Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bruk av Merkfritt Optiske biosensorer til Detect Modulation av kaliumkanaler av G-protein koblede reseptorer

Published: February 10, 2014 doi: 10.3791/51307
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

Summary

Optiske biosensor teknikker kan oppdage endringer i masse nær plasmamembranen i levende celler, og tillater en å følge cellulære responser i både individuelle celler og cellepopulasjoner. Denne protokollen beskriver deteksjon av modulering av kaliumkanaler av G-protein-koplede reseptorer i intakte celler ved hjelp av denne fremgangsmåten.

Abstract

Ionekanaler styre de elektriske egenskapene til nerveceller og andre eksiterbare celletyper ved selektivt tillater ioner å strømme gjennom plasmamembranen 1.. For å regulere neuronal eksitabilitet, blir de biofysiske egenskapene til ionekanaler modifisert ved signal proteiner og molekyler, som ofte bindes til kanalene i seg selv for å danne en kanal heteromeric kompleks 2,3. Tradisjonelle analyser undersøke samspillet mellom kanaler og regulatoriske proteiner krever eksogene etiketter som potensielt kan endre protein atferd og redusere fysiologiske betydningen av målet, samtidig som det gir lite informasjon om den tiden løpet av interaksjoner i levende celler. Optiske biosensorer, som for eksempel X-BODY biovitenskap BIND Scanner system, bruker en roman label-fri teknologi, resonans bølgelengde rist (RWG) optiske biosensorer, for å oppdage endringer i resonant reflektert lys i nærheten av biosensor. Denne analysen tillater påvisning av den relativeendring av massen i den nedre del av levende celler heftende biosensor til overflaten som følge av ligand-induserte forandringer i celle adhesjon og spredning, toksisitet, proliferasjon, og forandringer i protein-protein interaksjoner nær plasmamembranen. RWG optiske biosensorer er blitt brukt til å detektere endringer i massen i nærheten av plasmamembranen av celler etter aktivering av G protein-koblede reseptorer (GPCR), reseptor-tyrosinkinaser, og andre celleoverflatereseptorer. Ligand-induserte endringer i ionekanal-protein interaksjoner kan også studeres ved hjelp av denne analysen. I denne artikkelen vil vi beskrive den eksperimentelle prosedyren brukes til å oppdage modulering av slakk-B natrium-aktivert kalium (K Na) kanaler ved GPCRs.

Introduction

Undersøke levende celler i deres fysiologisk relevant kontekst er avgjørende for å forstå de biologiske funksjonene i mobilnettet mål. Men analyser undersøke samspillet mellom kanaler og regulatoriske cytoplasmatiske proteiner, slik som coimmunoprecipitation analyser, generelt gir lite informasjon om den tiden løpet av interaksjoner i levende celler. De fleste av dagens cellebaserte analyser måler en spesifikk cellulær hendelse, slik som den translokasjon av et fluorescensmerket merket protein av interesse. Disse analysene krever modifikasjoner av proteiner av interesse, noe som kan endre proteinets oppførsel og redusere den fysiologiske relevans av målet. Ikke-invasiv cellebaserte analyser, som ikke krever manipulering av systemet, gir en kontinuerlig måling av cellulær aktivitet og tillater undersøkelser av celler i deres mest fysiologisk relevante tilstand 4.

Optiske biosensorer er designet for å produsereen målbar forandring i en egenskap av lyset som er koblet til sensoroverflaten. Optiske biosensorer som utnytter flyktige bølger, som omfatter overflate-plasmonresonans (SPR), og resonans-bølgelengden rist (RWG) teknikker, er primært brukt til å detektere de affiniteter og kinetikken av molekyler bundet til sine biologiske reseptorer immobilisert på sensoroverflaten. Mer nylig har kommersielt tilgjengelige RWG biosensorer blitt utviklet for å tillate deteksjon av den relative endringen i masse i den nedre delen av adherente celler til føleroverflaten med høy romlig oppløsning (opp til 3,75 mikrometer / pixel) 5. Disse biosensorer kan detektere endringer i massen i nærheten av plasmamembranen av levende celler som resulterer fra stimulering, slik som celle adhesjon og spredning, toksisitet, proliferasjon og signalveier oppstår ved en rekke celleoverflatereseptorer inkludert G-protein-koblede reseptorer (GPCR) 6 . RWG biosensorer oppdage den relative change i brytningsindeksen som en funksjon av den relative forandring i massen i løpet av 150 nm på biosensor 7.. Når cellene er belagt på biosensor, reflekterer denne endringen i brytningsindeksen endringen i masse nær plasmamembranen av cellen som følge av en forandring i cellulær tilslutning til biosensor. Denne protokollen vil diskutere påvisning av kanal-protein interaksjoner med RWG biosensorer.

RWG datainnsamling systemer består av flere komponenter. Fordi X-BODY biovitenskap BIND Scanner ble brukt for disse eksperimentene, skal vi referere til komponentene for dette systemet, som består av en plate leser, forbundet biosensorer, BIND Scan oppkjøpet programvare, og BIND Vis analyse programvare åtte. De fotoniske krystaller biosensorer, heretter kalt optiske biosensorer, er sammensatt av en periodisk arrangement av et dielektrisk materiale, og i to eller tre dimensjoner som hindrer spredning av lys ved spesifikkebølgelengder og retninger. Fotoniske krystallstrukturer er basert på et fenomen som kalles Wood anomali. Først oppdaget av tre i 1902, er disse anomaliene er effektene som observeres i spekteret av lyset reflekteres av optiske diffraksjonsgittere hvor raske variasjoner i intensiteten av bestemte diffraksjon ordre opptrer i visse smale frekvensbånd. I 1962, Hessel og Oliner presentert en ny teori om Woods anomalier hvor begrenset periode rist genererer en stående resonans bølgelengde 9. I de optiske biosensorer som er beskrevet her, er Woods anomalier brukes til å produsere en RWG biosensor at når stimulert med hvitt lys reflekterer bare veldig smalt bånd av bølgelengder (vanligvis mellom 850-855 nm).

Individuelle biosensorer består av en lav-refraktiv indeks plastmateriale med en periodisk overflatestruktur som er belagt med et tynt sjikt av høy-refraktiv dielektrisk materiale titandioksid (TiO2). Når BIOSENSeller er belyst med et bredt bølgelengde lyskilde, optisk gitter av fotoniske krystaller reflekterer et smalt område av bølgelengder av lys som blir målt av et spektrofotometer i BIND Scanner. Den toppintensitet av de reflekterte bølgelengder (Peak Wavelength verdi, eller PWV) blir deretter beregnet på grunnlag av signalet. Den PWV av lette forskyvninger ved en endring i brytningsindeksen som en følge av en økning eller reduksjon i massen inne i nærhet (~ 150 nm) av biosensor overflate. Optiske biosensorer er innlemmet i en standard Society for biomolekylære Sciences (SBS) 384-brønns mikro for analysene som brukes i disse forsøkene.

RWV biosensorer benyttes for å detektere endringer ved tilsetning av eksogene signaler i levende celler 10.. Celler blir dyrket direkte på overflaten av en RWG biosensor og endringen i den lokale brytningsindeksen er overvåket ved behandling med spesifikke stimuli. Retningen av endringen i masse på biosensor kan blifastslått, fordi en økning i den lokale brytningsindeksen resultater fra en økning i massen i nærheten av biosensor og måles som en økning i PWV. I motsatt en reduksjon i massefrembringer en reduksjon i PWV. Endringen i oppdages PWV kan skyldes en rekke cellulære hendelser, inkludert endringer i celle adhesjon, protein rekruttering / release, endocytose og gjenvinning, eksocytose, apoptose, og cytoskeletal omorganisering. For eksempel kan analysen bli oppdage endringer i kanal-protein interaksjoner mellom kaliumkanaler og andre cytoplasmiske eller cytoskeletal komponenter. Arrangementet er imidlertid må være innenfor det ~ 150 nm deteksjonssone nær biosensor, og i tilfelle av en tilknyttet cellen, nær plasmamembranen. Kjøp av cellulære responser er utført med BIND Scan-programvare og en bilderepresentasjon av hver av 384 brønner i SBS platen er generert. Dette systemet har en oppløsning på opp til 3,75 mikrometer / piksel, slik at deteksjon av hendelser i enkeltceller, ogkan brukes enten med cellelinjer (for eksempel HEK293-eller CHO-celler), eller med flere fysiologisk relevant primære celler. Bildeanalyse med BIND Vis programvaren tillater påvisning av cellulære responser i både individuelle og populasjoner av celler. Som biosensorer er inkorporert i standard SBS 384-brønners mikroplater, er systemet lett kan tilpasses til high-throughput screening (HTS).

Resonans-bølgelengde grating optiske biosensorer har tidligere blitt brukt til å oppdage endringer i masse nærheten plasma membran av celler etter aktivering av GPCR 11. Vårt laboratorium har klonet to natrium-aktivert (K Na) kaliumkanaler, Slack-B og Slick 12. Aktiviteten av begge Slack-B og sleip kanaler har vist seg å være meget sterkt påvirket ved direkte aktivering av proteinkinase C (PKC) 13. Aktivering av Gα q protein koblede reseptorer, slik som M1 muskarinreseptor og mGluR1 metabotropic glutamate receptor, regulerer potent kanal aktivitet gjennom PKC aktivering. Disse K Na-kanaler bidrar til nevronale tilpasning under vedvarende stimulering og regulere nøyaktigheten av timing av aksjonspotensialer 14. Slack kanaler er kjent for å samhandle med en rekke cytoplasmatiske signalmolekyler, inkludert FMRP, Fragile X Mental retardasjon protein 15,16. Mutasjoner i Slack resultere i flere Migrering partielle anfall av barndom (MMPSI), en tidlig debut form for epilepsi som resulterer i alvorlig forsinket utvikling 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Cell Culture (Tilpasset fra Fleming og Kaczmarek 18)

  1. Kultur-celler i passende medier for som er større enn 2, men mindre enn 10 passeringer før bruk i denne analyse. Untransfected HEK-293-celler og HEK-293 celler stabilt uttrykte rat Slack-B protein dyrkes i en halvdel Dulbeccos modifiserte Eagles medium og en halv Leibovitz L-15 medium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og antibiotika. 500 pg / ml Geneticin (G418) tilsettes til HEK-293-celler stabilt uttrykte Slack-B for å velge ut for ekspresjon av slakk kanal. Passage celler på 70-90% samløpet av dissosiasjon fra retter med en 0,25% trypsin-EDTA løsning.

2. Ekstracellulære matrise (ECM) Coating av TiO 2 384-brønners optisk Biosensor Plate med Fibronectin og Ovalbumin

  1. Preparering av fibronectin ECM blandingen og ovalbumin blokkeringsløsning
    1. Forbered en fungerende løsning av fibronecti i fosfatbufret saltvann (PBS) til en endelig konsentrasjon på 5 ug / ml fibronectin i 20,0 ml PBS. Fra en 1,0 mg / ml stamkonsentrasjon, tilsett 100 ul til 20,0 ml PBS i en 200-ganger fortynning. Arbeids oppløsning av fibronektin kan alikvotert og lagret ved -20 ° C etter fremstilling.
    2. Tilbered en 5% stamløsning av varme-inaktivert ovalbumin i sterilt vann. Fortynn ovalbumin i sterilt vevskultur kvalitetsbestemt vann for en 5%-ig oppløsning og varme-inaktivering i 30 min ved 60 ° C. Avkjøl oppløsningen til romtemperatur og sterilt filter oppløsningen. Aliquot av 5% ovalbumin løsning og oppbevar ved 4 ° C.
    3. Tilbered en 2% arbeidsoppløsning av ovalbumin ved å fortynne 5% stamløsning i PBS. For eksempel, tilsett 12,0 ml av 5% ovalbumin stamløsning til 18,0 ml PBS i et sluttvolum på 30,0 ml.
  2. 384-brønners optisk biosensor plate belegg
    1. Hydrat TiO 2 plate med 20,0 mL / brønnsterilt vevskultur grad av vann i 15 min. Følgende trinn skal utføres med en 16-kanals pipette.
    2. Vask plate 1x med 50,0 mL PBS per brønn.
    3. Til 20,0 mL av fibronektin arbeidsløsning til hver brønn og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur for å opprette ECM.
    4. Vask plate 1x med 50,0 mL PBS per brønn.
    5. Til 40,0 mL av ovalbumin arbeidsløsning til hver brønn og inkuber over natten ved 4 ° C for å blokkere plate.
    6. Vask plate 3x med 50,0 mL PBS per brønn. ECM-belagte platene kan lagres ved 4 ° C i opp til 48 timer.

Tre. Seeding av celler på 384-brønnen Optisk Biosensor Plate

  1. Fjern vekstmedier fra cellene og tilsett trypsin for å løsne cellene fra platen. Samle-celler og sentrifuger ved 1000 xg i 1 min. Fjern trypsin media og resuspender celler i vekstmedier.
  2. Ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisertcelleteller, fastslå konsentrasjonen av cellene.
  3. For å minimalisere virkningene av fordampning under inkubering blir 50,0 pl vekstmedium per brønn brukes. Celler bør fortynnes for å oppnå det ønskede antall celler per brønn i et volum på 50,0 ul vekstmedium. For disse forsøk ble det 1000 celler / brønn belagt på biosensor.
  4. Tillat seeded cellene inkuberes over natten i vekstmedium ved 37 ° C under luft / 5% CO2.

4. Utarbeidelse av biosensor og sammensatte plater for RWG Optisk Biosensor analysen

  1. Fjern platen fra inkubatoren og fjerne vekstmedier fra cellene. Vask cellene 1x med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Til 25,0 pl HBSS til hver brønn.
  2. Plasser biosensor platen på BIND skanner og tillate cellene å ekvilibrere til romtemperatur i 1-2 timer.
  3. Tilbered en separat sammensatt plate som ligander av interesse vil være added til biosensor platen under analysen. For disse assays ble 25,0 pl av oppløsningen inneholdende forbindelsen tilsatt til hver brønn på biosensor plate for et totalvolum på 50,0 pl. Som sådan, ble forbindelsene i oppløsningen fremstilt i 2 x den ønskede sluttkonsentrasjon.

5. Utfør RWG Optisk Biosensor analysen

  1. Ta en baseline måling med Scanner system for brønner A1-P12 (halvparten av SBS 384-brønns plate) med en maksimal oppløsning på 3,75 mikrometer / pixel for sentral 1,5 mm på hver brønn med BIND Scan-programvare. Dette baseline skanningen vil ta ca 30 min.
  2. Til 25,0 ul av det sammensatte løsninger til hver brønn for brønnene A1-P12.
  3. Ta en baseline måling av brønner A13-P24.
  4. Til 25,0 ul av det sammensatte løsninger til hver brønn for brønner A13-P24.
  5. Ta et innlegg sammensatt tillegg måling for brønner A1-P12, og gjenta for brønner A13-P24.

6. Analysis av analysedata med BIND Vis

  1. Åpne BIND analysedata for grunnlinjen måling i Windows, og klikk på "Grid Editor"-knappen for å aktivere valget av celler. Programvaren vil beregne beregninger av interesse definert av brukeren.
  2. Åpne "Plug-ins", som inkluderer "Cell Finder" og "baseliner"-funksjonen. Angi parametere i "Cell Finder" slik at cellene er skilles fra bakgrunnen av biosensor.
  3. Eksportere cellen kartet fil som inneholder "Cell Finder" data for baseline måling.
  4. Gjenta trinn 6.1 til 6.2 for post sammensatte tillegg data.
  5. Åpne "baseliner" plug-in og importere cellen kart fra baseline måling. Programvaren vil beregne skifte i PWV mellom bakgrunnen og etter sammensatte data.
  6. Velg "Δ Cell Mean" for produksjon av mellom skifte i PWV for cellene. Dataene kan deretter eksporteres til Microsoft Excel for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Slack-B stabilt transfekterte HEK-293 celler og kontrollerer untransfected HEK-293 celler ble sådd ved 1000 celler / brønn på 384-vel, ECM belagt RWG biosensor plater. Bilder fra den sentrale 1,5 mm 2 av biosensor ble registrert med en oppløsning på 3,75 mikrometer / pixel (Figur 1). Tettshetsgradient kart over massen ble generert pre og 30 min etter sammensatte tillegg med BIND Scan-programvare. BIND View programvare ble brukt til å bestemme skifte i PWV på GPCR agonist tillegg ved å trekke PWV innlegget sammensatte tillegg fra baseline PWV.

Den endogene M1 muskarinreseptor agonist carbamoylcholine klorid (carbachol) 19 ble brukt til både untransfected kontroll HEK-293 og rotte Slack-B stabilt uttrykker HEK-293 celler resulterte i en positiv økning i PWV (Figur 2A). Målinger ble tatt ved 30 minutter, og signalene ble normalisert til buffer bare (HBSS) additipå. Sammenlignet med kontrollcellene, hadde Slack-B transfekterte celler en større økning i peak skift i PWV. SFLLR-NH 2-trifluoracetatsalt (SFLLR), et N-terminalt TRAP pentapeptid som utviser agonistaktivitet mot den endogene protease GPCR reseptor 1 (par1), viste også differensielle responser i untransfected and Slack-B-transfekterte celler (Figur 2B). Disse resultatene viser nærværet av slakk-B-kanalen øker betydelig skifte i PWV som oppstår ved aktivering av endogene GPCR i HEK-celler, og påvise muligheten for å bruke denne analysen for å studere kanal-protein interaksjoner.

Figur 1
Figur 1. Analyse av cellulære responser i BIND View. Representative bilder av BINDScanner d ata for Slack-B stabilt transfekterte HEK-293 celler A) før og b) etter bildeanalyse med BIND View programvare "Cell Finder" plug-in. Terskler ble manuelt satt utnytte "Cell Finder" plug-in for å identifisere celler fra bakgrunnen. B) Områder vist med rødt i representerer piksler identifisert som tilhørende celler og gule linjer skille celler fra den grå plate bakgrunnen. C) Skiftet i PWV for celler ved SFLLR tillegg vises med en fargetoning, hvor rødt representerer et positivt skifte i PWV og blått representerer ingen endring. Målestokk representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

00px "/>
Figur 2. Uttrykk for Slack-B endrer skifte i PWV etter aktivering av GPCRs. A) M1 muskarinreseptor agonist carbachol (500 mm) produsert et skifte i PWV som er større i amplitude i Slack-B transfekterte celler enn kontroll HEK-293 celler ( P <0,0001, N = 16 brønner / betingelse). B) Anvendelse av SFLLR (10 pM), et N-terminalt TRAP pentapeptid som utviser agonistaktivitet mot GPCR endogene protease-reseptor 1 (par1), produserte et skifte i PWV respons som er større i amplitude i Slack-B-transfektert celler enn i kontroll HEK-293 celler (P <0,0001, N = 16 brønner / tilstand). Målinger utført 30 Min antall innlegg sammensatte tillegg og ligand respons normalisert til buffer eneste kontrollen. Feil barer er ± SEM. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Z-prime (Z ')-faktoren er en vanlig statistisk metode for å kvantifisere kvaliteten av en high-throughput screening-analyse 20, og fordi screening av GPCR-agonister i denne analysen skjedde i en SBS kompatibelt 384-brønn assay, gir en utmerket mål på robusthet og gyldigheten av denne analysen 21. AZ 'verdi på 1 indikerer en teoretisk ideell analysen med et uendelig antall datapunkter med ikke-eksisterende standardavvik. AZ 'verdi på mellom 0,5-1 er ansett som et utmerket analyse for high-throughput screening formål, med under 0,5 regnes som et marginalt informativ analysen. For dette datasettet er den beregnede Z 'verdi utnytte carbachol en SFLLR som positive kontroller på henholdsvis 0,79 og 0,81, noe som indikerer denne analysen er meget robust, og det oppnådde resultat er av stor betydning.

Ekstracellulær matriks-belegg på 384-brønners optisk biosensor plate, celle såing, og forbindelse tilleggI disse eksperimentene ble utført manuelt med en 16-kanals Finnpipette (5-50 ul). Når denne analysen blir utført på et SBS-plate, kan mer avanserte robotvæskebehandlingssystemer brukes i high throughput screening. Men når tilpasse systemene for væskehåndtering instrumentering, forsiktighet bør utvises for å sikre at pipetter ikke berøre biosensor overflaten da dette vil føre til skade på biosensor.

Ved tilsetting forbindelser oppløst i DMSO, må analysen utføres slik at sluttkonsentrasjonen av DMSO i analysen mediet holdes konstant for å unngå en vridning av PWV grunn DMSO toksisitet til cellen ("DMSO sjokk"). Selv om forskjellige cellelinjer er differensielt reagerer på DMSO i denne analysen, anbefales det at den endelige konsentrasjonen av DMSO ikke overstiger 0,1 til 0,2 volum-%. Celler bør inkuberes i den endelige konsentrasjon av DMSO i forsøksbuffer i løpet av temperaturstabilisering trinn av denne protokoll for å unngå solvent-indusert endringer i PWV.

Et variert utvalg av celler, inkludert primære celler, kan bli undersøkt med denne analysen, selv om optimaliseringen av analysen for hver cellelinje må utføres. Ved bruk av forskjellige celletyper, bør optimalisering av antall celler og ekstracellulær matriks-biosensor overflatebehandlinger skal utføres. Celler bør utsådd på forskjellige tettheter mellom 1,000-15,000 celler / brønn og behandlet med et kjent reseptor agonist for å bestemme hvilken tetthet gir høyest Z '. Forskjellige ECM overflatebelegg, inkludert men ikke begrenset til fibronectin, kollagen og laminin, enten alene eller i kombinasjon, bør testes for å sikre at cellene forbli vedheftende til det biosensor under analysen. Cell sult (manglende serum) kan påvirke cellulær respons i denne analyse, og som slike forsøk kan utføres i serumfrie og serumholdige medier for innledende analysen optimalisering formål. Den høye oppløsningen av BIND Scanner etikett gratispåvisning muliggjør responsmålinger som skal kvantifiseres ved lav celletetthet, siden analysen av cellulære responser kan være begrenset til bare de kontaktes av celler piksler. I tillegg kan subpopulasjoner av celler i en heterogen blanding bli avgrenset basert på flere parametere (inkludert størrelsen og styrken av celleadhesjon) og målt for de enkelte cellulære responser. Samlet utgjør disse egenskapene gjør BIND Scanner ideell for analyser som involverer primære dyrkede celler.

BIND Scanner systemet tillater målinger for å bli tatt over en bestemt tid-kurs, og derfor time-lapse målinger av endringer i PWV kan registreres. Dette er spesielt nyttig for måling av endringer i celle oppførsel som oppstår over en lengre tidsperiode enn de som skyldes kanal-protein interaksjoner, inkludert celleproliferasjon, celledelingen, og cellemigrasjon. BIND View programvare åpner for analyse av slike cellulære responser, og kan kvantifisere mange parameteretrs av endringer i cellestrukturen, inkludert endringer i celle tilslutning, endringer i celle volum, og endringer i celle bevegelse, slik at både kvantitativ analyse og time-lapse avbildning av disse hendelsene. For eksempel kan dette system benyttes for å bestemme den hastighet som fibroblaster svare på vekstfaktor signalering ved å spore hastigheten av cellemigrasjon på tvers av en enkelt brønn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Steven M. Shamah er ansatt i X-BODY biovitenskap.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige til Dr. Yangyang Yan i laboratoriet av Dr. Fred Sigworth ved Yale University for den generøse donasjonen av HEK293 celler stabilt uttrykte rotte Slack-B protein. I tillegg forfatterne er takknemlige til Dr. Sigworth for Cryo-elektron mikros homologi modell av Slack som vises i videoen innledningen. Denne forskningen ble støttet av NIH Grants DH067517 og NS073943 til LKK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, High Glucose Life Technologies 11965-092
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Geneticin G-418 Sulfate American Bioanalytical AB05057
HBSS Life Technologies 14025-092
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5378
DPBS Life Technologies 14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6
Carbamoylcholine chloride Sigma-Aldrich C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt Sigma-Aldrich S8701
Finnpipette (5-50 µl) Thermo Scientific 4662090
BIND Scanner System X-BODY Biosciences N/A
384-well TiO2 coated plates X-BODY Biosciences TiO-96-CM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
  2. Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
  3. Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
  4. Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
  5. Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
  6. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
  7. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
  8. Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
  9. Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
  10. Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
  11. Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
  12. Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
  13. Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
  14. Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
  15. Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
  16. Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
  17. Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
  18. Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
  19. Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
  20. Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  21. Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).

Tags

Bioteknologi Ionekanaler kalium kanal slakk G-protein koblede reseptorer (GPCR) etikett-free screening high-throughput screening (HTS) kanal-protein interaksjoner optiske biosensorer
Bruk av Merkfritt Optiske biosensorer til Detect Modulation av kaliumkanaler av G-protein koblede reseptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, M. R., Shamah, S. M.,… More

Fleming, M. R., Shamah, S. M., Kaczmarek, L. K. Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (84), e51307, doi:10.3791/51307 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter