Summary
광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.
Abstract
이온 채널을 선택적으로 이온이 플라즈마 막 (1)을 통해 흐르게함으로써 뉴런 및 다른 흥분성 세포 유형의 전기적 특성을 제어한다. 신경 세포의 흥분성을 조절하기 위해, 이온 채널의 생물 리 학적 특성은 종종 이종 체 채널 착물 2,3을 형성하는 채널 자체에 바인딩 신호 단백질 및 분자에 의해 수정된다. 살아있는 세포에서의 상호 작용의 시간 경과에 적은 정보를 제공하면서 채널 및 규정 단백질 사이의 상호 작용을 조사 전통적인 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수 외인성 라벨을 필요로한다. 이러한 X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너 시스템과 광 바이오 센서는, 공명의 변화를 감지하는, 새로운 라벨이없는 기술, 공진 파장 격자 (RWG) 광 바이오 센서를 사용하는 바이오 센서 주변의 빛을 반영합니다. 이 분석은 허용 상대 검출세포 접착의 리간드 유도 변화 확산 독성, 증식 및 세포막 근처 단백질 - 단백질 상호 작용의 변화로 인해 발생하는 바이오 센서의 표면에 부착 한 생세포의 바닥 부 내에 질량 변화. RWG 광 바이오 센서는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에), 수용체 티로신 키나아제, 및 다른 세포 표면 수용체의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 이온 채널 단백질 상호 작용의 리간드에 의한 변화는이 분석을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 한산한-B 나트륨 활성화 칼륨 GPCR에 의해 (K 나) 채널의 변조를 감지하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다.
Introduction
생리 학적으로 중요한 상황에서 살아있는 세포를 검사하는 표적 세포의 생물학적 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 채널과 같은 coimmunoprecipitation 분석법 규제 세포질 단백질 사이의 상호 작용을 조사 분석법은 일반적으로 살아있는 세포의 상호 작용의 시간 경과에 약간의 정보를 제공한다. 현재 셀 기반 분석의 대부분은 그 찬란 태그 단백질의 전위와 같은 특정 세포 이벤트를 측정합니다. 이러한 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수있다 또한 단백질의 변형을 요구한다. 시스템의 조작을 필요로 세포 활동의 연속 측정을 제공하고 그들의 가장 생리 학적으로 관련 국가 4 세포의 연구를 허용하지 않는 비 침습적 인 세포 기반 분석.
광 바이오 센서를 생산하도록 설계센서 표면에 결합되는 광의 특성에 측정 가능한 변화. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 공진 파장 격자 (RWG) 기법을 포함 소멸 파를 이용하는 광 바이오 센서는, 주로, 센서 표면에 고정 생물학적 수용체에 결합하는 분자의 친화도 및 반응 속도를 검출하기 위해 사용되어왔다. 최근 시판 RWG 바이오 센서는 높은 공간 해상도 (최대 3.75 μM / 픽셀) 5에서 센서 표면에 부착 한 세포의 바닥 부 내의 질량 상대적인 변화의 검출을 허용하도록 개발되었다. 이러한 바이오 센서는 세포 부착 및 퍼짐, 독성, 증식 및 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에) 포함하여 세포 표면 수용체의 다양한 의해 유도 신호 전달 경로와 같은 자극으로부터 발생 살아있는 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지 할 수있는 6 . RWG 바이오 센서는 상대적으로 찬 검출바이오 센서 (7)의 150 nm의 사이에서 질량 상대적인 변화의 함수로서 굴절률의 GE. 세포를 바이오 센서에 도금되는 경우, 굴절률의 변화는 바이오 센서에 부착 세포의 변화로 인한 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 반영. 이 프로토콜은 RWG 바이오 센서를 사용하여 채널의 단백질 상호 작용의 검출에 대해 설명합니다.
RWG 데이터 수집 시스템의 몇 가지 요소로 구성됩니다. X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너가이 실험에 사용 되었기 때문에, 우리는 플레이트 리더, 관련 바이오 센서, BIND 스캔 수집 소프트웨어, BIND보기 분석 소프트웨어 8로 구성이 특정 시스템의 구성 요소를 참조해야한다. 광자 결정 바이오 센서는, 광학 바이오 센서를 이하에서 언급 할의주기적인 배열로 구성되어 특정의 빛의 전파를 방지한다 2 또는 3 차원의 유전체 재료파장 및 방향. 광자 결정 구조는 나무의 변종이라는 현상을 기반으로합니다. 처음으로 1902 년에 발견 목재, 이러한 변이는 특히 회절 차수의 세기의 급격한 변동이 소정의 좁은 주파수 대역에서 발생하는 광 회절 격자에 의해 반사되는 빛의 스펙트럼에서 관찰 된 효과이다. 1962 년 Hessel의 및 Oliner 유한 기간의 격자가 서 공명 파장 9를 생성하는 나무의 이상 현상의 새로운 이론을 제시했다. 여기에 설명 된 광 바이오 센서에서 나무의 이상이 흰색 빛으로 자극하는 경우가 파장 만 매우 좁은 밴드 (대표적으로는 850-855 nm의) 반영 RWG 바이오 센서를 생산하는 데 사용됩니다.
개별 바이오 센서는 높은 굴절률 유전체 이산화 티탄 (티오이)의 얇은 층으로 코팅되어 주기적 표면 구조를 가진 저 굴절률 플라스틱 재료로 구성되어있다. 때 biosens또는 광자 결정의 광 격자가 BIND 스캐너에서 분광 광도계로 측정되는 빛의 파장의 좁은 범위를 반영하는 광범위한 파장의 광원으로 조명된다. 반사 된 파장 (피크 파장 값 또는 PWV)의 피크 강도는 그 신호로부터 계산된다. 바이오 센서 표면의 근접성 내의 질량의 증가 또는 감소 (~ 150 nm 정도)의 결과로서 굴절율의 변화에 따라 빛 시프트 PWV. 광 바이오 센서는 생명 과학을위한 표준 협회 (SBS) 이러한 실험에 사용 된 분석을위한 384 - 웰 마이크로 플레이트에 통합됩니다.
RWV 바이오 센서는 셀 10 생활에 외인성 신호의 추가에 변화를 감지하는 데 사용됩니다. 세포를 직접 RWG 바이오 센서의 표면 상에 배양하고 굴절 로컬 인덱스의 변화는 특정 자극 치료시 모니터링된다. 바이오 센서의 질량의 변화의 방향이 될 수있다로컬 바이오 센서 근처의 질량 증가로 굴절 결과의 인덱스의 증가는 PWV의 증가로서 측정되기 때문에, 결정. 반대로 질량 감소는 PWV의 감소를 생성한다. 검출 PWV의 변화는 세포 접착의 변화, 단백질 모집 / 해제, 엔도 시토 시스 및 재활용, 세포 외 유출, 세포 사멸 및 세포 골격의 재 배열 등 다양한 세포 사건에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 분석은 칼륨 채널 및 다른 세포질 또는 세포 골격 성분 간의 채널 단백질 상호 작용의 변화를 검출 할 수있다. 이벤트는, 그러나, 바이오 센서 근처 ~ 150 nm의 검출 영역 내에서 발생하고, 세포막 근처 연결된 셀의 경우한다. 세포 반응의 취득은 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 수행되며 SBS 플레이트의 웰 (384)의 각각의 이미지 표현이 생성된다. 이 시스템은 하나의 셀에있는 이벤트의 검출을 허용 최대 3.75 μM / 화소의 해상도를 가지며,(예 : HEK293 또는 CHO 세포와 같은) 세포 라인 이상 생리학 관련 기본 세포로도 사용할 수 있습니다. BIND View 소프트웨어와 이미지 분석은 개별 세포의 인구 모두에서 세포 반응의 검출을 할 수 있습니다. 바이오 센서는 마이크로 플레이트 384 - 웰 표준 SBS에 통합됨에 따라, 시스템은 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 용이하게 적응할 수있다.
공진 파장 격자 광 바이오 센서 (11)는 이전의 GPCR의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 우리 연구소는 두 나트륨 활성화 (K NA) 칼륨 채널, 슬랙-B와 슬릭 (12)를 복제했다. 둘 다 B 흔들림 매끄러운 채널의 활성이 매우 강력한 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화 (13)의 직접적인 영향을받을 것으로 나타났다. 이러한 M1 무스 카린 수용체와 mGluR1 대사성 글루타메이트 R 등 Gα Q의 단백질 결합 수용체의 활성화eceptor, 유력 PKC 활성화를 통해 채널의 활동을 조절한다. 이러한 K 나 채널은 지속적인 신경 자극 동안 적응 올릴 액션 타이밍의 정확도는 14 전위 조절. 여유 채널 FMRP, 허약 한 X 정신 지체 단백질 (15, 16)를 포함하여 세포질 신호 분자의 다양한 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 유년기 (MMPSI), 심한 발달 지연 (17) 결과 간질의 조기 발병 형태의 다수의 마이그레이션 부분 발작의 여유 결과 돌연변이.
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Protocol
1. 세포 배양 (플레밍과 Kaczmarek 18에서 적응)
- 2보다 큰 미만 10 구절이 분석에서 사용하기 전에 적절한 미디어 문화 세포. 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포와 HEK-293 세포는 Leibovitz의 L-15 중간 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청과 항생제로 보충 절반 둘 베코의 수정 된 이글 매체와 반에서 재배된다. 500 ㎍ / ㎖의 네티 (G418)를 안정적으로 여유 채널의 발현을 선택 한산한-B를 표현하는 HEK-293 세포에 첨가된다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액으로 요리에서 분리하여 70-90%의 합류 통로 세포.
2. 피브로넥틴 및 오발 부민과 티오 2 384도 광 바이오 센서 플레이트의 세포 외 기질 (ECM) 코팅
- 피브로넥틴 ECM 혼합물 및 알부민 블로킹 용액의 조제
- fibronect의 작업 솔루션을 준비합니다20.0 ㎖의 PBS에서 파이브로 넥틴의 5 μg / ML의 최종 농도와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서. 1.0 ㎎ / ㎖의 주식 농도에서 200 배 희석 20.0 ㎖의 PBS 100 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 작업 솔루션을 준비 후 분주 및 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 멸균 열 불 활성화 알부민의 5 % 주식 솔루션을 준비합니다. 5 % 용액과 무균 조직 배양 등급 물에 알부민을 희석하여 60 ℃에서 30 분 동안 열 불 활성화 실온 및 살균 필터 솔루션 용액을 냉각. 4 ° C에서 5 % 알부민 용액과 상점을 나누어지는
- PBS로 5 % 스톡 용액을 희석하여 알부민의 2 % 작동 용액을 준비한다. 예, 30.0 ML의 최종 볼륨 PBS의 18.0 ml의 5 % 알부민 원액의 12.0 ML을 추가합니다.
- 384도 광 바이오 센서 플레이트 코팅
- 20.0 μL / 잘와 티오 2 판을 수화물15 분 동안의 무균 조직 배양 등급 물. 다음 단계는 16 - 채널 피펫으로 수행되어야한다.
- 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오.
- 각 웰에 피브로넥틴 작업 솔루션의 20.0 μl를 추가하고 ECM을 만들 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
- 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오.
- 물론 각 알부민 작업 솔루션의 40.0 μl를 추가하고 판을 차단하는 4 ° C에서 밤새 품어.
- 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 판 3 배를 씻으십시오. ECM 코팅 된 플레이트는 최대 48 시간 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 384도 광 바이오 센서 접시에 세포의 파종
- 세포에서 성장 미디어를 제거하고 접시에서 세포를 이동시키다 트립신을 추가합니다. 세포를 수집하고 1 분 1,000 XG에 원심 분리기. 성장 미디어 트립신 미디어에 resuspend 세포를 제거합니다.
- 혈구 나 자동화를 사용하여셀 카운터, 세포 농도를 결정한다.
- 배양 중에 증발의 영향을 최소화하기 위해, 웰 당 성장 배지 50.0 μL가 사용될 것이다. 세포를 성장 배지 중에서 50.0 μL의 부피 웰 당 세포의 원하는 수를 달성하기 위해 희석되어야한다. 이 실험을 위해, 1,000 세포 / 웰 바이오 센서에 도금했다.
- 시드 세포가 공기 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 성장 배지에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다.
4. RWG 광 바이오 센서 분석을위한 바이오 센서 및 복합 플레이트의 제조
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포 성장 매체를 제거합니다. 세포 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 1x는 씻으십시오. 각 웰에 HBSS의 25.0 μl를 추가합니다.
- BIND 스캐너에 바이오 센서 플레이트를 놓고 세포가 1 ~ 2 시간 동안 실온으로 평형을 할 수 있습니다.
- 그 리간드가 광고됩니다되는 별도의 복합 플레이트를 준비분석 기간 동안 바이오 센서 판에 공격 한. 이러한 분석은 솔루션 함유 화합물의 25.0 μL은 50.0 μL의 총 볼륨의 바이오 센서 플레이트에 각 웰에 첨가 하였다. 따라서, 용액 중의 화합물 2X 원하는 최종 농도로 제조 하였다.
5. RWG 광 바이오 센서 분석을 수행
- 잘 BIND 스캔 소프트웨어를 사용하여 각의 중심 1.5 mm에 4,125 μm의 / 픽셀의 최대 해상도를 사용하여 우물 A1-P12 (SBS 384 - 웰 플레이트의 절반)의 스캐너 시스템과 기준 측정을 가져 가라. 이 기준 검사는 약 30 분 소요됩니다.
- 우물 A1-P12에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다.
- 웰스 A13-P24의 기준 측정을 가져 가라.
- 웰스 A13-P24에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다.
- 우물 A1-P12에 대한 게시물 화합물 첨가 측정을하고, 우물 A13-P24에 대해 반복합니다.
6.BIND보기와 분석 데이터의 (분석)
- Windows의 기본 측정을 위해 BIND 분석 데이터를 열고, 셀 선택을 가능하게하는 "그리드 편집기"버튼을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 사용자가 정의한 그 통계를 계산합니다.
- "셀 찾기"와 "Baseliner"기능을 포함하는 "플러그 - 인"을 엽니 다. "셀 찾기"에서 매개 변수를 설정 세포는 바이오 센서의 배경과 구별되도록.
- 기준 측정을위한 "셀 찾기"데이터가 포함 된 셀의 맵 파일을 내 보냅니다.
- 반복 포스트 화합물뿐만 아니라 데이터에 대한 6.1-6.2 단계를 반복합니다.
- "Baseliner"플러그를 열고 기준 측정에서 세포 맵을 가져옵니다. 이 소프트웨어는 배경과 포스트 화합물 데이터 사이의 PWV의 변화를 계산합니다.
- 세포에 대한 PWV의 평균 변화의 출력은 "Δ 셀 평균"을 선택합니다. 데이터는 마이크로 소프트 EXC로 내보낼 수 있습니다추가 분석을 위해 엘.
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Representative Results
한산한-B 안정적 HEK-293 세포를 형질 전환 및 제어 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포는 물론 384도, ECM 코팅 RWG 바이오 센서 접시에 1,000 세포 /에 씨앗을 품고 있었다. 바이오 센서의 중앙 1.5 mm 2의 이미지는 4,125 μm의 / 픽셀의 해상도 (그림 1)을 기록했다. 질량 밀도 구배지도는 사전 생성 및 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 30 분 후 화합물 첨가 하였다. BIND보기 소프트웨어는베이스 라인 PWV에서 PWV 포스트 화합물의 추가 감산하여 GPCR 작용제 추가시 PWV의 변화를 결정하기 위해 이용되었다.
내인성 M1 무스 카린 수용체 작용제 carbamoylcholine 클로라이드 (카바 콜)가 19 안정적 HEK-293 세포는 PWV의 긍정적 증가 (도 2A)였다 발현 형질 감염되지 않은 제어 HEK-293 및 래트 슬랙-B 모두에 적용 하였다. 측정은 30 분에서 찍은 및 신호 (HBSS) 책상 외에도 전용 버퍼 정상화되었다에. 대조군 세포에 비해 여유-B 형질 전환 된 세포는 PWV의 피크 시프트의 더 큰 증가가 있었다. SFLLR-NH 2 트리 플루오로 아세트산 염 (SFLLR), 내생 GPCR 프로테아제 활성화 수용체 1 (PAR1)에 대해 작용제 활성을 나타내는 N-말단 TRAP의 펜타는 또한 형질 감염되지 않은 및 슬랙-B 형질 전환 된 세포 (도 2B)에서 차동 반응을 보였다. 이러한 결과는 슬랙-B 채널의 존재가 현저 HEK 세포에서 내인성의 GPCR의 활성화시에 발생 PWV의 변화를 증가 시키며, 채널 - 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 상기 분석을 사용하는 가능성을 입증 보여준다.
그림 1. BIND보기에 세포 반응의 분석. BINDScanner D의 대표 이미지 ATA 한산한-B 안정적으로 형질 전환 된 HEK-293 세포에 대한 A) BIND보기 소프트웨어 "셀 찾기"플러그인과 이미지 분석 후) 전에 B. 임계 값을 수동으로 "셀 찾기"플러그 - 인 배경. B의 세포를 식별하는) 셀과 노란색 라인에 속하는 것으로 확인 된 픽셀을 나타내는 빨간색에 도시 지역은 회색 접시 배경 PWV합니다. C) 변화 세포를 구분을 이용하여 설정 한 SFLLR 추가에 따라 세포는 빨간색 PWV과 파란색에 긍정적 인 변화를 나타내는 색 그라데이션으로 표시됩니다에이 변화를 나타냅니다 없습니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. 한산한-B의 발현은 GPCR에.) M1 무스 카린 수용체 작용제 카바 콜 (500 μM)를 제어 HEK-293 세포보다 한산한-B 형질 세포에서 진폭이 큰 PWV의 변화를 생산의 활성화 다음 PWV의 변화를 (변경 SFLLR (10 μM), GPCR 내인성 단백질 분해 효소 활성화 수용체 1 (PAR1)에 대한 효능 제 활성을 나타내는 N-말단 트랩 펜타의 P <0.0001, N = 16 웰 / 상태). B) 응용 프로그램, PWV 응답의 변화를 생산 즉, 컨트롤에 비해 여유-B-형질 세포의 진폭 HEK-293 세포 (P <0.0001, N = 16 웰 / 상태) 더 크다. 측정은 30 분 후 화합물의 첨가를 기록하고, 리간드 응답은 컨트롤을 버퍼에 정상화되었다. 오차 막대는 ± SEM 있습니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
Z 프라임 (Z ') 요소는 높은 처리량 스크리닝 검사 (20)의 품질을 정량화하는 일반적인 통계 방법이며,이 분석에서 GPCR 작용제의 심사 SBS 호환 384 잘 분석에서 발생했기 때문에, 훌륭한을 제공합니다 이 분석 (21)의 안정성과 유효성의 측정. 1 애리조나 '값이 존재하지 않는 표준 편차와 데이터 포인트의 무한한 번호를 이론적으로 최적의 분석을 나타냅니다. 0.5 이하의 소폭 정보를 분석 간주과 0.5 사이의 알파벳 '값은 높은 처리량 검사 목적을위한 훌륭한 분석 간주됩니다. 이 데이터 집합에 대한 긍정적 인 컨트롤로 SFLLR carbachol을 활용하여 계산 Z '값이 분석은 높은 견고하고 얻어진 결과가 높은 중요 나타내는은 각각 0.79 0.81합니다.
384도 광 바이오 센서 플레이트, 세포 파종 및 화합물 첨가의 세포 외 기질 코팅이 실험에서 16 채널 Finnpipette (5-50 μL)을 사용하여 수동으로 수행되었다. 이 분석은 SBS 플레이트에서 수행되기 때문에, 더 진보 된 로봇 액체 운반 시스템은 고 처리량 스크리닝에 사용될 수있다. 액체 취급 계측 시스템을 적응 그러나, 치료는이 바이오 센서에 손상을 일으킬 것 같은 그 피펫 팁 바이오 센서의 표면을 만지지 않도록하는 운동을해야한다.
DMSO에 용해의 화합물을 첨가 할 때 분석 배지에서 DMSO의 최종 농도는 세포에 의한 DMSO 중독에 PWV의 변화 ( "DMSO 충격")을 방지하기 위해 일정하게 유지되도록, 분석이 수행되어야한다. 다른 세포주는이 분석에서 DMSO에 차별적으로 반응하지만, 우리는 DMSO의 최종 농도가 0.1 ~ 0.2 체적 %를 초과 할 것을 추천합니다. 세포 solven을 피하기 위해이 프로토콜의 온도 평형 단계에서 분석 완충액에서 DMSO의 최종 농도에서 배양해야PWV의 T-유도 이동합니다.
각 세포주에 대한 분석의 최적화를 수행해야하지만 기본 세포를 포함한 세포의 다양한 범위는,이 분석으로 연구 할 수있다. 서로 다른 종류의 세포를 사용하는 경우, 세포와 세포 외 기질 바이오 센서 표면 코팅의 수의 최적화가 수행되어야한다. 세포는 1,000-15,000 세포 / 웰 사이에 다양한 밀도에서 시드 가장 높은 Z '를 생산하는 밀도를 결정하는 알려진 수용체 길항제로 치료해야합니다. 을 포함하되, 단독 또는 조합하여, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 및 제한되지 각종 ECM 표면 코팅, 세포 분석시 상기 바이오 센서에 점착 유지되도록 시험을한다. 세포 고갈 (혈청 부족)이 분석에서 세포 반응에 영향을 미치는, 이러한 실험은 초기 분석 최적화를 위해 무 혈청 및 혈청 - 함유 배지에서 수행 될 수 있으므로. 수도 BIND 스캐너의 라벨 무료의 높은 해상도세포 반응의 분석은 세포에 의해 연락 만 화소로 제한 할 수 있기 때문에 탐지가 낮은 세포 밀도에 정량에 대한 응답으로 측정 할 수 있습니다. 또한, 이종 혼합 내의 셀의 모집단은 게이트 (크기 및 세포 접착의 강도 등) 여러 파라미터들에 기초 할 수 있고, 각각의 세포 반응을 측정. 이와 함께, 이러한 기능은 기본 배양 된 세포를 포함하는 분석에 대한 BIND 스캐너에 이상적이다.
BIND 스캐너 시스템은 측정이 지정된 시간에 걸쳐 촬영하는, 따라서 PWV의 변화의 시간 경과 측정 기록 할 수 있습니다. 이것은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 이동을 포함한 채널 - 단백질 상호 작용에 의한 것보다 더 긴 시간 기간에 걸쳐 발생할 세포 행동의 변화를 측정하는데 특히 유용하다. BIND보기 소프트웨어는 세포 반응의 분석을 위해 수, 그리고 수많은 paramete을 정량화 할 수, 세포 부착의 변화, 세포 부피의 변화와 세포의 움직임의 변화를 포함하여 정량 분석과 이러한 이벤트의 시간 경과 영상을 모두 허용하는 세포 구조의 변화의 RS. 예를 들어,이 시스템은 섬유 아세포가 아니라 개별 걸쳐 세포의 이동 속도를 추적함으로써 시그널링 성장 인자에 반응 속도를 결정하는데 사용될 수있다.
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Disclosures
스티븐 M. Shamah는 X - BODY 생명 과학의 직원입니다.
Acknowledgments
저자는 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 관대 한 기부에 대한 예일 대학에서 박사 프레드 Sigworth의 실험실에서 박사 양양 얀에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 저자는 비디오 소개에 표시 여유의 극저온 전자 현미경 상 동성 모델의 박사 Sigworth에게 감사의 말씀을 전합니다.이 연구는 LKK에 NIH 보조금 DH067517 및 NS073943에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
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