Summary
الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.
Abstract
يمكن للأحداث في وقت مبكر من التفاعل بين الفيروس والخلية لها تأثير عميق على نتيجة العدوى. ويمكن تحديد العوامل التي تؤثر على هذا التفاعل يؤدي إلى تحسين فهم المرض والتسبب بالتالي التأثير على تصميم أو لقاح علاجي. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل لتحقيق هذا التفاعل مفيدا. ويمكن استغلال التطورات الأخيرة في التنمية fluorophores 1-3 و تكنولوجيا التصوير 4 إلى تحسين معرفتنا الحالية على المرضية بحمى الضنك ، وبالتالي تمهيد الطريق للحد من الملايين من الإصابات بحمى الضنك التي تحدث سنويا.
فيروس حمى الضنك يلفها له سقالة الخارجية التي تتكون من dimers المغلف 90 (E) بروتين سكري حماية قذيفة nucleocapsid ، الذي يحتوي على حبلا واحدة إيجابية رنا الجينوم 5. وبالتالي يمكن أن مفارز متطابقة البروتين على سطح الفيروس يكون المسمى مع صبغة an رد الفعل من خلال تصور وأمين المجهري مناعي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لوضع العلامات لفيروس حمى الضنك مع اليكسا فلور succinimidyl استر الصبغة الذائبة مباشرة في بيكربونات الصوديوم العازلة التي أسفرت عن الفيروس مجدية للغاية بعد وضع العلامات. لا توجد إجراءات موحدة لوضع العلامات على فيروسات حية والبروتوكول الصانع القائمة لوضع العلامات البروتين وعادة ما يتطلب إعادة تشكيل الصبغة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. وجود ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، حتى بكميات صغيرة ، يمكن منع العدوى من فيروس الإنتاجية وتحفز أيضا السمسة 6 خلايا. استبعاد استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل في هذا البروتوكول وبالتالي تقليل هذا الاحتمال. الكسا الأصباغ فلور وصمود للضوء متفوقة ودرجة الحموضة أقل حساسة من الأصباغ المشتركة ، مثل فلوريسئين ورودامين 2 ، مما يجعلها مثالية لإجراء دراسات عن امتصاص الخلوية والنقل endosomal الفيروس. لم اقتران اليكسا فلور صبغة لا يؤثر على الاعتراف الفيروس المسمى بفيروس حمى الضنك ، ومستقبلات محددة الأضداد المفترضة لها في الخلايا المضيفة 7. هذا الأسلوب يمكن أن تكون لها تطبيقات مفيدة في الدراسات الفيروسية.
Protocol
1. الكسا فلور توسيم فيروس حمى الضنك
- رد الفعل قبل وضع العلامات ، وتنقية فيروس حمى الضنك مع وسادة السكروز وتحضير الكواشف والمعدات اللازمة كما هو مبين في البروتوكول.
- اعداد جديدة بيكربونات الصوديوم 0.2M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.5 (الوسم العازلة) ، وهيدروكسيل 1.5M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.3 (وقف كاشف) ، قبل وضع العلامات وتصفية تعقيم المحاقن مع مرشحات 0.2μm.
- تمييع وحدات اللوحة حوالي 8 تشكيل 3x10 (pfu) من فيروس حمى الضنك في تنقية 1ml وضع العلامات الفاصلة في أنبوب 2ml. يمكن تحجيم هذا الأمر نسبيا لوضع العلامات دفعة من الفيروس.
- إعادة تشكيل مجفد اليكسا فلور 594 (AF594) استرات succinimidyl ل1MM العازلة في وضع العلامات على الفور رد فعل من قبل لوضع العلامات. ويمكن استخدام fluorochromes أخرى من سلسلة اليكسا صبغ فلور وفقا لاحتياجات واحد. تقليل التعرض للضوء من هذه الخطوة فصاعدا.
- إضافة 100μl الصبغة AF594 1MM للفيروس مخفف مع التحريك بلطف مع طرف ماصة.
- احتضان مزيج التفاعل العلامات في درجة حرارة الغرفة ل1hr في الظلام. مزيج لطيف من قبل كل ظاهرة الانقلاب 15mins.
- وتدور في فترة وجيزة في أنبوب جهاز طرد مركزي منضدية وإضافة 100μl من كاشف وقف إلى مزيج التفاعل مع التحريك بلطف مع طرف ماصة.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إضافية في الظلام. مزيج لطيف من قبل كل ظاهرة الانقلاب 15mins.
2. المسمى تنقية فيروس حمى الضنك اليكسا فلور
- في غضون ذلك ، تتوازن مع العمود تنقية العازلة في الاختيار. في هذه التجربة ، عمود PD - 10 غير المتوازنة مع 25ml من HNE العازلة (Hepes 5mm ، و 150mM كلوريد الصوديوم ، 0.1mM EDTA) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، قبل الاستخدام.
- ينطبق هذا الفيروس المسمى إلى أعلى العمود والبدء في جمع من خلال تدفق مرة يدخل الفيروس المسمى المصفوفة. ملء العمود مع العازلة HNE مرة واحدة فقط عن الفيروس المسمى دخلت المصفوفة. تجاهل 2.5ml الأولى من خلال تدفق وجمع 2ml القادم من الفيروس المسمى الكسر.
- قسامة تنقية وتخزين AF594 فيروس حمى الضنك في المسمى -80 درجة مئوية ، بعيدا عن مصدر الضوء.
- أذاب one قسامة وتحديد عيار من الفيروس المسمى بواسطة فحص اللوحة قبل استخدام دفعة من الفيروس المسمى.
- البذور 5x10 4 في خلايا فيرو جيدا ، ونمت في M - 199 متوسطة النمو ، في صفيحة 4 - جيدا مع ساترة على الجزء السفلي من يوم جيدا قبل العدوى.
- إزالة طاف الثقافة بشكل جيد وتصيب الخلايا مع تعدد الإصابة 1 من الفيروس المسمى في حجم 100μl (مخفف في M - 199 متوسطة الصيانة على النحو المطلوب) ل10min عند 37 درجة مئوية.
- إزالة اللقاح ، ويغسل مرتين في coverslips 1xPBS.
- إصلاح الخلايا في paraformalydehyde 3 ٪ لل30mins.
- غسل coverslips 3 مرات في 1xPBS.
- Permeabilize الخلايا بمحلول يحتوي سابونين permeabilization 0.1 ٪ و 5 ٪ في جيش صرب البوسنة ل1xPBS 30mins.
- احتضان الخلايا مع مخفف الطرد المركزي ، أوضح طاف من 3H5 ضد وحيد النسيلة للثقافة ورم هجين 1hr في غرفة رطبة ، محمية من الضوء.
- غسل coverslips 3 مرات في غسل العازلة (1xPBS تحتوي على كلوريد الكالسيوم 1MM ، 1MM كلوريد المغنيسيوم و 0.1 سابونين ٪).
- احتضان الخلايا مع AF488 مفتش الأضداد المضادة للماوس ، 1:100 مخففة في حل permeabilization ، ل45mins في غرفة رطبة ، محمية من الضوء.
- غسل coverslips 3 مرات في غسل وشطف العازلة مرة واحدة في الماء منزوع الأيونات.
- الداب حافة ساترة ضد منشفة ورقية لتجفيف المياه الزائدة وجبل على لشريحة زجاجية مع 8μl Mowiol Dabco تحتوي على 4-88 2.5 ٪.
- السماح للمتصاعدة لوضع حل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية قبل عرض باستخدام مجهر زايس مبائر. يجب أن يتم تنفيذ عمليات الاستحواذ متتابعة مثيرة one fluorophore في وقت واحد والتبديل بين كشف في نفس الوقت.
- ثم يتم تحليل الصور لتوطين المشارك للجسم تلطيخ E البروتين مع الفيروس المسمى باستخدام برنامج LSM زايس زن لتقدير درجة التوسيم.
3. ممثل النتائج
ويرد مثال العائد من فيروس حمى الضنك المسمى مع AF594 صبغ في الشكل 2. عادة ، يجب أن تراعى أقل من 10 أضعاف قطرة من عيار الأولية التالية العلامات الناجحة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن جميع المخازن يجب أن تكون على استعداد لوضع العلامات الجديدة لتكون ناجحة ، وينبغي أن تستخدم فلور اليكسا استرات succinimidyl فور إعادة كما يتحلل إلى أحماض مجانا متأخرا في المحاليل المائية 8.
المقبل ، وهو الفيروس المسمى لابد من التحقق من مضان كافية قبل استخدامها في التجارب. وأجري الفحص المناعي على خلايا فيرو بسيطة ويمكن تقدير درجة من العلامات المشتركة لتوطين الفيروس المسمى مع E المضادة للبروتين تلوين الأجسام المضادة. قطعتم فحص خلايا القاعدة وتظهر صورة نموذجية مبائر في الشكل 3. شارك في توطين تحليل الصور باستخدام برنامج LSM زن أظهرت معاملات تداخل تتراوح ،65-0،8 ، مما يوحي بأن وصفت ما يقرب من 65 إلى 80 ٪ من virions مع الصبغة.
الرقم 1.Overall مخطط تصور وضع العلامات اليكسا صبغ فلور الداخلي فيروس حمى الضنك ، أولا ، على استعداد للمخازن ذات الصلة ، وتنقية فيروس حمى الضنك. وأعادت فلور اليكسا الأصباغ وإضافة إلى فيروس حمى الضنك مخففة في وضع العلامات العازلة. ثم توقفت ردود الفعل في وقت لاحق 1 ساعة مع إضافة كاشف تتوقف. بعد ذلك ، يتم تنقية الفيروس المسمى من خلال استبعاد حجم العمود لإزالة الصبغة الحرة. أخيرا ، هو الفيروس المسمى إعادة معاير التي مقايسة البلاك واختبارها لمضان.
الشكل 2. يعني عدد virions قابلة للحياة (pfu / مل) كما هو محدد على لوحة فحص قبل وبعد وضع العلامات AF594. إذابة هو أحد قسامة من الفيروس المسمى AF594 الضنك وإعادة معاير تلو فحص اللوحة وهذا يظهر عادة أقل من 10 أضعاف من الانخفاض من عيار البداية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري التكرارات.
الشكل 3. أصيب شارك في توطين AF594 التسميات مع بروتينات فيروس حمى الضنك E في خلايا فيرو. coverslips الخلايا المزروعة في اليوم السابق مع AF594 الدنج في وزارة الداخلية المسمى من 1 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وثبتت لاحقا إلى خلايا والمسمى مع E المضادة للأجسام المضادة ، ودرست لcolocalization من البروتين E (الأخضر) ، ووضع العلامات AF594 (الحمراء). وكانت إشارات تصور الفلورية تحت التكبير 63X باستخدام مجهر زايس LSM 710 مبائر. شريط المقياس 10μm. الأصفر تشير مجالات colocalization ، كما هو موضح في أقحم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن استخدام صبغة AF594 في هذا التقرير ، مجموعة واسعة من fluorophores في سلسلة فلور اليكسا استرات succinimidyl يتوفر مع العلامات الكيمياء مماثلة. ويمكن توسيع نطاق تطبيق هذا الوسم خارج التصوير. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي كبديل للمبائر المجهري لتقدير درجة لوسم fluorophores التي يمكن الكشف عنها بواسطة متحمس والجهاز FACS.
الكسا الأصباغ فلور هي عبارة عن جزيئات صغيرة تتفاعل مع المجموعات الأمينية الحرة ، في المقام الأول وأرجينين يسين 9 ، وعادة ما تواجه الخارج بقايا البروتينات. في الاقتران لدينا ، ومختبر لفيروس حمى الضنك مع 100μM من 594 اليكسا صبغ فلور قدمت سطوع كافية للتصوير مع فقدان الحد الادنى في عيار الفيروسية. ويمكن تحقيق سطوع مختلفة بدرجات تركيز الصبغة المستخدمة. ومع ذلك ، يمكن زيادة تركيز الصبغة تقليل قابلية الفيروس 7،10. واحد ممكن هو الحد من التدخل في مستقبلات ملزمة بسبب الحصار المفروض على وصول fluorophores. ولذلك ، اعتمادا على التطبيق ، ينبغي تحديد المستوى الأمثل لوضع العلامات لضمان وجود توازن بين درجة ووضع العلامات abrogation10 الوظيفية. هل لاحظ أنه يمكن أيضا أن يكون هناك تركيز المتضررة من التفاعل بعد التغليف من استرات اليكسا succinimidyl فلور 8.
وسم مباشرة لفيروس حمى الضنك مع اليكسا فلور صبغ المعروضة هنا لا تتطلب أية خطوات إضافية لوضع العلامات تصور الفيروس ، وبالتالي إزالة إمكانية غير محدد من الأجسام المضادة للفيروسات تلطيخ غير المباشرة. كما يسمح في الوقت الحقيقي تتبع في مرحلة ما بعد استيعاب الأحداث في تصوير الخلايا الحية. هذا الأسلوب هو بسيط نسبيا ، ولأن الاقتران غير مستقرة ، ويمكن استخدامه لانتاج وتخزين الدفعة التي تحمل علامات الفيروس لتجارب متعددة بدلا من الأصباغ الفلورية lipophillic ، مثل سلسلة طويلة carbocyanine1 dioctadecyl ،1 - 3 ، 3 ، 3،3 - tetramethylindodicarbocyanine (هل) أو styryl الأصباغ ، والتي لا يمكن تخزينها في العراء لأكثر من 3 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، وسنغافورة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
