Summary
טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.
Abstract
תעלות יונים לשלוט בתכונות חשמליות של תאי עצב ותאים מסוגים אחרים להתרגש ידי סלקטיבי המאפשר ליונים לזרום דרך קרום הפלזמה 1. כדי לווסת את הרגישות עצבית, מאפייני biophysical של תעלות יונים שונו על ידי איתות חלבונים ומולקולות, אשר לעתים קרובות נקשרים לערוצים עצמם כדי ליצור 2,3 מורכב ערוץ heteromeric. מבחני מסורתיים בוחנים את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים רגולטורים דורשים תוויות אקסוגני שעלולים לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד, תוך מתן מעט מידע על הקורס של אינטראקציות הזמן בתאים חיים. biosensors האופטי, כגון מערכת X-BODY Biosciences BIND הסורק, השתמש בטכנולוגיה ללא תווית רומן, צורם תהודה אורך גל (RWG) biosensors האופטי, כדי לזהות שינויים בתהודה משתקף אור ליד biosensor. assay זה מאפשר זיהוי של קרוב המשפחהשינוי במסה בתוך החלק התחתון של תאי חיים חסיד אל פני שטח biosensor כתוצאה משינויי יגנד מושרה בהידבקות תא ומתפשטת, רעיל, התפשטות, ושינויים באינטראקציות בין חלבונים בקרבת קרום הפלזמה. biosensors האופטי RWG היה בשימוש כדי לזהות שינויים במסה קרובים לקרום הפלזמה של תאים לאחר הפעלה של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs), טירוזין קינאז רצפטור, וקולטני תא שטח אחר. שינויי יגנד-Induced באינטראקציות ערוץ חלבון יון גם ניתן ללמוד באמצעות assay זה. במאמר זה, נתאר את ההליך ניסיוני המשמש לגילוי האפנון של אשלגן המופעל נתרן המרווח-B ערוצים (K Na) על ידי GPCRs.
Introduction
בחינת תאי חיים בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם היא קריטית להבנת הפונקציות הביולוגיות של יעדים סלולריים. עם זאת, מבחני שבחנו את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים cytoplasmic רגולציה, כגון מבחני coimmunoprecipitation, בדרך כלל לספק מעט מידע על הקורס של אינטראקציות בתאים חיים בזמן. רוב מבחני תא מבוסס הנוכחיים למדוד אירוע תאי ספציפי, כגון טרנסלוקציה של חלבונים מתויגים fluorescently של עניין. מבחני אלו דורשים שינויים של החלבונים של עניין, אשר יכולה לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד. מבחני תא פולשנית מבוססים, אשר אינו דורשים מניפולציה של המערכת, לספק מדידה רציפה של פעילות תאית ומאפשרים מחקרים של תאים ברוב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם מדינת 4.
biosensors האופטי מתוכננים לייצרשינוי שניתן לכמת במאפיין של האור שהוא מצמידים את משטח החיישן. biosensors האופטי לנצל גלי חלוף, הכולל משטח תהודה plasmon (SPR) וצורמים גל תהודה טכניקות (RWG), היה בשימוש בעיקר כדי לזהות את הזיקות וקינטיקה של מולקולות נקשרות לרצפטורים הביולוגיים שלהם משותקים על משטח החיישן. לאחרונה, biosensors RWG זמין מסחרי פותחו על מנת לאפשר זיהוי של השינוי היחסי במסה בתוך החלק התחתון של תאים חסיד אל פני השטח החיישן ברזולוציה מרחבית גבוהה (עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל) 5. biosensors אלה יכולים לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאי חיים הנובעים מגירוי, כגון הידבקות תא ומתפשט, רעיל, התפשטות ומסלולי איתות שהושרו על ידי מגוון רחב של קולטני תא שטח כוללים קולטנים בשילוב ה-G-חלבון (GPCRs) 6 . biosensors RWG לזהות chan היחסיge במדד השבירה כפונקציה של השינוי היחסי במסה בתוך 150 ננומטר של biosensor 7. כאשר תאים מצופה לbiosensor, שינוי זה באינדקס שבירה משקף את השינוי במסה ליד קרום הפלזמה של התא כתוצאה משינוי בדבקות סלולרית לbiosensor. פרוטוקול זה יעסוק בזיהוי של אינטראקציות ערוץ חלבון באמצעות biosensors RWG.
מערכות רכישת נתונים RWG מורכבות ממספר מרכיבים. בגלל X-BODY Biosciences BIND הסורק שימש לניסויים אלה, נתייחס לרכיבים למערכת המסוימת הזה, אשר מורכב מקורא צלחת, biosensors קשור, תוכנת רכישת BIND סריקה, ותוכנת צפייה בBIND ניתוח 8. Biosensors הגבישים פוטוניים, המכונה להלן biosensors אופטי כ, מורכבים מסידור תקופתי של דיאלקטרי ומהותי ב2 או 3 ממדים אשר מונע את התפשטות אור בספציפיאורכי גל וכיוונים. מבני גבישים פוטוניים מבוססים על תופעה שנקראת האנומליה של ווד. התגלו לראשונה על ידי עץ ב1902, אנומליות אלה הן תופעות שנצפו בספקטרום של אור מוחזר על ידי שבכות שבירה אופטיות שבו וריאציות מהירים בעוצמת הזמנות עקיפה מסוימות מתרחשות בתדרים צרים מסוימים. ב1962, Hessel וOliner הציגו תאוריה חדשה של החריגות של עץ שבו צורם תקופה מוגבלת יוצרת גל תהודה עומד 9. בbiosensors האופטי שתואר כאן, חריגות של עץ משמשות לייצור biosensor RWG שכאשר מגורה עם אור לבן משקף את הלהקה רק צרה מאוד של אורכי גל (בדרך כלל בין 850-855 ננומטר).
biosensors פרט מורכב של חומר פלסטי מדד נמוך שבירה עם משטח מבנה מחזורי אשר מצופה בשכבה דקה של תחמוצת גבוהה שבירת דיאלקטרי טיטניום חומר (Tio 2). כאשר Biosensאו מואר עם רחב מקור אור באורך גל, הצורם האופטית של גבישים פוטוניים משקף טווח צר של אורכי גל של אור הנמדד על ידי ספקטרופוטומטר בסורק BIND. עוצמת השיא של אורכי הגל משתקף (שיא גל הערך, או PWV) מחושבת אז מהאות. PWV של משמרות אור על שינוי במדד השבירה כתוצאה מעלייה או ירידה במסה בתוך הקרבה (~ 150 ננומטר) של פני השטח biosensor. biosensors האופטי משולבים האגודה סטנדרטית למדעי Biomolecular (SBS) microplate 384 גם למבחנים המשמשים בניסויים אלה.
biosensors RWV משמשים לאיתור שינויים על תוספת של אותות אקסוגניים בתאים חיים 10. תאים בתרבית ישירות על גבי המשטח של biosensor RWG והשינוי במדד המקומי של שבירה הוא פיקוח על טיפול בגירויים ספציפיים. הכיוון של שינוי במסה בbiosensor יכול להיותנקבע, כי עלייה במדד המקומי של תוצאות שבירה מעלייה במסה ליד biosensor ונמדדת כגידול בPWV. לעומת זאת ירידה במסה מייצרת ירידת PWV. השינוי בPWV המזוהה יכול לנבוע מאירועים סלולריים רבים, בם שינויים בהידבקות תא, גיוס / שחרור חלבון, אנדוציטוזה ומחזור, exocytosis, אפופטוזיס, וסידור מחדש cytoskeletal. לדוגמא, assay ניתן לזהות שינויים באינטראקציות ערוץ חלבון בין תעלות אשלגן ורכיבי cytoplasmic או cytoskeletal אחרים. האירוע, לעומת זאת, חייב להתרחש בתוך אזור זיהוי ננומטר ~ 150 ליד biosensor, ובמקרה של תא מצורף, ליד קרום הפלזמה. רכישה של תגובות הסלולר מתבצעת עם תוכנת BIND Scan וייצוג דמותו של כל אחד מ384 הבארות בצלחת SBS הוא שנוצר. במערכת זו יש רזולוציה של עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל, המאפשר זיהוי של אירועים בתאים בודדים, וניתן להשתמש בו גם עם שורות תאים (כגון תאי HEK293 או CHO) או עם יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תאים ראשוניים. ניתוח תמונה עם צפייה BIND תוכנה מאפשר זיהוי של תגובות תאיות בשני בודד ואוכלוסיות של תאים. כbiosensors ישולבו SBS הסטנדרטי 384 גם microplates, המערכת היא בקלות להתאמה לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS).
biosensors האופטי סבכת תהודה הגל בעבר נעשה שימוש כדי לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאים הבאים הפעלה של 11 GPCRs. המעבדה שלנו משובט שני ערוצים (K Na) מופעל נתרן, אשלגן, מרווח-B ו12 סליק. פעילותם של שני ערוצי המרווח-B וסליק הוכח להיות מאוד מושפע במידה רבה על ידי הפעלה ישירה של חלבון קינאז C (PKC) 13. הפעלה של רצפטורים חלבון q Gα בשילוב, כגון קולט מוסקריניים M1 ו r גלוטמט metabotropic mGluR1eceptor, בעצמה מסדיר את פעילות ערוץ באמצעות הפעלת PKC. ערוצי K נה אלה תורמים להסתגלות עצבית בזמן גירוי מתמשך ולהסדיר את הדיוק של תזמון של פעולת פוטנציאלי 14. ערוצים רפויים ידועים אינטראקציה עם מגוון רחב של מולקולות איתות cytoplasmic, כוללים FMRP, חלבון X פיגור שהכלי השביר 15,16. מוטציות בתוצאת מרווח בהתקפים חלקיים מעבר מרובים של ינקות (MMPSI), צורת התחלה מוקדמת של אפילפסיה שתוצאתה עיכוב התפתחותי חמור 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים (מעובד מתוך פלמינג וקצ'מארק 18)
- תרבות תאים בתקשורת המתאימה ליותר מ 2 אבל פחות מ 10 מעברים לפני השימוש בassay זה. HEK-293 תאי untransfected וHEK-293 תאים ביציבות להביע מרווח-B חלבון חולדה גדלים במדיום של המחצית Dulbecco אחד השתנה נשר וחצי אחד של ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% סרום חום מומת שור עוברי ואנטיביוטיקה. 500 מיקרוגרם / מיליליטר Geneticin (G418) הוא הוסיף לHEK-293 תאים ביציבות להביע מרווח-B כדי לבחור לביטוי של ערוץ המרווח. תאי מעבר במפגש 70-90% על ידי ניתוק ממנות עם פתרון טריפסין-EDTA 0.25%.
2. תאי מטריקס ציפוי (ECM) של 2 384 גם פלייט Biosensor האופטי טיו עם פיברונקטין וOvalbumin
- הכנת תערובת ECM פיברונקטין ופתרון חסימת ovalbumin
- הכן פתרון עבודה של fibronectבפוספט בופר סליין (PBS) עם ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין ב20.0 מיליליטר PBS. מריכוז מניית 1.0 מ"ג / מיליליטר, להוסיף 100 μl ל20.0 מיליליטר PBS לדילול 200 פי. הפתרון עובד של פיברונקטין ניתן aliquoted ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לאחר הכנה.
- הכן פתרון מניות 5% מovalbumin חום מומת במים סטריליים. לדלל ovalbumin במי כיתה סטרילי רקמת תרבות לפתרון 5% וחום להשבית למשך 30 דקות ב60 ° C. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר וסינון סטרילי הפתרון. Aliquot פתרון 5% ovalbumin ולאחסן ב 4 ° C.
- הכן פתרון עבודה 2% מovalbumin על ידי דילול 5% מניות הפתרון לPBS. לדוגמא, הוסף 12.0 מיליליטר של 5% מניות פתרון ovalbumin ל18.0 מיליליטר של PBS עבור נפח סופי של 30.0 מיליליטר.
- ציפוי צלחת biosensor האופטי 384 גם
- מימה צלחת Tio 2 עם 20.0 μl / טובמים סטריליים של תרבית רקמת כיתה במשך 15 דקות. יש לבצע את הפעולות הבאות עם pipettor 16 ערוצים.
- לשטוף 1x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב.
- הוספת 20.0 μl של הפתרון עובד פיברונקטין לכל היטב דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר כדי ליצור את ECM.
- לשטוף 1x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב.
- הוספת 40.0 μl של הפתרון עובד ovalbumin לכל היטב דגירה הלילה ב 4 ° C כדי לחסום את הצלחת.
- לשטוף 3x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב. ניתן לאחסן צלחות ECM מצופים על 4 מעלות צלזיוס עד 48 שעה.
3. זריעה של תאים לצלחת Biosensor האופטי 384 גם
- הסר תקשורת צמיחה מהתאים ולהוסיף טריפסין כדי לסלק את התאים מן הצלחת. לאסוף את התאים ו צנטריפוגות XG ב 1000 דקות 1. הסר את המדיה טריפסין ותאי resuspend בתקשורת צמיחה.
- באמצעות hemocytometer או אוטומטידלפק תא, לקבוע את הריכוז של התאים.
- כדי למזער את ההשפעות של אידוי במהלך דגירה, 50.0 μl של מדיום גידול בכל טוב יהיה בשימוש. צריכים להיות מדוללים תאים כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים לכל טוב בנפח של 50.0 μl של מדיום גידול. בניסויים אלה, 1,000 תאים / גם היו מצופים על biosensor.
- אפשר תאי זרע לדגירת הלילה במדיום גידול על 37 מעלות צלזיוס תחת אוויר / 5% CO 2.
4. הכנת צלחות Biosensor ואת המתחם עבור assay RWG האופטי Biosensor
- הסר את הצלחת מן החממה ולהסיר תקשורת צמיחה מהתאים. לשטוף את התאים 1x עם תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS). הוספת 25.0 μl של HBSS היטב כל אחד.
- מניחים את צלחת biosensor על סורק BIND ולאפשר לתאים לאזן לטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות.
- הכן צלחת מתחם נפרדת ממנו ligands של ריבית יהיה מודעהטוליפ אין לצלחת biosensor במהלך assay. למבחנים אלה, 25.0 μl של תרכובת תמיסה המכילה נוסף לכל גם על צלחת biosensor להיקף כולל של 50.0 μl. ככזה, תרכובות בפתרון הוכנו ב2x הריכוז הסופי הרצוי.
5. לבצע את assay RWG האופטי Biosensor
- קח מדידה בסיסית עם מערכת הסורק לבארות A1-P12 (מחצית מצלחת 384 גם SBS) באמצעות רזולוציה מקסימלית של 3.75 מיקרומטר / פיקסל ל1.5 מ"מ של כל אחד גם באמצעות תוכנת BIND הסריקה המרכזי. סריקה בסיסית זה תיקח כ 30 דקות.
- הוספת 25.0 μl של פתרונות המתחם היטב כל אחד לבארות A1-P12.
- קח מדידה בסיסית של בארות A13-P24.
- הוספת 25.0 μl של פתרונות המתחם היטב כל אחד לבארות A13-P24.
- קח מדידה בנוסף הודעה מתחם לבארות A1-P12, וחזור לבארות A13-P24.
6.nalysis של assay נתונים עם BIND צפה
- פתח את נתוני assay BIND למדידה הבסיסית ב-Windows, ולחץ על כפתור "גריד העורך" כדי לאפשר בחירת תא. התוכנה תחשב מדדים של עניין שהוגדרו על ידי המשתמש.
- פתח את "תוספות", הכוללות את "Finder Cell" ותפקוד "Baseliner". פרמטרים שנקבעו ב" Finder Cell ", כך שתאים וניתן להבחין מהרקע של biosensor.
- לייצא את קובץ מפת התא שמכיל את הנתונים "Finder Cell" למדידת קו הבסיס.
- חזור על שלבים 6.1-6.2 לנתונים בנוסף מתחם הודעה.
- פתח את התוספת "Baseliner" ולייבא את מפת התא מהמדידה בתחילת המחקר. התוכנה תחשב את השינוי בPWV בין נתוני רקע והודעת מתחם.
- בחר "Cell Δ הממוצע" לתפוקה של המשמרת הממוצעת בPWV לתאים. מכן ניתן לייצא את הנתונים ל-Microsoft Excאל לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HEK-293 תאי untransfected הרפוי-B transfected ביציבות HEK-293 תאים ולשלוט היו זורעים ב1,000 תאים / גם ב384 גם, צלחות biosensor ECM מצופים RWG. תמונות מ1.5 מ"מ 2 המרכזיים של biosensor נרשמו ברזולוציה של 3.75 מיקרומטר / פיקסל (איור 1). מפות שיפוע צפיפות מסה נוצרו מראש ו30 בנוסף מתחם לאחר דקות עם תוכנת BIND הסריקה. תוכנת צפייה בBIND נוצלה כדי לקבוע את השינוי בPWV על תוספת אגוניסט GPCR על ידי הפחתת תוספת תרכובת ההודעה PWV מPWV תחילת המחקר.
כלוריד אנדוגני M1 carbamoylcholine אגוניסט קולטן מוסקריניים (carbachol) 19 מיושם גם שליטת untransfected HEK-293 ועכברוש מרווח-B ביציבות להביע HEK-293 תאים גרמו לעלייה חיובית בPWV (איור 2 א). מדידות נלקחו ב30 דקות ואותות היו מנורמלים למאגר additi בלבד (HBSS)הלאה. בהשוואה לתאי ביקורת, תאי transfected המרווח-B היו עלייה גדולה יותר בשיא משמר בPWV. מלח SFLLR-NH 2 trifluoroacetate (SFLLR), pentapeptide מלכודת N-מסוף אשר מציג פעילות אגוניסט נגד פרוטאז GPCR אנדוגני הקולטן מופעל 1 (PAR1), הראה גם תגובות משתנית בתאי untransfected והמרווח-B transfected (איור 2). תוצאות אלו מראות הנוכחות של המרווח-B הערוץ מגבירה באופן משמעותי את המעבר בPWV המתרחש על הפעלה של GPCRs אנדוגני בתאי HEK, ולהוכיח את ההיתכנות של שימוש assay זה כדי לחקור אינטראקציות ערוץ חלבון.
איור 1. ניתוח של תגובות נייד בBIND תצוגה. נציג תמונות של ד BINDScanner אתא למרווח-B HEK-293 תאים transfected ביציבות) לפני וארוחת בוקר) לאחר ניתוח תמונה עם התוכנה "Finder Cell" התוספת צפה BIND. ספים היו להגדיר באופן ידני תוך שימוש בתוספת "Finder Cell" כדי לזהות תאים מהרקע. ב ') באזורים שמוצגים באדום מייצגים פיקסלים שזוהו כשייכים לתאים ושורות צהובות להבחין בין תאים מהרקע הצלחת האפור. C) השינוי בPWV לתאים שעל בנוסף SFLLR מוצגים על ידי צבע הדרגתי, שבו אדומים מייצג שינוי חיובי בPWV וכחול מייצג שום שינוי. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
00px "/>
איור 2. ביטוי של מרווח-B משנה את השינוי בPWV הבא הפעלה של GPCRs.) Carbachol M1 אגוניסט קולטן מוסקריניים (500 מיקרומטר) המיוצר על שינוי בPWV שהוא גדול יותר במשרעת בתאי transfected מרווח-B מאשר תאי HEK-293 שליטה ( יישום P <0.0001, N = 16 בארות / מצב). ב) SFLLR (10 מיקרומטר), pentapeptide מלכודת N-מסוף שמציג פעילות אגוניסט נגד קולט פרוטאז אנדוגני GPCR מופעל 1 (PAR1), המיוצר על שינוי בתגובה PWV שהוא גדול במשרעת במרווח-transfected תאי B מאשר בשליטת HEK-293 תאים (P <0.0001, N = 16 בארות / מצב). מדידות נרשמו 30 בנוסף הודעה מתחם דק ', והתגובה ליגנד הייתה מנורמלות לחיץ שליטה בלבד. ברים שגיאה הם ± SEM. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ראש Z (Z ') הגורם הוא שיטה סטטיסטית מקובלת לכמת את האיכות של assay הקרנת תפוקה גבוהה 20, וכי ההקרנה של אגוניסטים GPCR בassay זה התרחשה בassay 384 גם תואם SBS, מספק מצוין מידה של החוסן ותוקפו של assay זה 21. הערך 'AZ של 1 מציין assay תיאורטי אידיאלי עם מספר אינסופי של נקודות נתונים עם סטיות תקן שאינם קיימים. ערך 'AZ של בין 0.5-1 נחשב assay מצוין למטרות הקרנת תפוקה גבוהה, עם מתחת 0.5 נחשב assay שולי אינפורמטיבי. למערך נתונים זה, ערך Z מחושב 'ניצול carbachol SFLLR כפקדים חיוביים הוא 0.79 ו0.81 בהתאמה, המצביע על assay זה הוא חזק מאוד והתוצאות שהושגו הן משמעותיות ביותר.
ציפוי מטריצה תאי של תוספת צלחת 384 גם biosensor האופטי, זריעת תאים, ומתחםבניסויים אלה בוצע באופן ידני עם Finnpipette 16 ערוצים (5-50 μl). כassay זה מבוצע על צלחת SBS, ניתן להשתמש במערכות טיפול מתקדמות יותר רובוטית נוזלית בהקרנת תפוקה גבוהה. עם זאת, כאשר התאמת המערכות למכשור טיפול נוזלי, טיפול צריך להיות למימוש על מנת להבטיח כי הטיפים פיפטה לא לגעת במשטח biosensor כמו זה יגרום לניזק לbiosensor.
בעת הוספת תרכובות המומסים DMSO, assay חייב להתבצע כך שהריכוז הסופי של DMSO בתקשורת assay מוחזק קבוע, כדי למנוע שינוי בPWV בשל רעילות DMSO לתא ("הלם DMSO"). למרות ששורות תאים שונות באופן דיפרנציאלי מגיבות לDMSO בassay זה, אנו ממליצים כי הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 0.1-0.2% בנפח. תאים צריכים להיות מודגרות בריכוז הסופי של DMSO במאגר assay במהלך שלב איזון הטמפרטורה של פרוטוקול זה על מנת למנוע solvenמשמרות מושרה לא בPWV.
מגוון רחב של תאים, כוללים תאים ראשוניים, ניתן ללמוד עם assay זה, למרות שאופטימיזציה של assay עבור כל קו תא חייבת להתבצע. בעת שימוש בתאים מסוגים שונים, אופטימיזציה של מספר התאים וציפויי משטח תאיים מטריקס biosensor צריכה להתבצע. צריכים להיות שנזרעו תאים בצפיפויות שונות בין 1,000-15,000 תאים / היטב וטופלו באגוניסט הקולטן ידוע כדי לקבוע אילו צפיפות מייצר Z הגבוה ביותר ". ציפוי פני השטח ECM שונים, כוללים אך לא מוגבל לפיברונקטין, קולגן, וlaminin, לבד או בשילוב, צריך להיבדק על מנת להבטיח שתאים יישארו חסיד אל biosensor במהלך assay. תא רעב (חוסר הדם) עשוי להשפיע על תגובה תאית בassay זה, וכפי שניסויים כאלה עשויים להתבצע בסרום חופשי ומדיה המכיל סרום למטרות assay אופטימיזציה ראשוניות. הרזולוציה הגבוהה של התווית החופשית של BIND הסורקגילוי מאפשר מדידות תגובה ללכמת בצפיפות סלולרית נמוכה, שכן הניתוח של תגובות תאיות יכול להיות מוגבל רק לפיקסלים קשר על ידי תאים. בנוסף, אוכלוסיות של תאים בתוך תערובת הטרוגנית ניתן מגודרות המבוססות על מספר פרמטרים (כוללים גודל ועוצמה של הידבקות תא) ומדדו לתגובות תאיות בודדות. יחדיו, יכולות אלה הופכים את סורק BIND האידיאלי עבור מבחני מעורבים תאים בתרבית ראשוניים.
מערכת סורק BIND מאפשרת מדידות שיש לנקוט על זמן כמובן שצוין, ולכן יכולות להיות שנרשמו מדידות הזמן לשגות של שינויים בPWV. התכונה זו שימושית במיוחד למדידת שינויים בהתנהגות תא המתרחשים על פני תקופות זמן ארוכות יותר מאלה בשל אינטראקציות ערוץ חלבון, כוללים התפשטות תאים, חלוקת תא, ונדידת תאים. תוכנת צפייה בBIND מאפשרת ניתוח של תגובות תאיות כזה, ויכולה לכמת paramete רבRS של שינויים במבנה תא, ובכלל זה שינויים בדבקות תאים, שינויים בנפח תא, ושינויים בתנועת תא, ומאפשרים גם ניתוח כמוני וזמן לשגות הדמיה של אירועים אלה. לדוגמא, מערכת זו יכולה לשמש כדי לקבוע את השיעור שfibroblasts להגיב לגורם גדילת איתות על ידי מעקב אחר קצב נדידת תאים על פני גם בודד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
סטיוון Shamah הנו עובד Biosciences X-BODY.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר Yangyang יאן במעבדה של ד"ר פרד Sigworth באוניברסיטת ייל לתרומתו הנדיבה של HEK293 תאים ביציבות להביע מרווח-B חלבון חולדה. בנוסף המחברים מודים לד"ר Sigworth עבור דגם ההומולוגיה מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-של המרווח מוצג במבוא הווידאו. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקי DH067517 וNS073943 לLKK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
