Summary
Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque.
Abstract
Los canales iónicos controlan las propiedades eléctricas de las neuronas y otros tipos de células excitables al permitir selectivamente los iones fluyan a través de la membrana de plasma 1. Para regular la excitabilidad neuronal, las propiedades biofísicas de los canales de iones son modificados por las proteínas y moléculas de señalización, que a menudo se unen a los propios canales para formar un complejo de 2,3 canal heteromérico. Ensayos tradicionales que analizan la interacción entre canales y proteínas reguladoras requieren etiquetas exógenos que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta, mientras que proporciona poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. Biosensores ópticos, tales como el sistema X-CUERPO Biociencias BIND escáner, utilizan una nueva tecnología sin etiqueta, rejilla de longitud de onda de resonancia (GTR) biosensores ópticos para detectar cambios en el resonante luz cerca del biosensor reflejada. Este ensayo permite la detección de la relacióncambio en la masa dentro de la porción inferior de las células vivas adheridas a la superficie del biosensor como resultado de cambios inducidos ligando en la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación, y los cambios en las interacciones proteína-proteína cerca de la membrana plasmática. Biosensores ópticos GTR se han utilizado para detectar cambios en la masa cerca de la membrana de plasma de las células después de la activación de los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), los receptores de tirosina quinasas, y otros receptores de la superficie celular. Ligando los cambios inducidos en iones de interacciones proteína-canal también se pueden estudiar usando este ensayo. En este artículo, describiremos el procedimiento experimental utilizado para detectar la modulación de Slack-B de sodio y potasio activados (K Na) canales de GPCR.
Introduction
El examen de las células vivas en su contexto fisiológicamente relevante es crucial para la comprensión de las funciones biológicas de las dianas celulares. Sin embargo, los ensayos que examinan la interacción entre canales y proteínas citoplasmáticas reguladoras, tales como ensayos coimmunoprecipitation, generalmente proporcionan poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. La mayoría de los ensayos basados en células actuales medir un evento celular específico, tal como la translocación de una proteína marcado con fluorescencia de interés. Estos ensayos requieren modificaciones de las proteínas de interés, que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta. Ensayos basados en células no invasiva, que no requieren la manipulación del sistema, proporcionan una medición continua de la actividad celular y permiten estudios de células en su estado más fisiológicamente relevante 4.
Biosensores ópticos están diseñados para producirun cambio medible en una característica de la luz que está acoplada a la superficie del sensor. Biosensores ópticos que utilizan ondas evanescentes, que incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la resonancia de longitud de onda de rejilla (GTR) técnicas, se han utilizado principalmente de detectar las afinidades y la cinética de las moléculas de unión a sus receptores biológicos inmovilizados sobre la superficie del sensor. Más recientemente, los biosensores GTR disponibles comercialmente se han desarrollado para permitir la detección de la variación relativa de la masa dentro de la porción inferior de las células adherentes a la superficie del sensor a alta resolución espacial (hasta 3,75 m / píxel) 5. Estos biosensores pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células vivas que resultan de la estimulación, tales como la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación y vías de señalización provocados por una variedad de receptores de la superficie celular, incluyendo los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) 6 . Biosensores GTR detectan la relación chanGE en el índice de refracción como una función de la variación relativa en masa dentro de 150 nm del biosensor 7. Cuando las células se colocan en placas al biosensor, este cambio en el índice de refracción refleja el cambio en la masa cerca de la membrana plasmática de la célula resultante de un cambio en la adhesión celular para el biosensor. Este protocolo se discutirá la detección de interacciones proteína-canal utilizando biosensores GTR.
Los sistemas de adquisición de datos GTR constan de varios componentes. Debido a que el X-CUERPO Biociencias BIND escáner fue utilizado para estos experimentos, se hará referencia a los componentes de este sistema en particular, que consiste en un lector de placas, biosensores asociados, software de adquisición de BIND Scan y software BIND Ver análisis 8. Los biosensores de cristal fotónico, nos referiremos en adelante como biosensores ópticos, están compuestos por un arreglo periódico de un dieléctrico y material en 2 o 3 dimensiones que impide la propagación de la luz en específicolongitudes de onda y las direcciones. Estructuras de cristal fotónico se basan en un fenómeno llamado anomalía de Wood. Descubierta por primera vez por Wood en 1902, estas anomalías son los efectos observados en el espectro de luz reflejada por las rejillas de difracción ópticas donde se producen variaciones rápidas en la intensidad de determinadas órdenes de difracción en ciertas bandas de frecuencia estrechas. En 1962, Hessel y Oliner presentan una nueva teoría de las anomalías de la madera en la que finita periodo de red genera una longitud de onda de resonancia de pie 9. En los biosensores ópticos descritos aquí, anomalías de madera se utilizan para producir un biosensor GTR que cuando se estimula con luz blanca refleja sólo banda muy estrecha de longitudes de onda (típicamente entre 850 a 855 nm).
Biosensores individuales se componen de un material de bajo índice de refracción de plástico con una estructura superficial periódica que está recubierto con una fina capa de dióxido de titanio de material dieléctrico de alta refracción (TiO2). Cuando los Biosenso se ilumina con una fuente de luz de longitud de onda, la rejilla óptica de los cristales fotónicos refleja un rango estrecho de longitudes de onda de luz que se mide mediante un espectrofotómetro en el escáner de BIND. La intensidad máxima de las longitudes de onda reflejadas (Longitud de onda máxima del valor, o la VOP) se calcula a partir de la señal. El VOP de la luz cambia a un cambio en el índice de refracción como resultado de un aumento o disminución de la masa dentro de la proximidad (~ 150 nm) de la superficie del biosensor. Biosensores ópticos se incorporan en un estándar de la Sociedad de Ciencias Biomoleculares (SBS) de microplacas de 384 pocillos para los ensayos utilizados en estos experimentos.
Biosensores RWV se utilizan para detectar cambios tras la adición de señales exógenas en las células vivas 10. Las células se cultivan directamente sobre la superficie de un biosensor GTR y el cambio en el índice local de refracción se monitoriza tras el tratamiento con estímulos específicos. La dirección del cambio en la masa en el biosensor puede serdeterminado, debido a un aumento en el índice local de resultados de la refracción de un aumento de masa cerca del biosensor y se mide como un aumento de la VOP. Por el contrario una disminución de la masa produce una disminución de la VOP. El cambio en la VOP detectado puede ser el resultado de numerosos eventos celulares, incluyendo cambios en la adhesión celular, proteínas de reclutamiento / liberación, la endocitosis y el reciclaje, la exocitosis, la apoptosis y reordenamiento del citoesqueleto. Por ejemplo, el ensayo puede detectar cambios en las interacciones proteína-canal entre los canales de potasio y otros componentes citoplasmáticos o citoesqueleto. El evento, sin embargo, debe ocurrir dentro de la zona de detección nm ~ 150 cerca del biosensor, y en el caso de una celda adjunta, cerca de la membrana plasmática. Adquisición de las respuestas celulares se realizó con el software de BIND Scan y se genera una representación de la imagen de cada uno de los 384 pocillos en la placa de SBS. Este sistema tiene una resolución de hasta 3,75 m / píxel, que permite la detección de eventos en células individuales, yse puede utilizar tanto con líneas celulares (tales como células HEK293 o CHO) o con más fisiológicamente relevantes células primarias. El análisis de imágenes con el software de BIND Ver permite la detección de respuestas celulares, tanto en individual y poblaciones de células. Como los biosensores se incorporan en estándar SBS microplacas de 384 pocillos, el sistema es fácilmente adaptable a cribado de alto rendimiento (HTS).
Biosensores ópticos de rejilla de resonancia de longitud de onda se han usado previamente para detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células después de la activación de GPCR 11. Nuestro laboratorio ha clonado dos canales de potasio de sodio activados (K Na), Slack-B y Slick 12. La actividad de ambos canales B-Slack y Slick ha demostrado ser muy fuertemente influenciada por la activación directa de la proteína quinasa C (PKC) 13. La activación de los receptores acoplados a proteínas Gα q, tales como el receptor muscarínico M1 y el mGluR1 metabotrópico de glutamato receptor, regula de forma potente la actividad del canal a través de la activación de PKC. Estos canales de K Na contribuyen a la adaptación neuronal durante la estimulación sostenida y regular la exactitud de la sincronización de los potenciales de acción 14. Canales de tensión se sabe que interactúan con una variedad de moléculas de señalización citoplasmáticas, incluyendo FMRP, la proteína de retraso mental X Frágil 15,16. Las mutaciones en consecuencia Slack en múltiples Migración Convulsiones parciales de la infancia (MMPSI), una forma de aparición temprana de la epilepsia que se traduce en un retraso grave del desarrollo 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivos Celulares (Adaptado de Fleming y Kaczmarek 18)
- Células de cultivo en medios apropiados para superior a 2 pero menos de 10 pasajes antes de su uso en este ensayo. Células no transfectadas HEK-293 y las células HEK-293 que expresan establemente la proteína de rata de parafina y-B se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco uno medio y uno medio de Leibovitz L-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y antibióticos. 500 g / ml de geneticina (G418) se añade a las células HEK-293 que expresan establemente Slack-B para seleccionar por la expresión del canal de parafina. Células Passage en 70-90% de confluencia por la disociación de los platos con una solución de tripsina-EDTA 0,25%.
2. Matriz extracelular (ECM) de recubrimiento de TiO 2 384 y placa de biosensor óptico con fibronectina y ovoalbúmina
- Preparación de la mezcla de ECM fibronectina y solución de bloqueo ovoalbúmina
- Prepare una solución de trabajo de fibronecten en tampón fosfato salino (PBS) con una concentración final de 5 g / ml de fibronectina en 20,0 ml de PBS. A partir de una concentración stock de 1,0 mg / ml, añadir 100 ml a 20,0 ml de PBS para una dilución de 200 veces. La solución de trabajo de la fibronectina se puede dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C después de la preparación.
- Preparar una solución madre 5% de ovoalbúmina inactivado por calor en agua estéril. Diluir la ovoalbúmina en el tejido agua estéril de grado de cultivo de una solución al 5% y al calor inactivar durante 30 min a 60 ° C. Enfriar la solución a temperatura ambiente y el filtro estéril la solución. Alícuota de la solución de ovoalbúmina al 5% y se almacenan a 4 ° C.
- Preparar una solución de trabajo 2% de ovoalbúmina por dilución de la solución madre 5% en PBS. Por ejemplo, añadir 12,0 ml de solución de ovoalbúmina de almacén 5% a 18,0 ml de PBS para un volumen final de 30,0 ml.
- 384-y recubrimiento de placas biosensor óptico
- Hidratar la placa de TiO2 con 20,0 l / pocilloagua estéril de grado de cultivo de tejido durante 15 min. Los siguientes pasos deben realizarse con una pipeta de 16 canales.
- Lavar 1x placa con 50,0 l de PBS por pocillo.
- Añadir 20,0 l de la solución de trabajo de la fibronectina a cada pocillo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente para crear el ECM.
- Lavar 1x placa con 50,0 l de PBS por pocillo.
- Añadir 40,0 l de la solución de trabajo de la ovoalbúmina a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 º C para bloquear la placa.
- Lave la placa 3x con 50,0 l de PBS por pocillo. Placas de ECM recubiertos se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 48 horas.
3. La siembra de las células en el 384 pocillos Placa biosensor óptico
- Retire el medio de crecimiento de las células y añadir tripsina para desprender las células de la placa. Recoger las células y se centrifuga a 1000 × g durante 1 min. Quite el papel de la tripsina y las células se resuspenden en medio de cultivo.
- El uso de un hemocitómetro o un automatizadocontador de células, determinar la concentración de las células.
- Para reducir al mínimo los efectos de la evaporación durante la incubación, se utilizará 50,0 l de medio de crecimiento por pocillo. Las células deben ser diluidos para lograr el número deseado de células por pocillo en un volumen de 50,0 l de medio de crecimiento. Para estos experimentos, 1000 células / pocillo se sembraron en el biosensor.
- Permitir que las células sembradas a incubar durante la noche en medio de crecimiento a 37 ° C bajo aire / 5% de CO 2.
4. Preparación de los biosensores y compuestas Placas para el ensayo de biosensor óptico GTR
- Retirar la placa de la incubadora y retirar medios de cultivo de las células. Lavar las células 1x con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Añadir 25,0 l de HBSS a cada pocillo.
- Coloque la placa de biosensor en el escáner BIND y permiten que las células alcancen la temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Preparar un plato compuesto por separado de la que los ligandos de interés serán added a la placa de biosensor durante el ensayo. Para estos ensayos, se añadió 25,0 l de solución que contiene el compuesto a cada pocillo en la placa de biosensor para un volumen total de 50,0 l. Como tales, los compuestos en solución se prepararon en 2X la concentración final deseada.
5. Lleve a cabo el ensayo de biosensor óptico GTR
- Realice una medición de línea de base con el sistema de escáner para pozos A1-P12 (la mitad de la placa de 384 pocillos SBS) con una resolución máxima de 3.75 m / pixel de la central de 1,5 mm de cada pocillo utilizando el software BIND Scan. Esta exploración de línea de base tendrá una duración aproximada de 30 min.
- Añadir 25,0 l de las soluciones de compuesto a cada pocillo de los pocillos A1-P12.
- Realice una medición de línea de base de pozos A13-P24.
- Añadir 25,0 l de las soluciones de compuesto a cada pocillo para pozos A13-P24.
- Realice una medición adición del compuesto después de los pocillos A1-P12, y repita para pozos A13-P24.
6. Lanálisis de Ensayo de datos con BIND Ver
- Abra los datos del ensayo de BIND para la medición de línea de base de Windows, y haga clic en el botón "Editor de cuadrícula" para permitir la selección de células. El software calcula la métrica de interés definidos por el usuario.
- Abra el "Plug-ins", que incluyen el "Buscador de la célula" y la función "Baseliner". Establezca los parámetros de "Buscador de la célula", por lo que las células se pueden distinguir de los antecedentes del biosensor.
- Exportar el archivo de mapa de celdas que contiene los datos de "Buscador de la célula" para la medición de la línea de base.
- Repita los pasos 6.1 hasta 6.2 para los datos de la adición del compuesto de correos.
- Abra el "Baseliner" plug-in e importar el mapa de celdas de la medición inicial. El software calculará el cambio en la VOP entre los antecedentes y compuestas mensaje.
- Seleccione "Δ celular Mean" para la salida de la desviación de la media en VOP para las células. Los datos pueden ser exportados a Microsoft ExcEL para su posterior análisis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las células HEK-293 transfectadas Slack-B transfectadas establemente células HEK-293 y el control se sembraron a 1000 células / pocillo en 384 pocillos, recubiertos ECM GTR placas biosensores. Las imágenes de la central de 1,5 mm 2 del biosensor se registraron con una resolución de 3,75 m / píxel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidad de masa se generaron antes y 30 minutos después de la adición del compuesto con el software BIND Scan. El BIND Ver software se utilizó para determinar el cambio en la VOP en GPCR Además agonista restando la adición del compuesto después de la VOP de la VOP de referencia.
El M1 cloruro muscarínico carbamoylcholine agonista receptor endógeno (carbacol) 19 se aplicó tanto al control no transfectadas HEK-293 y la rata Slack-B que expresan establemente células HEK-293 resultó en un incremento positivo de la VOP (Figura 2A). Las mediciones se tomaron a los 30 min y las señales se normalizaron a sólo tampón (HBSS) additien. En comparación con las células de control, las células transfectadas Slack-B tenían un mayor incremento en el desplazamiento de pico en la VOP. SFLLR-NH2 sal trifluoroacetato (SFLLR), un pentapéptido TRAP N-terminal que muestra actividad agonista frente a la proteasa de GPCR endógeno receptor activado 1 (PAR1), también mostró respuestas diferenciales en las células no transfectadas y Slack-B transfectadas (Figura 2B). Estos resultados muestran la presencia del canal de parafina y-B aumenta significativamente el cambio en la VOP que se produce tras la activación de GPCR endógenos en las células HEK, y demuestran la viabilidad del uso de este ensayo para estudiar las interacciones proteína-canal.
Figura 1. Análisis de las respuestas celulares en BIND View. Imágenes representativas de BINDScanner d ata para B Slack células transfectadas establemente HEK-293 A) antes y B) después de análisis de imágenes con el software BIND Ver "Buscador de la célula" plug-in. Los umbrales se ajustan manualmente utilizando el "Buscador de la célula" plug-in para identificar las células de fondo. B) Áreas mostrados en en rojo representan píxeles identificados como pertenecientes a las células y líneas amarillas distinguen las células de la placa de fondo gris. C) El cambio de la VOP para las células tras la adición SFLLR se muestra mediante un degradado de color, donde el rojo representa un cambio positivo en la VOP y el azul representa ningún cambio. La barra de escala representa 100 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
00px "/>
Figura 2. Expresión de Slack-B altera el cambio de la VOP después de la activación de GPCRs. A) El M1 carbacol agonista de los receptores muscarínicos (500 M) produjo un cambio en la VOP que es mayor en la amplitud en las células transfectadas Slack-B que las células control HEK-293 ( P <0,0001, n = 16 pocillos / condición). B) Aplicación de SFLLR (10 mM), un pentapéptido TRAP N-terminal que presenta actividad agonista de GPCR en contra de la proteasa endógena receptor activado 1 (PAR1), produjo un cambio en la respuesta VOP que es mayor en amplitud de tensión en las células-B-transfectadas que en el control HEK-293 células (p <0,0001, n = 16 pocillos / condición). Las medidas se registraron 30 Además compuesto mensaje min, y la respuesta ligando se normalizó para amortiguar único control. Las barras de error son ± SEM. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El primer Z (Z ') factor es un método estadístico común para cuantificar la calidad de un ensayo de cribado de alto rendimiento 20, y porque la proyección de los agonistas de GPCR en este ensayo se produjo en un ensayo de 384 pocillos compatibles SBS, proporciona una excelente medida de la solidez y validez de este ensayo 21. Valor AZ 'de 1 indica un ensayo teóricamente ideal, con un número infinito de puntos de datos con desviaciones estándar inexistentes. Valor AZ 'de entre 0,5-1 se considera un excelente ensayo para fines de selección de alto rendimiento, con por debajo de 0,5 considerado un ensayo marginalmente informativo. Para este conjunto de datos, el valor calculado de Z 'utilizando carbacol un SFLLR como controles positivos es 0,79 y 0,81 respectivamente, lo que indica este ensayo es muy robusto y los resultados obtenidos son muy significativos.
Revestimiento de matriz extracelular de la placa de 384 pocillos biosensor óptico, la siembra de células, y compuesto de adiciónen estos experimentos se llevó a cabo manualmente con un 16-canal Finnpipette (5-50 l). Como este ensayo se realiza en una placa de SBS, los sistemas de manejo de líquidos robóticos más avanzados se pueden utilizar en el cribado de alto rendimiento. Sin embargo, cuando la adaptación de los sistemas de instrumentación de manejo de líquidos, se debe tener cuidado para asegurar que las puntas de pipeta no toquen la superficie del biosensor, ya que esto puede causar daños en el biosensor.
Cuando la adición de compuestos disueltos en DMSO, el ensayo debe ser realizado de manera que la concentración final de DMSO en medio de ensayo se mantiene constante para evitar un cambio en la VOP debido a la toxicidad de DMSO a la celda ("choque de DMSO"). Aunque las diferentes líneas celulares son diferencialmente sensibles al DMSO en este ensayo, se recomienda que la concentración final de DMSO no supera 0,1-0,2% en volumen. Las células deben ser incubadas en la concentración final de DMSO en tampón de ensayo durante la etapa de equilibrio de la temperatura de este protocolo con el fin de evitar la solvencambios inducidos por t-en la VOP.
Una amplia gama de células, incluidas las células primarias, se puede estudiar con este ensayo, a pesar de la optimización del ensayo para cada línea celular se debe realizar. Cuando el uso de diferentes tipos de células, se debe realizar la optimización del número de células y recubrimientos de superficie del biosensor de la matriz extracelular. Las células deben ser sembradas a varias densidades entre 1.000-15.000 células / pocillos y se trataron con un agonista de receptor conocido para determinar que la densidad produce el más alto Z '. Varios revestimientos de superficie de ECM, incluyendo pero no limitado a la fibronectina, colágeno, laminina y, ya sea solo o en combinación, deben ser probados para asegurar que las células permanecen adherentes al biosensor durante el ensayo. La inanición de la célula (falta de suero) puede influir en la respuesta celular en este ensayo, y como tales experimentos se pueden realizar en libre de suero y los medios de comunicación que contiene suero para los propósitos iniciales de optimización de ensayo. La alta resolución de la etiqueta del BIND Scanner gratisdetección permite mediciones de respuesta a ser cuantificado a baja densidad celular, ya que el análisis de las respuestas celulares puede ser restringido a sólo aquellos pixeles contactadas por las células. Además, las subpoblaciones de células dentro de una mezcla heterogénea pueden ser cerrada basan en múltiples parámetros (incluyendo tamaño y la fuerza de adhesión celular) y se miden para respuestas celulares individuales. En conjunto, estas características hacen el ideal BIND escáner para los ensayos con células de cultivo primario.
El sistema de escáner BIND permite realizar mediciones durante un transcurso de tiempo especificado, y por lo tanto las mediciones de lapso de tiempo de los cambios en la VOP se pueden grabar. Esto es particularmente útil para medir los cambios en el comportamiento celular que se producen durante períodos de tiempo más largos que las debidas a las interacciones proteína-canal, incluyendo la proliferación celular, la división celular, y la migración celular. El BIND Ver software permite el análisis de dichas respuestas celulares, y se puede cuantificar numerosos Parameters de los cambios en la estructura de la célula, incluyendo cambios en la adhesión celular, cambios en el volumen de las células y los cambios en el movimiento celular, que permite tanto el análisis cuantitativo y time-lapse de estos eventos. Por ejemplo, este sistema puede ser usado para determinar la tasa de fibroblastos que responden al factor de crecimiento de señalización mediante el seguimiento de la tasa de migración celular a través de un pozo individual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven M. Shamah es un empleado de X-CUERPO Biosciences.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Yangyang Yan del laboratorio del Dr. Fred Sigworth de la Universidad de Yale por el generoso donativo de células HEK293 que expresan establemente la proteína rata Slack-B. Además, los autores agradecen al Dr. Sigworth para crioelectrónica modelo de homología microscopía de Slack se muestra en el vídeo de introducción. Esta investigación fue apoyada por el NIH subvenciones DH067517 y NS073943 a LKK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
