Summary
En metod för foto-inkapsling av celler i en tvärbunden PEG hydrogel beskrivs. Hypoxiska signalering inom inkapslade murina insulinoma (MIN6) aggregat är spåras med hjälp av en fluorescerande markör system. Detta system möjliggör seriell undersökning av celler i en hydrogel klätterställning och korrelation av hypoxiska signalering med förändringar i cellernas fenotyp.
Abstract
I Diabetes mellitus typ 1, autoimmun destruktion av bukspottkörtelns β-celler resulterar i förlust av insulinproduktionen och potentiellt dödliga hyperglykemi. Som ett alternativ behandling alternativ för att tillföra insulin injektion måste transplantation av funktionella bukspottkörtelns vävnad undersökts 1,2. Detta tillvägagångssätt ger löfte om en mer naturlig och långsiktig restaurering av normoglycemia. Skydd av givare vävnad från värdens immunsystem krävs för att förhindra avstötning och inkapsling är en metod som används för att bidra till att uppnå detta mål.
Biologiskt framställda material såsom alginat 3 och agaros 4, har varit det traditionella valet för kapsel konstruktion men kan framkalla inflammation eller fibrotiska överväxt fem som kan hindra näringsämnen och syre transport. Alternativt, syntetiska poly (etylenglykol) (PEG)-baserade hydrogeler är icke-kränkande, lätt functionalized, som finns på hög renhet,har kontrollerbar porstorlek, och är mycket biokompatibla, 6,7,8. Som en ytterligare fördel, får PEG hydrogeler bildas snabbt i en enkel foto-crosslinking reaktion som inte kräver användning av icke-fysiologiska temperaturer 6,7. Ett sådant förfarande beskrivs här. I crosslinking reaktion UV-nedbrytning av fotoinitiator, 1 - [4 - (2-hydroxietoxi)-fenyl]-2-hydroxi-2-metyl-1-propan-1-en (Irgacure 2959), producerar fria radikaler som angriper vinyl kol-kol dubbelbindningar i dimethacrylated PEG (PEGDM) inducerande crosslinking på kedjans ändar. Crosslinking kan uppnås inom 10 minuter. PEG hydrogeler konstruerade på ett sådant sätt har visat sig gynnsamt stödjeceller 7,9, och den låga fotoinitiator koncentration och kortvarig exponering för UV-strålning inte är skadligt för livskraft och funktion av inkapslade vävnaden 10. Medan vi metakrylat våra PEG den metod som beskrivs nedan kan PEGDM också dirrekt köps från leverantörer som Sigma.
En naturlig konsekvens av inkapsling är isolering av celler från en vaskulär nätverk. Tillförsel av näringsämnen, särskilt syre, därför minskas och begränsas av diffusion. Detta minskade syre tillgänglighet kan framför allt påverka β-celler vars insulin sekretoriska funktion är starkt beroende av syrgas 11-13. Kapsel sammansättning och geometri kommer också att påverka spridning priser och längder för syre. Därför beskriver vi också en teknik för att identifiera hypoxiska celler inom vår PEG kapslar. Infektion i celler med rekombinant adenovirus tillåter en fluorescerande signal som skall produceras när intracellulär hypoxi-inducerbara faktorer (HIF) vägar aktiveras 14. Som HIFs är den primära tillsynsmyndigheter om de transkriptionell svar på hypoxi, utgör de ett perfekt mål markör för detektion av hypoxisk signalering 15. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel och snabb upptäckt av hypoxiC celler. Kortfattat har adenovirus sekvensen för ett rött fluorescerande protein (Ds Red Dubbelrum från Clontech) under kontroll av en hypoxi-känslig element (HRE) trimerer. Stabilisering av HIF-1 av låga syreförhållanden kommer att driva transkription av det fluorescerande protein (Figur 1). Ytterligare detaljer om byggandet av detta virus har publicerats tidigare 15. Viruset sparas i 10% glycerol vid -80 ° C så många 150 mikroliter portioner i 1,5 tuber ml centrifugera vid en koncentration av 3,4 x 10 10 PFU / mL.
Tidigare studier i vårt labb har visat att MIN6 celler inkapslade som aggregat bibehålla sin livskraft i hela 4 veckor kultur i 20% syre. MIN6 aggregat odlade på 2 eller 1% syre visade båda tecken på nekrotiska celler (fortfarande ca 85-90% viabla) genom färgning med etidiumbromid samt morfologiska förändringar i förhållande till celler i 20% syre. Den släta sfäriska formen av aggregaten visas på 20% var lost och aggregat verkade mer som oorganiserad grupp av celler. Medan låga syre stressen inte orsakar en markant nedgång i lönsamheten, är det påverkar helt klart MIN6 aggregering och funktion mätt med glukos-stimulerad insulinsekretion 15. Western blot analys av inkapslade celler i 20% och 1% syre visade också en betydande ökning av HIF-1α för cellerna odlas i låga syreförhållanden som korrelerar till uttryck av DsRed DR protein.
Protocol
1. PEGDM syntes och fotoaktiva PEGDM macromer beredning av lösningar
- Väg 2g av PEG (linjär, 10.000 Da) till en 40 ml glasflaska med en hård plast.
- Tillsätt ungefär 308μL av metakrylsyra anhydrid och löst lock på flaskan.
- Mikrovågsugn flaskan på hög i 2 minuter i en vanlig inhemsk mikrovågsugn. Bära värmebeständiga handskar, grundligt virvel flaskan, sedan mikrovågsugn på hög i ytterligare 5 minuter.
- Kortfattat Låt injektionsflaskan tillräckligt svalt för att hanteras med handskar. Ta bort skyddet den och långsamt lägga metylenklorid medan virvlande flaskan. Lägg till nog så att lösningen verkar klar och homogen, vortexa det prov som behövs. Den totala volymen av metylen används klorid bör vara 1,5 - 2 ml.
- Fällning PEGDM i 200 ml kallt, rörs dietyleter genom att lägga till lösningen droppvis.
- Samla PEGDM med vakuum filtrering och låt det torka.
- Lös PEGDM i en tillräcklig mängdavjoniserat vatten (vanligtvis 100 -150 ml).
- Dialyze lösningen mot avjoniserat vatten under 5 dagar i dialys slang med en molekylvikt cut-off 1000 Da. Byt vatten en gång dagligen.
- Alikvotera lösningen i lämpliga behållare och frys vid -80 ° C över natten. Lyophilize lösningen för 4 dagar för att ge en renad vit PEGDM pulver. Förvara pulvret vid 4 ° C när den inte används.
- För att bereda en lösning fotoaktiva PEGDM, bered först en 0,5 viktprocent lösning fotoinitiator lager genom att lösa Irgacure 2959 i avjoniserat vatten. Vortex lösningen och förvara den i mörkret.
- Förbered en 10 wt% PEGDM och 0,025 vikt% Irgacure 2959 lösning Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Vortex noggrant för att säkerställa upplösning av PEGDM. Vi förbereder vanligtvis 1 mL av denna lösning i taget.
- Sterilisera lösningen genom att filtrera den genom ett 0,2 ìm spruta filter till en 1,8 mL mikrocentrifugrör. Linda röret i aluminiumfolieoch förvara vid 4 ° C
2. Kultur, infektion, och aggregering av MIN6 celler
- MIN6 cellerna odlas i RPMI 1640 mediet kompletteras med 10% FBS, 7mm glukos, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin och 0,5 mikrogram / ml amphotercin B i en fuktig miljö vid 37 ° C och 5% CO 2.
- För att frigöra celler från det behandlade kultur kolven yta, aspirera mediet, skölj cellerna med 37 ° C kalcium / magnesium-fri HBSS, aspirera HBSS, tillsätt sedan 2 ml 37 ° C trypsin-EDTA-lösning och låt cellerna till inkubera i 3 minuter.
- Ordentligt burk på sidan av kolven för att slå cellerna fria, lägg sedan till 8 ml 37 ° C medium och kraftfullt pipett cellsuspensionen upp och ner noga med att inte införa bubblor.
- Pipettera cellerna i en steril 15 ml centrifugrör och utföra ett celltal med hjälp av en hemocytometer eller annan cell räknar förfarande.
- Vid utarbetandet av att infektera celler med tillverkarenvirus, först bestämma det totala antalet celler som skall smittas och beräkna volymen av virussuspension krävs för att uppnå den önskade mångfalden av infektion (MOI) (50 till 100 infektiösa partiklar per cell).
- Späd viruset i HBSS genom att försiktigt pipeting rätt mängd virussuspension i en pre-alikvoteras volym HBSS i ett 1,8 ml mikrocentrifugrör. 50 mikroliter av HBSS per brunn sammanställa celler som är lämplig.
- Skingra cellerna genom pipeting dem upp och ner i sina rör och sedan pipettera nödvändig volym för att nå 400 tusen celler per brunn i brunnarna i en 6-bra fjädring kultur plattan.
- Tillsätt en lämplig mängd utspädd virus i varje brunn för att uppnå önskad MOI.
- Lägg i varje brunn för att få den totala volymen upp till 1,7 ml.
- Placera plattan på en skakapparat inne i inkubatorn. Ställ shaker på en låg inställning så att mediet försiktigt tvättar runt brunnarna (~ 100 rpm). Låt cellerna att aggregaTe för 24-36 timmar. Aggregat med en ungefärlig diameter på 75-175 ìm bör bildas.
3. Inkapsling av celler i PEGDM
- Celler kan vara inkapslad som en dispersion (steg 2,4) eller efter aggregering (steg 2,10). Eftersom hydrogelen föregångaren PEGDM lösning är en vätska, får cellerna tenderar att bosätta sig före crosslinking och hydrogel formation. Om lösa förväntas ske snabbt, exempelvis med större aggregat, kan det vara fördelaktigt att producera hydrogelen i två steg så att cellerna lösa till en central plan av gelen. Ett enda steg hydrogel syntes sätt lämpliga för spridda celler visas (Figur 2) och två steg visas också (Figur 3) och nedan (3,2-3,9).
- Skapa ett fartyg på vilket hydrogelen bildas genom att skära den koniska spetsen bort av en 1 ml plastspruta och placera den öppna änden i ett rack.
- Pipettera 20 mikroliter av fotoaktiva PEGDM såföroreningarna i den öppna änden av sprutan till kolven och se till att volymen täcker hela kolven ytan. Ställ kolven i små steg för att uppnå en platt vätska yta.
- Placera pipettera i racket och position i racket under en UV-lampa (365nm, ~ 7 mW / cm 2) i ca 8 minuter att möjliggöra hydrogel crosslinking. Under denna tid får beredningen av cellerna börjat
- Pipettera en volym som innehåller önskat antal celler / aggregat i ett 1,8 ml mikrocentrifugrör, mössa, och centrifugera röret vid 130 gi 5 minuter.
- Med hjälp av en mikropipett, försiktigt ta bort materialet utan att störa cellpelleten på toppen av röret. Eftersom medierna huvudet närmar sig pellets, kan det vara bra att använda ett finare, 10 mikroliter pipettspetsen.
- Försiktigt resuspendera cellpelleten i 20 mikroliter av fotoaktiva PEGDM lösning (använd en bred öppning pipettspetsen om att arbeta med aggregat) och tillsätt cellsuspension på sprutan på toppen av the tvärbundet tidigare hydrogel portion.
- Exponera sprutan ytterligare 8 minuter av UV-ljus för att färdigställa bygget av hydrogel. När du är klar bör de celler vara helt inkapslat i den cylindriska hydrogelen (Figur 3).
- Mata hydrogelen från sprutan och in i 1 mL av HBSS i brunnen på en 24-brunnar att kortfattat tvätta gel. Överför gelen till 1 ml av media i brunnen av en 24-brunnar och kultur under önskvärda.
4. Hypoxi spårning
- När som helst under den kultur, bilden cellerna med fluorescerande mikroskopi för att spåra inledandet av hypoxisk signalering. Beroende på vad som avbildas kan du bilden i flera brunnar eller överföra gel till ett objektsglas innan placering på mikroskop scenen. Peak excitation av Ds Red uppnås vid 556nm och topp utsläpp sker vid 586nm. Emission är ganska intensiv och därmed fotoblekning har inte observerbaraED vara problematiskt. Fördröjning mellan initiering av protein produktion och första signalen upptäckt är cirka 12 timmar. Signalen är tillräckligt specifik för att identifiera enskilda signalering celler, men upplösningen kan vara otillräckliga för att avgöra intracellulära signal lokalisering. I signalering celler är signalen typiskt observeras enhetligt i hela cytoplasman. Signalstyrka kan också öka med förlängd exponering för hypoxi, även om vi ännu inte helt fastställt om det beror på ökad proteinuttryck, totalt protein ansamling eller fördröjd protein mognad.
5. Representativa resultat
Ett representativt exempel på MIN6 aggregat inkapslade i en PEG hydrogel visas i Figur 4. Den tvärbundet gel kommer vara fast under hela, med formen av fartyget i vilken reaktionen utfördes. En gel med släta yttre ytor är att föredra för implantation till stöd i förebyggandet av en främmande kropp igenRemissyttranden. Inom gelen, bör cellaggregat vara helt inneslutna i matrisen och homogent ut för att möjliggöra bättre näringsämne transporter.
Representant bilder av hypoxiska signalering i MIN6 aggregat är avbildade i figur 5. Identiska MIN6 aggregat smittade med markör viruset odlades i antingen 20% O 2 (5a) eller 1% O 2 (5b) i 44 timmar innan bildtagning.
Figur 1. Schematisk av aktiviteten i våra hypoxi märkningssystem. Adenovirala insättning av Ds röda DR-genen och uppströms HRE promotor möjliggör hypoxi-inducerad produktion av fluorescerande proteinet under kontroll av HIF-1.
Figur 2. Förfaranden flödesschema för den enskilt steg inkapsling av spridda MIN6 celler i ett sposslinked PEGDM hydrogel. För varje gel, är de spridda cellerna upphängd i 40μL av fotoaktiva PEGDM macromer lösning. Detta är placerad i en halshuggen 1 mL spruta och Hydrogelen bildas under 365nm UV-ljus efter 10-12 minuter. Efter avslutad, är hydrogelen disken tas bort från sprutan, tvättas och placeras i en medellång fylld brunnar för inkubation.
Figur 3. Förfaranden flödesschema för den dubbla steg inkapsling av aggregerade MIN6 celler i en tvärbunden PEGDM hydrogel. För varje gel är en halv-gel först bildas av UV-broarna i 20μL av fotoaktiva PEGDM macromer lösning för 8 minuter. MIN6 aggregat är noggrant suspenderade i en extra 20μL av fotoaktiva macromer lösning som läggs ovanpå den redan bildade halv-gel. Hela gel bildas med ytterligare 8 minuter av UV-exponering med aggregat helt inkapslade i den medialaplan av gelen.
Figur 4. Bild på en 40μL hydrogel i 20X förstoring. MIN6 aggregat (~ 400 tusen totalt celler) är tydligt i gelen. Hydrogel diameter är ca 6mm (bar = 1 mm).
Figur 5. Fluorescerande hypoxi signalering i aggregerad MIN6 celler i en PEGDM hydrogel. Celler som var inkapslade och sedan placeras i inkubation vid 20% O 2 för 44 timmar inte visar hypoxi signalering (a), medan celler som var inkapslade inkuberas därefter i 2% O 2 för 44 timmar display tydlig, allestädes närvarande signal. (Bar = 100μm) (b).
Discussion
Den metod som presenteras här ger en snabb och enkel teknik för cell inkapsling i en PEG hydrogel med minimal användning av icke-fysiologiska förhållanden. PEG är en mycket användbar inkapsling material för sin biokompatibilitet och enkel modifiering. Enkel variant av PEG procentsats i fotoaktiva lösning, till exempel, kan användas för att justera mekaniska egenskaper, såsom tryck-modul och egenskaper transport genom porstorlek. Dessutom är PEG lätt modifieras genom tillsats av sidokedjor. PEG hydrogeler därför är både en lovande klinisk enhet och en flexibel plattform för in vitro-forskning
En metod för spårning av hypoxi i PEG-inkapslade celler har också lagts fram. Denna metod är användbar för enkelheten i hypoxi upptäckt och för att undvika behovet av att offra cellerna av intresse. Tekniken kan tillämpas på en mängd olika typer av celler i en rad olika tillstånd att göra sina ossefulness bred. Till exempel kan hypoxi som en kö för stamceller differentiering spåras i micromass stamceller kulturer. Dock kan denna metod endast användas för att skingra cell-system eller system där spridda celler senare läggs samman. Dessutom kan detektion av fluorescerande signalen vara svårt i större eller tätare vävnader.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Tack vare Kristi Anseth labb vid University of Colorado, Boulder för generöst leverera MIN6 celler. Finansieringen för detta projekt har lämnats av NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
- Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery. 61, 827-837 (1967).
- Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation. N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).
- Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).
- Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation. Diabetes. 39, 224-225 (1989).
- Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts. Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).
- Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments. Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia. Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).
- Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system. J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).
- Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing. Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).
