen door Octafluoropropane gas.
- De microbuisjes wordt vervolgens krachtig geschud in een tandheelkundige amalgamator gedurende 20 seconden.
- De subnatant die resten van DNA en buffer die niet is gebonden aan de microbellen wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd en de microbelletjes laag is drie keer gewassen met steriel PBS tot losse DNA te verwijderen, en op ijs geplaatst tussen elke wasbeurt. We meestal het bereiken van een bindend rendement van 30-40%. Alle reagentia zijn steriel en zorg is gemaakt om besmetting te minimaliseren.
- Het plasmide DNA-gebonden microbolletjes worden dan geplaatst op ijs gedurende maximaal twee uur tot gebruik.
- De subnatant verwijderd van de microbuisjes na het mengen en de PBS wast, kan worden gebruikt om de concentratie van niet-gebonden DNA, en eveneens verbonden het bedrag gebaseerd op de bekende beginconcentratie te bepalen, door het meten van de optische dichtheid van deze oplossing bij een golflengte van 260nm met behulp van een spectrofotometer.
3. Kalibratie-apparatuur
- Voorafgaand aan het eerste gebruik, een 1 MHz cavitatie transducer moet gekalibreerd worden om een goede mechanische index en pols herhaling te verzekeren. Een submergible 1 MHz, 13mm, ongerichte transducer is verbonden met een 20 MHz Functie / Arbitrary Waveform Generator door middel van een eindversterker.
- De transducer is geplaatst in een plastic container vol water, direct gericht op een hydrofoon, die is op een 500 MHz oscilloscoop aangesloten via een heffing versterker.
- Golfvorm, frequentie, amplitude, burst cyclus, en de kracht versterking allemaal worden aangepast aan de juiste duty cycle en mechanische index optimaal zijn om de microbellen caviteren te verkrijgen. Voor dit bijzondere experiment, hebben we gekalibreerd het systeem een mechanische index gelijk aan ~ 1,3 bij 1 MHz.
4. Microbellen Levering & UTMD
- Voorafgaand aan de levering en microbellen UTMD, C57BL / 6 muizen werden verdoofd met 100mg/kg ketamine en xylazine 5mg/kg door middel van IP-injectie.
- Microbellen aflevering werd intraveneus toegediend via een directe injectie in de linker ventrikel van het hart of door staartader katheterisatie. Voor de directe cardiale injectie wordt een volume tot 100 ul van het plasmide DNA-loaded microbellen oplossing ingespoten via een naald van 30 gauge ingevoegd op de voorste 4e intercostale ruimte onder ultrasone visualisatie in de linker ventrikel van het hart.
- De microbellen oplossing bolus als gevolg van de linker interventriculaire injectie wordt gevisualiseerd met behulp van Visual Sonics '38 MHz hoge frequentie ultrasoon transducer geplaatst in een stilstaande positie op de borstkas van de muis in een lange-as bekijken met behulp van VisualSonics' Vevo 2100 Imaging System. Alle spuiten en naalden zijn steriel, het verzekeren van de meest steriele omgeving mogelijk voor deze injecties.
- Onmiddellijk na de injectie, is microbellen vernietiging uitgevoerd voor ~ 5 minuten met een tweede, kleinere lage frequentie 1,0 MHz transducer hield direct over de gewenste orgaan, gericht op vernietiging van deze regio. In dit voorbeeld werd de echografie toegediend aan de lever, bij een pulsherhalingsfrequentie van 1,0 MHz, met een mechanische index gelijk aan ongeveer 1.3-1.5, en pols herhaling periode van 100 ms voor elke 20 cycli. Als alternatief kan de pols worden gated aan de ECG van de muis (niet getoond in dit experiment) om een uitbarsting van drie frames van ultrasound, elke 4-6 cardiale cycli. We krijgen een grotere efficiëntie van de transfectie met protocollen die de capillaire bed te laten vullen met bubbels tussen de uitbarstingen van echografie.
5. Alternatief Levering Wijze
We hebben ervoor gekozen om de interventriculaire injectie te wijten aan de complexiteit van de procedure te markeren, maar in veel gevallen, zoals langdurige infusie van microbellen, een staart ader inprojectie is de voorkeur. Voor de staart-ader methode van microbellen levering, de muis is verdoofd op dezelfde manier. Een spuit met het plasmide DNA-gebonden microbellen is aangesloten op een 27 gauge naald / staartader katheter. De staart ader katheter wordt ingebracht in het distale derde deel van zowel de rechter of linker laterale aderen die langs de staart van de muis. De spuit met de microluchtbelletjes is geplaatst in een infusiepomp die automatisch beheert een uniform ingestelde volume van de oplossing gedurende een vooraf ingestelde tijd. We meestal trekken 200-300μl met een snelheid van 3ml/hour.
Gebruik van dieren
Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met goede dieren praktijk zoals gedefinieerd door de relevante nationale en / of lokale dierenwelzijn lichamen, en alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de bevoegde commissie (Universiteit van Hawaii Institutional Animal Care en gebruik Comite, goedkeuring nummer 07-100 -3). Geschikte anesthesie (ketamine / zylazine) werd gebruikt en analgetica (Bupivicaine en Buprenorfine) beschikbaar waren, maar niet vereist.
6. Representatieve resultaten:
De effectiviteit van de UTMD-gemedieerde plasmide DNA levering kan worden geëvalueerd door middel van een verscheidenheid van methoden, afhankelijk van de genen gecodeerd in het construct, zoals, maar niet beperkt tot, luciferase in vivo beeldvorming, B-gal ex vivo kleuring, en / of immunohistology. In het bijzonder in vivo bioluminescentie beeldvorming maakt het mogelijk om te controleren op de aanwezigheid en de duur van genexpressie in serie in muizen getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor een bioluminescente reportergen (luciferase). De Xenogen In vivo Imaging System (IVIS) (Remklauw Life Sciences, Hopkinton, MA) wordt gebruikt voor bioluminescente beeldvorming. Foto's zijn meestal gemaakt van alle muizen de eerste dag na UTMD gemedieerde transfectie en wordt herhaald om de drie tot vier dagen tot bioluminescente genexpressie is niet meer visueel waarneembaar door middel van het systeem (figuur 1). Ter voorbereiding muizen voor bioluminescente beeldvorming, muizen krijgen eerst een IP-injectie van de luciferase reporter probe D-luciferine (Remklauw Life Sciences) en worden dan verdoofd ~ 3 minuten later. Biodistributie van de D-luciferin substraat is toegestaan om door te gaan voor ~ 10 minuten voordat het dier is geplaatst in de IVIS beeldvorming kamer en een full body scan foto wordt genomen. Tijdens de overname worden de fotonen van de vuurvlieg luciferase / D-luciferine fotochemische reactie gemeten. Figuur 1 illustreert ook soortgelijke IVIS bioluminescente beeldvorming van de lever na UTMD, en Figuur 2 is een epifluorescentie (100X) beeld van de getransfecteerde lever met behulp van een anti-luciferase primaire antilichaam (Sigma-Aldrich) en AlexFluor-568 geconjugeerd secundair antilichaam (Invitrogen) . Het is duidelijk te zien dat de UTMD bemiddelde transfectie lever heeft niet alleen de endotheelcellen aangetast, maar de hepatocyes ook.
Figuur 1 Xenogen / IVIS beeldvorming van hart-UTMD behandelde muizen (A) Negatieve controle Muis:.. Plasmide + PBS gevolgd door hart-gerichte UTMD, (B) Behandeling Muis: Plasmide + Microbelletjes, gevolgd door hart-gerichte UTMD, en (C) Behandeling Mouse : Plasmide + Microbelletjes, gevolgd door de lever gericht UTMD.
Figuur 2. Immunohistochemie van de lever UTMD (anti-luciferase in rood). (A) Plasmide zonder UTMD, en (B) Plasmide met UTMD. Confocale beeld (100X); kernen zijn DAPI blauw gekleurd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UTMD vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor gen-levering. Als een platform technologie kan worden gecombineerd met een van de vele mogelijke gentherapie-strategieën, om een groot aantal bioactieve moleculen bij een hoge mate van weefsel specificiteit gewenst is te leveren. De belangrijkste biologische beperking van de techniek is de lage efficiëntie van transfectie. Een andere belangrijke overweging is de toegankelijkheid van de doelorgaan aan echografie, die duidelijk kan worden verminderd door in te grijpen bot of lucht. De techniek vereist optimalisatie van de techniek gebaseerd op doelweefsel 11, evenals een basiskennis van akoestiek, te beperken beschadiging van het weefsel 11 en de efficiëntie te verhogen. Maar het biedt een goedkope, snelle, en herhaalbare benadering van de evaluatie van het effect van weefsel-specifieke transgenexpressie en kunnen een doeltreffende therapie te leveren voor stoornissen waarbij de lage niveaus van transgenexpressie nuttig zou kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Subsidies heeft opgenomen NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, en een AHA National Grant-in Aid Award (voor RVS). Een speciaal woord van dank is uitgebreid tot de afstand Course Design and Consulting (DCDC) groep, dcdcgroup.org, voor hun hulp met video productie en het Amerikaanse Ministerie van Onderwijs Grant Nee P336C050047 dat de DCDC opgericht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich | P-5911 | component of the microbubble lipid shell |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine | Sigma-Aldrich | P-3275 | component of the microbubble lipid shell |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | thought to stabilize the microbubbles |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | believed to prevent microbubbles from coalescing |
| Octafluoropropane gas | Airgas | N/A | inert gas used in clinical applications |
| VialMix dental amalgamator | Bristol-Myers Squibb | N/A | |
| 1 MHz, 13mm, unfocused transducer | Olympus Corporation | A303S-SU | |
| 20 MHz Function/Arbitrary Waveform Generator | Agilent Technologies | 33220A | |
| Power Amplifier | Krohn-Hite Co. | Model 7500 | |
| Hydrophone | Bruel and Kjaer | Type 1803 | |
| Charge Amplifier | Bruel and Kjaer | Type 2634 | |
| 500 MHz Oscilloscope | LeCroy | 9354L | |
| VisualSonics’ Vevo 2100 Imaging System with 34 MHz transducer | VisualSonics, inc. | 2100 | |
| 27G one inch tail vein catheters | VisualSonics, inc. | N/A | |
| Genie Plus infusion pump | Kent Scientific | GENIE |
References
- Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation. 108, 1022-1026 (2003).
- Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications. Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).
- Chen, S. Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy. Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).
- Miao, C. H. Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid. Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).
- Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver. Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).
- Shohet, R. V. Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium. Circulation. 101, 2554-2556 (2000).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).
- Li, H. L. Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo. Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Newman, C. M., Bettinger, T. Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 14, 465-475 (2007).
- Vancraeynest, D. Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia. Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).
