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Bioengineering

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पोटेशियम चैनलों की मॉड्यूलेशन का पता लगाने के लिए लेबल मुक्त ऑप्टिकल biosensors का प्रयोग करें

Published: February 10, 2014 doi: 10.3791/51307
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

Summary

ऑप्टिकल biosensor तकनीक जीवित कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली के पास बड़े पैमाने में परिवर्तन का पता लगाने और एक व्यक्ति की कोशिकाओं और कोशिकाओं की आबादी दोनों में सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए अनुमति दे सकते हैं. इस प्रोटोकॉल इस दृष्टिकोण का उपयोग बरकरार कोशिकाओं में जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पोटेशियम चैनल के मॉडुलन का पता लगाने का वर्णन करेंगे.

Abstract

आयन चैनल चुनिंदा आयनों प्लाज्मा झिल्ली 1 के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति देकर न्यूरॉन्स और अन्य उत्तेजनीय कोशिका प्रकार के बिजली के गुणों को नियंत्रित. Neuronal excitability को विनियमित करने के लिए, आयन चैनलों की biophysical गुणों अक्सर एक heteromeric चैनल जटिल 2,3 के लिए फार्म चैनलों को खुद के लिए बाध्य है, जो संकेत प्रोटीन और अणुओं द्वारा संशोधित कर रहे हैं. जीवित कोशिकाओं में बातचीत के समय के पाठ्यक्रम पर कम जानकारी प्रदान करते हुए चैनल और विनियामक प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच पारंपरिक assays, संभवतः प्रोटीन के व्यवहार में परिवर्तन और लक्ष्य की शारीरिक प्रासंगिकता कम कर सकते हैं कि एक्सोजेनस लेबल की आवश्यकता होती है. जैसे एक्स शरीर बायोसाइंसेज बाँध स्कैनर प्रणाली के रूप में ऑप्टिकल biosensors, गुंजयमान में परिवर्तन का पता लगाने के लिए, एक उपन्यास लेबल मुक्त प्रौद्योगिकी, प्रतिध्वनि तरंगदैर्ध्य झंझरी (RWG) ऑप्टिकल biosensors उपयोग biosensor के पास प्रकाश परिलक्षित. इस परख की अनुमति देता रिश्तेदार का पता लगाने केसेल आसंजन में ligand प्रेरित परिवर्तन और प्रसार, विषाक्तता, प्रसार, और प्लाज्मा झिल्ली के पास प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में परिवर्तन से उत्पन्न biosensor सतह के अनुयायी जीवित कोशिकाओं के नीचे हिस्से के भीतर बड़े पैमाने में बदल जाते हैं. RWG ऑप्टिकल biosensors जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), रिसेप्टर tyrosine kinases, और अन्य कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की सक्रियण के बाद कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के पास बड़े पैमाने में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आयन चैनल प्रोटीन बातचीत में ligand प्रेरित परिवर्तन भी इस परख का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. इस पत्र में, हम सुस्त बी सोडियम सक्रिय पोटेशियम GPCRs द्वारा (कश्मीर ना) चैनलों के मॉडुलन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करेंगे.

Introduction

उनके physiologically प्रासंगिक संदर्भ में जीवित कोशिकाओं की जांच सेलुलर लक्ष्य की जैविक कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, चैनल और ऐसे coimmunoprecipitation assays के रूप में नियामक cytoplasmic प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच assays, आम तौर पर जीवित कोशिकाओं में बातचीत के समय के पाठ्यक्रम पर कम जानकारी प्रदान करते हैं. वर्तमान सेल आधारित assays का बहुमत इस तरह के ब्याज की एक fluorescently टैग प्रोटीन के स्थानान्तरण के रूप में एक विशिष्ट सेलुलर घटना, उपाय. ये assays संभावित प्रोटीन के व्यवहार में परिवर्तन और लक्ष्य की शारीरिक प्रासंगिकता कम कर सकते हैं, जो ब्याज के प्रोटीन के संशोधनों की आवश्यकता होती है. , सिस्टम में गड़बड़ी की आवश्यकता सेलुलर गतिविधि का एक निरंतर माप उपलब्ध कराते हैं और उनके सबसे physiologically प्रासंगिक राज्य 4 में कोशिकाओं की पढ़ाई की अनुमति नहीं देते जो अवेध्य सेल आधारित assays,.

ऑप्टिकल biosensors निर्माण करने के लिए तैयार कर रहे हैंसेंसर सतह के लिए युग्मित है कि प्रकाश की एक विशेषता में एक measureable परिवर्तन. सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) और प्रतिध्वनि तरंगदैर्ध्य झंझरी (RWG) तकनीकों में शामिल हैं जो क्षणभंगुर तरंगों का उपयोग कि ऑप्टिकल biosensors,, मुख्य रूप से सेंसर सतह पर स्थिर उनके जैविक रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य अणुओं की समानताएं और कैनेटीक्स का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हाल ही में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध RWG biosensors उच्च स्थानिक संकल्प (अप करने के लिए 3.75 माइक्रोन / पिक्सेल) 5 पर सेंसर की सतह को पक्षपाती कोशिकाओं के नीचे हिस्से के भीतर बड़े पैमाने में रिश्तेदार परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति के लिए विकसित किया गया है. इन biosensors सेल आसंजन और प्रसार, विषाक्तता, प्रसार और जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) सहित कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की एक किस्म के द्वारा हासिल संकेत दे रास्ते के रूप में उत्तेजना से परिणाम है कि जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के पास बड़े पैमाने में परिवर्तन का पता लगा सकते 6 . RWG biosensors रिश्तेदार चान का पता लगानेbiosensor 7 की 150 एनएम के भीतर बड़े पैमाने में रिश्तेदार परिवर्तन के एक समारोह के रूप में अपवर्तन के सूचकांक में जीई. कोशिकाओं biosensor को चढ़ाया जाता है जब, अपवर्तन के सूचकांक में इस परिवर्तन biosensor के लिए सेलुलर पालन में एक परिवर्तन से उत्पन्न सेल के प्लाज्मा झिल्ली के पास जन में परिवर्तन को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल RWG biosensors का उपयोग चैनल प्रोटीन बातचीत का पता लगाने पर चर्चा करेंगे.

RWG डाटा अधिग्रहण प्रणाली कई घटकों से मिलकर बनता है. एक्स शरीर बायोसाइंसेज बाँध स्कैनर इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि हम एक प्लेट रीडर, जुड़े biosensors, बाँध स्कैन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, और बाँध देखें विश्लेषण सॉफ्टवेयर 8 के होते हैं जो इस विशेष व्यवस्था के लिए घटक के लिए उल्लेख होगा. फोटोनिक क्रिस्टल biosensors के रूप में ऑप्टिकल biosensors इसके बाद करने के लिए भेजा, के एक आवधिक व्यवस्था से बना रहे हैं एक विशिष्ट पर प्रकाश के प्रसार को रोकता है जो 2 या 3 आयामों में ढांकता हुआ और सामग्रीतरंग दैर्ध्य और दिशाओं. फोटोनिक क्रिस्टल संरचनाओं लकड़ी की विसंगति बुलाया एक घटना पर आधारित हैं. सबसे पहले 1902 में लकड़ी द्वारा की खोज की, इन विसंगतियों विशेष विवर्तन के आदेश की तीव्रता में तेजी विविधताओं कुछ संकीर्ण आवृत्ति बैंड में होते हैं जहां ऑप्टिकल विवर्तन gratings से परिलक्षित प्रकाश के स्पेक्ट्रम में मनाया प्रभाव हैं. 1962 में, Hessel और Oliner परिमित अवधि झंझरी एक खड़े प्रतिध्वनि तरंगदैर्ध्य 9 उत्पन्न करता है जिसमें लकड़ी के विसंगतियों का एक नया सिद्धांत प्रस्तुत किया. यहाँ वर्णित ऑप्टिकल biosensors में, लकड़ी की विसंगतियों सफेद रोशनी के साथ जब उत्तेजित तरंग दैर्ध्य की ही बहुत संकीर्ण बैंड (आमतौर के बीच 850-855 एनएम) को दर्शाता है कि एक RWG biosensor उत्पादन किया जाता है.

व्यक्तिगत biosensors उच्च अपवर्तक ढांकता हुआ सामग्री टाइटेनियम डाइऑक्साइड (2 TiO) की एक पतली परत के साथ लेपित है जो एक आवधिक सतह की संरचना के साथ एक कम अपवर्तनांक प्लास्टिक की सामग्री से मिलकर बनता है. जब biosensया photonic क्रिस्टल के ऑप्टिकल झंझरी बाइंड स्कैनर में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा जाता है, जो प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के एक संकीर्ण सीमा को दर्शाता है एक व्यापक तरंगदैर्ध्य के प्रकाश स्रोत, के साथ प्रकाशित किया जाता है. परिलक्षित तरंगदैर्ध्य (पीक वेवलेंथ मूल्य, या PWV) की शिखर तीव्रता तो संकेत से गणना की है. Biosensor सतह की निकटता के भीतर बड़े पैमाने में वृद्धि या कमी (~ 150 एनएम) का एक परिणाम के रूप में अपवर्तन के सूचकांक में एक परिवर्तन पर प्रकाश पारियों की PWV. ऑप्टिकल biosensors Biomolecular विज्ञान के लिए एक मानक सोसायटी (एसबीएस) इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया assays के लिए 384 अच्छी तरह से microplate में शामिल कर रहे हैं.

RWV biosensors कोशिकाओं 10 में रहने वाले एक्सोजेनस संकेतों के अलावा पर ​​परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है. कोशिकाओं को सीधे एक RWG biosensor की सतह पर संवर्धित कर रहे हैं और अपवर्तन के स्थानीय सूचकांक में परिवर्तन विशिष्ट उत्तेजनाओं के साथ इलाज पर नजर रखी है. biosensor में बड़े पैमाने में बदलाव की दिशा में हो सकता हैस्थानीय biosensor के पास बड़े पैमाने में वृद्धि से अपवर्तन परिणाम के सूचकांक और में वृद्धि PWV में वृद्धि के रूप में मापा जाता है, क्योंकि निर्धारित की. इसके विपरीत बड़े पैमाने में कमी PWV में कमी पैदा करता है. पता चला PWV में परिवर्तन सेल आसंजन में परिवर्तन, प्रोटीन भर्ती / रिलीज, endocytosis और पुनर्चक्रण, एक्सोसाइटोसिस, apoptosis, और cytoskeletal पुनर्व्यवस्था सहित कई सेलुलर घटनाओं, से परिणाम कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, परख पोटेशियम चैनलों और अन्य cytoplasmic या cytoskeletal घटकों के बीच चैनल प्रोटीन बातचीत में परिवर्तन का पता लगाने की जा सकती है. घटना, तथापि, biosensor निकट ~ 150 एनएम का पता लगाने के क्षेत्र के भीतर होते हैं, और प्लाज्मा झिल्ली के पास एक संलग्न सेल के मामले में होना चाहिए. सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अधिग्रहण बाँध स्कैन सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया है और एसबीएस थाली में 384 कुओं में से प्रत्येक की एक छवि प्रतिनिधित्व उत्पन्न होता है. इस प्रणाली के एकल कक्षों में घटनाओं का पता लगाने की अनुमति, अप करने के लिए 3.75 माइक्रोन / पिक्सेल का एक संकल्प है, और(जैसे HEK293 या चो कोशिकाओं के रूप में) सेल लाइनों के साथ या अधिक physiologically प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता है. बाँध देखें सॉफ्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण व्यक्तिगत और कोशिकाओं की आबादी दोनों में सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. Biosensors microplates 384 अच्छी तरह से मानक एसबीएस में शामिल कर रहे हैं, सिस्टम उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) के लिए आसानी से अनुकूलनीय है.

रेजोनेंस तरंगदैर्ध्य झंझरी ऑप्टिकल biosensors पहले GPCRs 11 के सक्रियण के बाद कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के पास बड़े पैमाने में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारी प्रयोगशाला दो सोडियम सक्रिय (कश्मीर ना) पोटेशियम चैनलों, सुस्त बी और चालाक में 12 क्लोन किया गया है. दोनों बी सुस्त और चालाक चैनलों की गतिविधि बहुत दृढ़ता से प्रोटीन kinase सी (पीकेसी) 13 के प्रत्यक्ष सक्रियण से प्रभावित होना दिखाया गया है. ऐसे एम 1 muscarinic रिसेप्टर और mGluR1 metabotropic ग्लूटामेट आर के रूप में Gα क्ष प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की सक्रियणeceptor, तेज़ी के साथ PKC सक्रियण के माध्यम से चैनल गतिविधि को नियंत्रित. ये कश्मीर ना चैनलों निरंतर उत्तेजना के दौरान neuronal अनुकूलन के लिए योगदान और कार्रवाई के समय की शुद्धता 14 क्षमता को विनियमित. सुस्त चैनलों FMRP, नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन 15,16 सहित cytoplasmic संकेतन अणुओं की एक किस्म के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है. शैशव (MMPSI), गंभीर विकासात्मक देरी 17 में जो परिणाम मिर्गी का एक प्रारंभिक शुरुआत फॉर्म के एकाधिक प्रवास के लिए जाते आंशिक बरामदगी में सुस्त परिणाम में परिवर्तन.

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Protocol

1. सेल संस्कृति (फ्लेमिंग और Kaczmarek 18 से अनुकूलित)

  1. 2 से अधिक है लेकिन कम से कम 10 अंश इस परख में उपयोग करने से पहले के लिए उपयुक्त मीडिया में संस्कृति कोशिकाओं. Stably चूहा सुस्त बी प्रोटीन व्यक्त untransfected HEK 293 कोशिकाओं और HEK 293 कोशिकाओं लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम 10% गर्मी से निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक एक आधा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और एक आधे में बड़े हो रहे हैं. 500 माइक्रोग्राम / एमएल Geneticin (G418) stably सुस्त चैनल की अभिव्यक्ति के लिए चयन करने के लिए सुस्त बी व्यक्त HEK 293 कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. एक 0.25% trypsin EDTA समाधान के साथ बर्तन से हदबंदी से 70-90% संगम पर बीतने कोशिकाओं.

2. फ़ाइब्रोनेक्टिन और Ovalbumin साथ TiO 2 384 अच्छी तरह से ऑप्टिकल biosensor प्लेट के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग

  1. फ़ाइब्रोनेक्टिन ईसीएम मिश्रण और ovalbumin अवरुद्ध समाधान की तैयारी
    1. Fibronect का एक काम कर समाधान तैयारमें 20.0 मिलीलीटर पीबीएस में fibronectin की 5 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के साथ फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में. एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक एकाग्रता से, एक 200 गुना कमजोर पड़ने के लिए 20.0 मिलीलीटर पीबीएस के लिए 100 μl जोड़ें. फ़ाइब्रोनेक्टिन का काम कर समाधान तैयार करने के बाद aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    2. बाँझ पानी में गर्मी निष्क्रिय ovalbumin की एक 5% शेयर समाधान तैयार करें. एक 5% समाधान के लिए बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड पानी में ovalbumin पतला 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गर्मी निष्क्रिय कमरे के तापमान और बाँझ फिल्टर समाधान का हल कूल. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% ovalbumin समाधान और दुकान विभाज्य
    3. पीबीएस में 5% शेयर समाधान गिराए द्वारा ovalbumin की एक 2% काम समाधान तैयार करें. उदाहरण के लिए, 30.0 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस के 18.0 मिलीलीटर के लिए 5% ovalbumin शेयर समाधान के 12.0 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. 384 अच्छी तरह से ऑप्टिकल biosensor प्लेट कोटिंग
    1. 20.0 μl / अच्छी तरह से TiO 2 थाली हाइड्रेट15 मिनट के लिए की बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड पानी. निम्नलिखित कदम एक 16 चैनल pipettor साथ किया जाना चाहिए.
    2. अच्छी तरह से प्रति 50.0 μl पीबीएस के साथ थाली 1x धो लें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन काम कर समाधान की 20.0 μl जोड़ें और ईसीएम बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
    4. अच्छी तरह से प्रति 50.0 μl पीबीएस के साथ थाली 1x धो लें.
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से ovalbumin काम कर समाधान की 40.0 μl जोड़ें और थाली को ब्लॉक करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
    6. अच्छी तरह से प्रति 50.0 μl पीबीएस के साथ थाली 3x धो लें. ईसीएम लेपित प्लेट के लिए 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

3. 384 अच्छी तरह से ऑप्टिकल biosensor प्लेट पर कोशिकाओं की सीडिंग

  1. कोशिकाओं से विकास मीडिया निकालें और थाली से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए trypsin जोड़ें. कोशिकाओं को इकट्ठा और 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र. विकास मीडिया में trypsin मीडिया और resuspend कोशिकाओं निकालें.
  2. एक hemocytometer या एक स्वचालित का उपयोग करनासेल काउंटर, कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण.
  3. ऊष्मायन के दौरान वाष्पीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए, अच्छी तरह से प्रति मध्यम विकास की 50.0 μl उपयोग किया जाएगा. कोशिकाओं मध्यम विकास की 50.0 μl की एक मात्रा में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए पतला होना चाहिए. इन प्रयोगों के लिए, 1000 कोशिकाओं / अच्छी तरह biosensor पर चढ़ाया गया.
  4. वरीयता प्राप्त कोशिकाओं हवा / 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम विकास में रातोंरात सेते दें.

4. RWG ऑप्टिकल biosensor परख के लिए Biosensor और यौगिक प्लेट्स की तैयारी

  1. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और कोशिकाओं से विकास मीडिया को हटा दें. कोशिकाओं हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) के साथ 1x धो लें. प्रत्येक अच्छी तरह से HBSS के 25.0 μl जोड़ें.
  2. बाँध स्कैनर पर biosensor थाली प्लेस और कोशिकाओं को 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. ब्याज की ligands विज्ञापन होगा जिसमें से एक अलग मिश्रित थाली तैयारकी परख के दौरान biosensor प्लेट को ded. इन assays के लिए, समाधान युक्त यौगिक का 25.0 μl 50.0 μl की कुल मात्रा के लिए biosensor थाली पर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया है. जैसे, समाधान में यौगिकों 2x वांछित अंतिम एकाग्रता में तैयार की गई.

5. RWG ऑप्टिकल biosensor परख प्रदर्शन

  1. अच्छी तरह से बाइंड स्कैन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक के मध्य में 1.5 मिमी के लिए 3.75 माइक्रोन / पिक्सेल का एक अधिकतम संकल्प का उपयोग कुओं A1-P12 (एसबीएस 384 अच्छी तरह से थाली का आधा है) के लिए स्कैनर प्रणाली के साथ एक आधारभूत माप ले लो. इस आधारभूत स्कैन लगभग 30 मिनट का समय लगेगा.
  2. कुओं A1-P12 के लिए एक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान के 25.0 μl जोड़ें.
  3. कुओं A13-P24 के एक आधारभूत माप ले लो.
  4. कुओं A13-P24 के लिए एक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान के 25.0 μl जोड़ें.
  5. कुओं A1-P12 के लिए एक के बाद परिसर के अलावा माप ले लो, और कुओं A13-P24 के लिए दोहराएँ.

6. एकबाँध दृश्य के साथ परख डेटा के nalysis

  1. Windows में आधारभूत माप के लिए बाँध परख डेटा खोलें, और सेल चयन सक्षम करने के लिए "ग्रिड संपादक" बटन पर क्लिक करें. सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित ब्याज की मीट्रिक की गणना होगी.
  2. सेल "खोजक" और "बेसलाइनर" समारोह में शामिल हैं जो "प्लग इन", खोलें. "सेल खोजक" में निर्धारित मापदंडों कोशिकाओं biosensor की पृष्ठभूमि से अलग पहचाना जा रहे हैं.
  3. आधारभूत माप के लिए "सेल खोजक" डेटा शामिल हैं जो सेल मानचित्र फ़ाइल में निर्यात करें.
  4. दोहराएँ पोस्ट यौगिक अलावा डेटा के लिए 6.1-6.2 कदम.
  5. "बेसलाइनर" प्लग में खोलें और आधारभूत माप से सेल का नक्शा आयात करते हैं. सॉफ्टवेयर पृष्ठभूमि और बाद परिसर डेटा के बीच PWV में बदलाव की गणना करेगा.
  6. कोशिकाओं के लिए PWV में मतलब पारी के उत्पादन के लिए "Δ सेल मतलब है" का चयन करें. डेटा तो माइक्रोसॉफ्ट उड़ानों को निर्यात किया जा सकता हैआगे के विश्लेषण के लिए एल.

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Representative Results

सुस्त बी stably HEK 293 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट और नियंत्रित untransfected HEK 293 कोशिकाओं में अच्छी तरह से 384 अच्छी तरह से, ईसीएम लेपित RWG biosensor प्लेटों पर 1,000 कोशिकाओं / पर वरीयता प्राप्त थे. Biosensor के मध्य 1.5 मिमी 2 से छवियाँ 3.75 माइक्रोन / पिक्सेल का एक संकल्प (चित्रा 1) पर दर्ज किया गया. द्रव्यमान का घनत्व ढाल नक्शे पूर्व उत्पन्न और बाँध स्कैन सॉफ्टवेयर के साथ 30 मिनट डाक मिश्रयोग गया. बाँध देखें सॉफ्टवेयर आधारभूत PWV से PWV पोस्ट मिश्रयोग घटाकर GPCR एगोनिस्ट अलावा पर PWV में बदलाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था.

अंतर्जात एम 1 muscarinic रिसेप्टर agonist carbamoylcholine क्लोराइड (carbachol) 19 stably HEK 293 कोशिकाओं PWV में एक सकारात्मक वृद्धि (2A चित्रा) के परिणामस्वरूप व्यक्त untransfected नियंत्रण HEK-293 और चूहा सुस्त बी दोनों के लिए लागू किया गया था. माप 30 मिनट पर ले जाया गया और संकेतों (HBSS) additi केवल बफर करने के लिए सामान्यीकृत थेपर. नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, सुस्त बी कोशिकाओं PWV में शिखर पारी में एक बड़ी वृद्धि की गई थी. SFLLR राष्ट्रीय राजमार्ग 2 trifluoroacetate नमक (SFLLR), अंतर्जात GPCR प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर 1 (PAR1) के खिलाफ एगोनिस्ट गतिविधि दर्शाती है जो एक एन टर्मिनल जाल pentapeptide, भी untransfected और सुस्त बी कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) में अंतर प्रतिक्रियाओं से पता चला है. इन परिणामों सुस्त बी चैनल की उपस्थिति काफी HEK कोशिकाओं में अंतर्जात GPCRs के सक्रियण पर होता है कि PWV में बदलाव बढ़ जाती है, और चैनल प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस परख का उपयोग की व्यवहार्यता का प्रदर्शन दिखा.

चित्रा 1
चित्रा 1. बाँध में देखें सेलुलर प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण. BINDScanner डी के प्रतिनिधि छवियाँ अता सुस्त बी stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK 293 कोशिकाओं के लिए एक) बाँध देखें सॉफ्टवेयर "सेल खोजक" प्लग के साथ छवि विश्लेषण के बाद) से पहले और बी. सीमारेखा स्वयं "सेल खोजक" प्लग में पृष्ठभूमि. बी से कोशिकाओं की पहचान करने के लिए) कोशिकाओं और पीले रंग की लाइनों के लिए संबंधित के रूप में पहचान पिक्सल का प्रतिनिधित्व लाल रंग में में दिखाया क्षेत्रों ग्रे प्लेट पृष्ठभूमि PWV में. सी) पारी से कोशिकाओं को अलग उपयोग निर्धारित किए गए SFLLR अलावा पर कोशिकाओं लाल PWV और नीले रंग में एक सकारात्मक बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है, जहां एक रंग ढाल, द्वारा दिखाया गया है के लिए कोई परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है. पैमाने बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. सुस्त बी की अभिव्यक्ति GPCRs. ए) एम 1 मुस्कारिनिक रिसेप्टर agonist carbachol (500 माइक्रोन) नियंत्रण HEK-293 कोशिकाओं की तुलना में सुस्त बी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में आयाम में अधिक से अधिक है कि PWV में एक पारी उत्पादन की सक्रियता निम्नलिखित PWV में बदलाव (परिवर्तित कर देता है SFLLR (10 माइक्रोन), GPCR अंतर्जात प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर 1 (PAR1) के खिलाफ एगोनिस्ट गतिविधि दर्शाती है कि एक एन टर्मिनल जाल pentapeptide के पी <0.0001, एन = 16 कुओं / स्थिति). ख) आवेदन, PWV जवाब में एक पारी का उत्पादन कि नियंत्रण की तुलना में सुस्त-B-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में आयाम में HEK-293 कोशिकाओं (पी <0.0001, एन = 16 कुओं / स्थिति) अधिक होता है. माप 30 मिनट डाक मिश्रयोग दर्ज किए गए, और ligand की प्रतिक्रिया ही नियंत्रण बफर करने के लिए सामान्यीकृत था. त्रुटि सलाखों ± SEM हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

जेड प्रधानमंत्री (जेड ') कारक एक उच्च throughput स्क्रीनिंग परख 20 की गुणवत्ता यों तो एक आम सांख्यिकीय पद्धति है, और इस परख में GPCR एगोनिस्ट की स्क्रीनिंग एक एसबीएस संगत 384 अच्छी तरह से परख में हुई है, क्योंकि एक उत्कृष्ट प्रदान करता है इस परख 21 की मजबूती और वैधता के उपाय. 1 के AZ 'मूल्य अस्तित्वहीन मानक विचलन के साथ डेटा बिंदुओं की एक अनंत संख्या के साथ एक सैद्धांतिक रूप से आदर्श परख इंगित करता है. 0.5 नीचे एक सीमांत जानकारीपूर्ण परख माना के साथ 0.5-1 के बीच की एक-Z 'मूल्य, उच्च throughput प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए एक उत्कृष्ट परख में माना जाता है. इस डेटा सेट के लिए, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक SFLLR carbachol के उपयोग की गणना जेड 'मूल्य इस परख बेहद मजबूत है और प्राप्त परिणामों अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं, यह दर्शाता क्रमश: 0.79 और 0.81 है.

384 अच्छी तरह से ऑप्टिकल biosensor थाली, सेल बोने, और मिश्रयोग के बाह्य मैट्रिक्स कोटिंगइन प्रयोगों में एक 16 चैनल Finnpipette (5-50 μl) के साथ मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया गया था. इस परख एक एसबीएस थाली पर किया जाता है, और अधिक उन्नत रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम उच्च throughput स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है. तरल से निपटने इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए सिस्टम आदत डाल हालांकि, जब ध्यान इस biosensor के लिए नुकसान का कारण होगा ही कि विंदुक युक्तियाँ biosensor सतह को छूने नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए.

DMSO में भंग यौगिकों जोड़ते समय परख मीडिया में DMSO के अंतिम एकाग्रता सेल की वजह से DMSO विषाक्तता को PWV में एक पारी ("DMSO सदमा") से बचने के लिए लगातार आयोजित किया जाता है, ताकि परख प्रदर्शन किया जाना चाहिए. विभिन्न सेल लाइनों इस परख में DMSO के लिए विभिन्न प्रकार से उत्तरदायी हैं, हम DMSO के अंतिम एकाग्रता मात्रा से 0.1-0.2% से अधिक नहीं है कि सलाह देते हैं. प्रकोष्ठों solven से बचने के लिए इस प्रोटोकॉल का तापमान संतुलन चरण के दौरान परख बफर में DMSO के अंतिम एकाग्रता में incubated किया जाना चाहिएPWV में टी प्रेरित पाली.

प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए परख के अनुकूलन प्रदर्शन किया जाना चाहिए, हालांकि प्राथमिक कोशिकाओं सहित कोशिकाओं, की एक विविध रेंज, इस परख के साथ अध्ययन किया जा सकता है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स biosensor सतह कोटिंग्स की संख्या का अनुकूलन किया जाना चाहिए. प्रकोष्ठों 1,000-15,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से बीच विभिन्न घनत्व वरीयता प्राप्त और उच्चतम जेड 'पैदा करता है जो घनत्व निर्धारित करने के लिए एक ज्ञात रिसेप्टर agonist के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए. लेकिन सहित या तो अकेले या संयोजन में, fibronectin, मज्जा, और laminin तक सीमित नहीं विभिन्न ईसीएम सतह कोटिंग्स, कोशिकाओं परख के दौरान biosensor के अनुयायी रहते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. सेल भुखमरी (सीरम की कमी) इस परख में सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित करती है, और इस तरह के प्रयोगों प्रारंभिक परख अनुकूलन प्रयोजनों के लिए सीरम मुक्त और सीरम युक्त मीडिया में प्रदर्शन किया जा सकता है. सकता है बाँध स्कैनर के लेबल मुक्त के उच्च संकल्पसेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण कोशिकाओं द्वारा संपर्क केवल उन पिक्सल के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है के बाद पता लगाने, कम सेलुलर घनत्व में मात्रा निर्धारित किया जा के जवाब माप सक्षम बनाता है. इसके अलावा, एक विषम मिश्रण के भीतर कोशिकाओं की subpopulations gated (आकार और सेल आसंजन की ताकत सहित) कई मापदंडों के आधार पर किया जा सकता है और व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए मापा. साथ में ले ली, इन क्षमताओं प्राथमिक संवर्धित कोशिकाओं को शामिल assays के लिए बाँध स्कैनर आदर्श बनाते हैं.

बाँध स्कैनर प्रणाली माप एक निर्दिष्ट समय पाठ्यक्रम पर उठाए जाने के लिए, और इसलिए PWV में परिवर्तन का समय व्यतीत हो जाने के माप दर्ज किया जा सकता है की अनुमति देता है. यह सेल प्रसार, कोशिका विभाजन, और सेल प्रवास सहित चैनल, प्रोटीन बातचीत की वजह से उन लोगों की तुलना अब समय अवधि खत्म होती है कि सेल व्यवहार में बदलाव को मापने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. बाँध देखें सॉफ्टवेयर जैसे सेलुलर प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, और कई paramete यों कर सकते हैं, सेल पालन में परिवर्तन, सेल की मात्रा में परिवर्तन, और सेल आंदोलन में परिवर्तन सहित मात्रात्मक विश्लेषण और इन घटनाओं के समय चूक इमेजिंग दोनों की अनुमति सेल संरचना में परिवर्तन, के रू. उदाहरण के लिए, इस प्रणाली fibroblasts एक व्यक्ति को अच्छी तरह से भर में सेल प्रवास की दर पर नज़र रखने से संकेत वृद्धि कारक का जवाब जो दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

स्टीवन एम. Shamah एक्स शरीर बायोसाइंसेज के एक कर्मचारी है.

Acknowledgments

लेखकों stably चूहा सुस्त बी प्रोटीन व्यक्त HEK293 कोशिकाओं के उदार दान के लिए येल विश्वविद्यालय में डॉ. फ्रेड Sigworth की प्रयोगशाला में डॉ. Yangyang यान के आभारी हैं. इसके अतिरिक्त लेखकों वीडियो परिचय में प्रदर्शित सुस्त की क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अनुरूपता मॉडल के लिए डॉ. Sigworth के लिए आभारी हैं. इस शोध LKK करने के लिए एनआईएच अनुदान DH067517 और NS073943 द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, High Glucose Life Technologies 11965-092
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Geneticin G-418 Sulfate American Bioanalytical AB05057
HBSS Life Technologies 14025-092
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5378
DPBS Life Technologies 14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6
Carbamoylcholine chloride Sigma-Aldrich C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt Sigma-Aldrich S8701
Finnpipette (5-50 µl) Thermo Scientific 4662090
BIND Scanner System X-BODY Biosciences N/A
384-well TiO2 coated plates X-BODY Biosciences TiO-96-CM

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 84 आयन चैनल पोटेशियम चैनल सुस्त जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) लेबल मुक्त स्क्रीनिंग उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) चैनल प्रोटीन बातचीत ऑप्टिकल biosensors
जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पोटेशियम चैनलों की मॉड्यूलेशन का पता लगाने के लिए लेबल मुक्त ऑप्टिकल biosensors का प्रयोग करें
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Fleming, M. R., Shamah, S. M., Kaczmarek, L. K. Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (84), e51307, doi:10.3791/51307 (2014).

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