הדמיה באמצעות המקרה גלמי של Published: January 23, 2014 doi: 10.3791/51239

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Mark B Keroles¹, Sonya K Dusseault¹, Chuchu Liu¹, Masood R Mohammed¹, Christy M Vadakkan¹, Jessica H Amiel¹, Samantha N Abel¹, Elena R Bensoussan¹, Benjamin L Russell¹, James Baker¹

¹Department of Biology, University of Miami

Summary

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

Abstract

השימוש ארוך השנים של דרוזופילה כמודל לתא וביולוגיה התפתחותית הניב מערך של כלים. יחד, בטכניקות אלה אפשרו ניתוח של תא וביולוגיה התפתחותית ממגוון רחב של זוויות מתודולוגי. הדמיה חיה היא שיטה המתעוררות להתבוננות בתהליכי תא דינמיים, כגון חלוקת תא או תנועתיות תא. לאחר שבודד מוטציות בחלבוני מחזור תא המשוערת uncharacterized זה הפך חיוני להתבונן מיטוזה באתרם באמצעות הדמיה לחיות. רוב מחקרי הדמיה לחיות בדרוזופילה התמקדו בשלבים העובריים, כי הם נגישים למניפולציה ותצפית בגלל הגודל הקטן שלהם והבהירות אופטית. עם זאת, בשלבים אלה את מחזור התא הוא יוצא דופן בכך שהוא חסר אחד או שני שלבי הפער. לעומת זאת, יש תאים של אגף גלמים של דרוזופילה מחזור תא טיפוסי ועוברים תקופה של מיטוזה המהירה פורש על 20 שעות של פיתוח גלמים. זה קל ליdentify ולבודד גלמים של השלב המתאים לתפוס מיטוזה באתרם. גלמים ללא פגע הרכבה סיפקו את השילוב הטוב ביותר של עקיבות ועמידות במהלך הדמיה, המאפשרים ניסויים לרוץ במשך כמה שעות עם השפעה מינימאלית על כדאיות תא ושל בעלי חיים. השיטה מאפשרת התבוננות בתכונות קטנה כמו, או קטן יותר, לעוף כרומוזומים. התאמה של הגדרות מיקרוסקופ ואת הפרטים של הרכבה, אפשרה הרחבה של ההכנה כדי להמחיש דינמיקת קרום של תאים סמוכים וחלבונים שכותרתו fluorescently כגון טובולין. שיטה זו עובדת עבור כל חלבוני הניאון נבדקו ויכולה ללכוד תכונות submicron סולם על מגוון רחב של סולמות זמן. אמנם מוגבל ל -20 מיקרומטר החיצוני של הגולם עם מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, גישה זו להתבוננות חלבון ודינמיקה הסלולר ברקמות גלמי in vivo יכולה להיות, בדרך כלל שימושית בחקר התא וביולוגיה התפתחותית ברקמות אלה.

Introduction

זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל מבוסס היטב ללימוד היבטים רבים של ביולוגיה. יש מחקר דרוזופילה היסטוריה עשירה של ניסויים גנטיים המאפשרת לצורות מתוחכמות של מניפולציה גנטית, כולל ביטוי, מציאה ומוטציה. עם כניסתו של תוויות חלבון פלואורסצנטי, הרפרטואר הזה התרחב והוא כולל מחקרים של תאים וחלבונים חי חיות. עובר הזבוב הוא מערכת מצוינת למחקרים כגון זה הוא קטן וברור אופטי המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עמוקה, in vivo ^1-3. שלבים אחרים של התפתחות זבוב הוכיחו להיות פחות צייתן, הדורשים הרדמה ^4, לנתיחה ותרבות לטווח קצר ^5,6, או יצירה של חלונות בציפורן הדמיה ^7,8. מניפולציות אלה בדרך כלל לפגוע בהתפתחות בעלי חיים בטווח הארוך או להשפיע על בעלי החיים בדרכים המגבילות את ההדמיה לתקופות קצרות.

אף אוזן גרון "> כדי לחקור מוטציות רומן בגנים שדומים רגולטורים מחזור תא, זה היה חיוני למצוא היערכות מתאימה כדי ללמוד את התזמון ונאמנות של מחזור התא. מאחר שרוב מחזורי תא העובריים מעוגלים (SM או S-G2-M) והמוטציות תחת מחקר לא מראות פגמים עד שלבים מאוחר יותר, זה היה חשוב לקיים את מחזור התא ברקמות שלב גלמים. תאי אפיתל בגולם יש מחזור טיפוסי יותר G1-S-G2-M תא וגלמים של שלב זה הם לא מסוגלים תנועות שרירים ^9. נקודת ההתחלה הראשונית למניפולציות כללה כל גלמים שלמים להביע Histone2AV-GFP. למרות האטימות, לכאורה, של המקרה גלמי, הכנה ללא פגע זה הוכיחה את עצמו מצוין לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. טכניקה זו היא פשוטה די בכך שהחוקרים לתואר ראשון באופן שיגרתי להשתמש בו כדי ללמוד היבטים של תא וביולוגיה התפתחותית בדרוזופילה ועדיין הרזולוציה היא בסדר מספיק כדי לאפשר אפליה של תכונות בקנה מידה מיקרומטר. בשיטה זו, תצפיות של אירועים על פני שעות, דקות או שניות הן אפשריות רק על ידי התאמת פרמטרים סדרת הזמן. וידאו באמצעות חלבונים כחולים, ירוקים, צהובים, כתום, אדומים וניאון, או שילוב של אלה, נעשה. חשוב מכך, אם טיפול שננקט כדי למזער את עוצמת הלייזר, יש אפילו הדמיה לטווח ארוך אין כל השפעה על התפתחות או כדאיות של בעלי החיים.

Protocol

1. טוס עבודה

1. לשמור על זבובים על מדיום קמח תירס, אגר ולסה, שמרים סטנדרטיים בטמפרטורת חדר ^10.
2. לצלבים, לבודד בתולות בתוך 6 שעות של eclosion. לאחר החצייה לזכרים של הגנוטיפ הרצוי, השינוי טס לבקבוקונים חדשים בכל 3-4 ימים.

הערה: בניסויים אלה, קו Gal4 A9 שימש לנהוג ביטוי של transgenes באגף. ניתן להשיג במניות טוסו ממרכז המניה בבלומינגטון. מניות המשמשות בניסויים אלה כוללים A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), Sco / הארגון הנוער הקתולי HsCre (BL # 1092), כטב"מ-ChRFP-אמבטיה (BL # 25773), lollibow ^11.

2. בחירה והרכבה של גלמים

1. גלמי במה או על ידי איסוף אותם כprepupae הלבן (WPP) ולשמור אותם ב25 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל המתאים, או על ידי שימוש בקריטריונים מורפולוגיים ^12.
2. כדי לצפות חלוקות תא, גולם בחר שלאחרונה עבר eversion הראש.מזה זמן עד ממש לפני eclosion (ב> 96 hr), גלמים נמצאים ללא תנועה המאפשרים תצפית ממושכת זמן לשגות.
3. הסר גלמים מהבקבוקונים ידי הנגיעה הראשונה עם מכחול טבול במים, מחכה לרגע כדי לאפשר למים כדי לשחרר את הדבק ואז בעדינות דוחף אותם על המכחול.
4. לשטוף בעדינות גלמים שנבחרו על ידי דרבונם עם מכחול במים כדי להסיר חלקיקי דבק בלוטה ומזון הרוק.
5. העבר את הגלמים נקיים לצלחת פטרי עם 25 מ"מ תחתון coverslip (מספר 1 ½ coverslips).
6. שימוש ברצועות דקות של או פלסטלינה או שעוות שיניים כתמיכה, הר גלמים כך שהרקמות של עניין היא הקרובות ביותר לcoverslip.
   הערה: במחקרים שתוארו כאן, כנפי גלמים, רגליים, בטן או histoblasts notum הגבי כבר נצפו. בפועל, כל רקמה בתוך 20 מיקרומטר של פני השטח של המקרה גלמי היא הנצפה.
7. גלמי אוריינט בזהירות, כדי שTissuדואר של עניין הוא מקביל אל פני השטח coverslip הזכוכית.
8. ברגע שגלמים הם רכובים, להשתמש במכחול להעביר שכבה דקה של thiodiethylene גליקול (TDG) למרווח שבין הגולם וcoverslip.

הערה: TDG מפחית פיזור פני השטח, תואם את מקדם השבירה של שמן, ומאפשר לחמצן כדי לחדור את הרקמה ^13. שימוש בשמנים אינו מומלץ, כפי שהם נוטים לשלול את הרקמות של חמצן, גורמים להפסקה מהירה של התנהגויות תא.

3. הדמיה

הערה: לקבלת הדמיה, מיקרוסקופ confocal עשוי להיות חיוני כמו confocality מסיר את רוב רקע הטשטוש הנגרם על ידי תאורה חזקה של המקרה גלמי.

1. התאם את הגדרות בconfocal כדי למזער את ההשפעה של תאורה על פיתוח וכדאיות גלמי. לשם כך, איזון בין עוצמת עירור ואת הרגישות של אוסף. תצורה אופיינית לwi הדמיהה SP5 לייקה בשימוש בסורק התהודה (8,000 הרץ), כוח הלייזר מוגדר 2% (העברת 10% מ20% כוח), סט חריר 120 מיקרומטר, וקו מיצוע מוגדר 8. הגדרות ישתנו בהתאם לתנאי ניסוי.

הערה: כדי לפתור סולם קנס כולל 40X ו63X עדשות טבילת שמן (מרחק עבודה 0.1 מ"מ) יש גם שימש בהצלחה בשיטה זו, אם כי הם מגבילים את עומק המיקוד.

4. אנליזה

כדי לנתח מסגרות, Z-ערימות או סרטים לייבא את קבצי הנתונים לפיג'י, שבה יש כלים יעילים לצפייה, מדידה ושינוי קבצים למצגת ^14. לדוגמא זמן כדי להשלים מיטוזה נמדד באמצעות מרווח הדגימה ודפדפן תמונה רב ממדי כדי לעבור מסגרות בעת שצפה מתא prophase לtelophase. ה-X, Y, ו-Z-ממדים ניתן למדוד באמצעות כלי המדידה. להוראות מפורטות על התוכנה והשימוש בהראה: http://fiji.sc/Fiji.

Representative Results

תאים בepithelia pseudostratified, כגון העין פיתוח דרוזופילה, או שכבת חדרית של מערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות בפיתוח, עוברים תנועות גרעיניות, כינה הגירה גרעינית interkinetic, בזמן עם מחזור התא. שכפול הדנ"א מתרחש כאשר גרעינים נמצאים באו סמוך לפני שטח הבסיס ותאים להיכנס מיטוזה כאשר הגרעינים להגיע למשטח פסגת ^15,16. תאי אגף גלמים יוצרים אפיתל monolayer המתחלק במהירות בכמה השעות הראשונות שלאחר eversion הראש. הנתונים נאספו במצב xyzt מאגף גלמים מוקדם, לוקחים חלקים כל 2 מיקרומטר במרווחי דקות 1. במיטוזה סרטי 3D וכתוצאה מכך היה לראות רק במשטח הפסגה (איור 1 א). סעיפים שצולמו במקומות יותר בסיסיים לא הראו שום סימנים של מיטוזה (איור 1), אך תנועות גרעיניות התרחשו כגרעינים מחולקים עתה חזרו ממשטח הפסגה.

= "תמיד"> בתוך עמודים
איור 1. גרעינים לעבור לחלק העליון של האפיתל להתחלק. סעיפי נציג מתמונת confocal xyzt של wild-type אגף גלמי דרוזופילה להביע His2AvGFP. בעליונים ביותר בסעיפים שניתן לראות () גרעינים בשלבים שונים של מחזור התא. גרעינים בmetaphase (חיצים) נמצאים בשפע במיקרוסקופ זה כמו גם בגרעיני telophase (ראשי חץ). במטוסים נמוכים יותר של סעיף (ב) אין עדות למיטוזה היא לכאורה אם כי יש שוני בקוטר גרעיני, שמעיד על המצב של שכפול הדנ"א. בקנה מידה בר 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

כדי להמחיש, למדוד, ולכמת את תכונות של תאים מתחלקים, פיתוח הנדרש של הכנה פשוטה להתבוננות מיטוזה באגף גלמים החי של דרוזופילה באמצעות ניתוח confocal של His2AvGFP לבטא בתאים. שיטה זו שימשה לתיעוד שמחזור התא באגף גלמים מתאפיין בקווי דמיון חזקים לתא מחזורים בepithelia pseudostratified שבמהלך הגרעינים למשטח הפסגה של האפיתל שם הם נכנסים למיטוזה. בעקבות telophase, גרעינים לרדת בחזרה לשכבת האפיתל. לפיכך, התאים של monolayer זה, האפיתל unstratified ככל הנראה, להראות מוגבלים interkinetic הגירה גרעינית.

הדמיה של מניות וקווים שנוצרו עבור brainbow הדמיה לחיות ¹⁷ סוג ^ב11 דרוזופילה זמינות לציבור, הוכיחה כי טכניקה זו היא להכליל לחקר תופעות ביולוגיות אחרות. הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש בייצור של videמערכת הפעלה על זמנים הנעים בין דקות ל10 שעה. במידה מסוימת, את הפרמטרים מיקרוסקופ להשתנות עם הניסוי. לדוגמא, קצב הדגימה של הזמן לשגות הדמיה חייב להתאים לאופייה של התופעה הביולוגית תחת השגחה: לצפייה חלוקות תא, אשר בדרך כלל לוקחות בסביבות 12 דקות מprophase לtelophase, איסוף ערימה של תמונות מכל רגע מתאים. כדי לבחון את התנהגותם של filopodia באותם תאים, חלקים או ערימות יש לאסוף בעדינים מרווחים (3 שניות).

בתנאים שתוארו, אין כל השפעה על ההישרדות או מורפולוגיה של המבוגרים eclosing נצפתה ללא קשר לתקופה של התבוננות. כאשר סמן פלואורסצנטי הוא של שפע נמוך, כוח הלייזר הוגדל בדרך כלל. במצבים אלה, לקצר את משך הזמן של הסרט או צמצום מספר הסעיפים או Z-הערימות, החשיפה מזערית. בבקרה על ניסויים אחרים, חושף את הרקמה לעצמה המקסימלית במשך 5 דקות לא הייתה להם ביעילותלא על מורפולוגיה או הישרדות של המבוגר. ויזואליזציה הורחבה כדי לכלול אדום, ירוקים, צהובים, כתומים וכחול חלבוני ניאון מתויגים למגוון רחב של חלבונים שונים, מקומי לממברנה, ו / או מילוי ציטופלסמה. תכונות בטווח submicron נצפו על לוחות זמנים משניות לשעות. בשיטה זו נעשתה שימוש נרחב על מנת להתבונן ולמדוד את העיתוי ונאמנות של מיטוזה בסוג בר ומוטציות (בהכנה).

שלב גלמים של פיתוח דרוזופילה הוא תקופה של פלסטיות המדהימה שבו צורת הזחל מתבטלת באופן משמעותי תוך הצורה הבוגרת מתפתחת על הפיגום של גוף הזחל. למרות היסטוריה עשירה, המחקר של מטמורפוזה כבר הקשו מתודולוגית. לדוגמא, השימוש בהתבוננות ישירה ללמוד את המטמורפוזה שבסיס התהליכים היה מוגבלת על ידי חוסר אמין בגישה vivo לתאים ורקמות בזמן שיפוץ. באופן מפתיעגישה פשוטה שהוצגה כאן מאפשרת גישה לתקופה הנסתרת זה של התפתחות בדרוזופילה. הגישה היא די פשוט שיכול בקלות ללמוד לתואר ראשון ולהשתמש בו וחזק מספיק כדי לאפשר תצפיות של רקמה, תאים וארגון subcellular. מיקרוסקופ המשמש לניסויים אלה אינו מותאם להדמית רקמות עמוקה, וכן התצפיות שלנו מוגבלות במידה רבה ל20 מיקרומטר החיצוני של הגולם. סביר להניח כי טכניקות המאפשרות חדירה לרקמות עמוקות יותר, כגון מיקרוסקופיה רב פוטון, תאפשר עומק הרבה יותר גדול של הדמיה ומאפשרות לימוד של השחלופים המבניים הפנימיים שבבסיס מטמורפוזה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation