Summary
Den mest studerte aspekt av biokompatibilitet av dental-kompositter er deres cytotoksisitet 3D CLSM tidsforløp avbildning kombinert med fluorescerende signal kvantifisering tillater sensitiv evaluering av celle skjebne over tid. Benytte denne metoden kan være et effektivt verktøy for å vurdere cytocompatibility tann kompositter.
Abstract
Det er generelt akseptert at in vitro-cellemateriale interaksjon er et nyttig kriterium for evalueringen av dentalmateriale biokompatibilitet. Målet med denne studien var å bruke 3D CLSM time lapse confocal bildebehandling for å vurdere in vitro biokompatibilitet av dental kompositter. Denne metoden gir en nøyaktig og følsom indikasjon på levedyktige cellerate i kontakt med tann kompositt ekstrakter. ELS ekstra lav krymping, en dental kompositt brukes for direkte restaurering, har blitt tatt som eksempel. In vitro vurdering ble utført på dyrkede primære humane gingivale fibroblastceller bruker Live / Død farging. Bilder ble oppnådd med FV10i confocal biologiske invertert system og analysert med FV10-ASW 3.1 Software. Bildeanalyse viste en meget svak cytotoksisitet i nærvær av de testede kompositten etter 5 timers tidsforløp. En liten reduksjon i cellelevedyktighet ble vist i kontakt med den testede sammensatte ekstrakter komparativeed å kontrollere celler. Funnene fremhevet bruken av 3D CLSM tid forfalle billeddiagnostikk som en sensitiv metode for å kvalitativt og kvantitativt vurdere biokompatibilitet oppførselen til dental kompositter.
Introduction
En av de viktigste standardene sitert i ISO-anbefalinger for å definere biokompatibilitet er fraværet av materiale giftighet for cellene. Harpiks-baserte dental-kompositter kan frigi komponenter fra harpiksmatrise, som kan være opprinnelig på grunn av partiell polymerisasjon, og / eller senere på grunn av nedbrytningsprosesser over tid 1-4. Disse utgitt komponenter kommer i kontakt med orale vev og kan ha forskjellige ulemper som urtikarielle og slimhinne reaksjoner 5, utvikling av allergi og overfølsomhetsreaksjoner hos pasienter 6, modifikasjoner av gingivale fibroblaster morfologi og reduksjon på type I-kollagen protein 7, immunosuppression eller immunstimulering på mitogen -driven spredning av renset T-lymfocytter og miltceller 8 og DNA-skader i primære humane gingivale fibroblaster, som understreker deres gentoksisk potensial 9. Mange parametere kan påvirke tannkompositt toksisitet som for eksempel skyggen av composite, herdelampetid, den kjemiske sammensetningen av harpiksmonomeren, fyllstoffet og graden av omdannelse 10- 13. Etter in vitro-toksisk potensial av materialer kan forutsi in vivo-situasjoner, og kan sammenlignes med kliniske situasjoner ved studiet av noen relevante sluttpunkter. Cytotoksisiteten til dental kompositter og deres komponenter har blitt mye evaluert ved hjelp av cellekultursystemer 14- 16.
Disse in vitro-systemer har blitt utviklet for å vurdere dental-kompositter biokompatibilitet på sikt av: cellevekst, og celle apoptose ved hjelp av THP-1monocytes som cellene 17, cytotoksisitet i humane gingivale fibroblaster 18, keratinocytter som to celler, cellefunksjonalitet inflammatorisk potensial i HaCaT odontoblast- som MDPC-23 celler 19, reduksjon av totale RNA-nivåer, og betydelig økning i induksjon av apoptose på menneskelig gingival keratinocytter 20 ogDNA-skade på gingivale og papirmasse fibroblastceller 21.
Ulike metoder er foreslått å undersøke biokompatibilitet av dental kompositter. Kolorimetriske analyser som involverer spesifikke fargestoffer og lette adsorpsjon målinger, forblir den mest brukte, på grunn av deres relative enkelhet og lav kostnad 22- 26. Mikros analyse av lys kontrast ofte bruker mer tid og pådrar seg høyere kostnader. Imidlertid er disse mikroskopi teknikker har noen viktige fordeler. Observasjonen av cellestrukturen gir utvidet informasjon om opplevd toksiske effekter, og dermed gi mer relevante og sensitive data. Spesielt har innføringen av konfokal mikroskopi tillot 27 for observasjon av biologiske strukturer med bedre aksial oppløsning sammenlignet med tradisjonelle bredfeltavbildnings fluorescensmikroskoper. Derfor har konfokal bildebehandling blitt et kraftig undersøkende verktøy i ulike felt avmedisinske og naturvitenskapelige forskere. I motsetning til elektronisk mikroskopi-teknikker, skanning konfokal mikroskopi har evnen til å visualisere forskjellige komponenter av celler ved innlemmelse av bestemte fluoriserende markører. De fleste av disse spesifikke tracere er stabile i et vandig miljø, fornuftig målbar, billig og ikke-toksisk 28, slik at deres anvendelse i kliniske laboratorier, samt forskningsstudier. Videre er det ikke nødvendig for tidsinnstilte konfokal avbildning prøven tørking og fiksering som kreves for konvensjonell elektronisk mikroskopi-analyse, er således tidsavhengig kjøpet også mulig på prøver. Sammenlignet med den todimensjonale avbildning, gjør det mulig for konfokal bildeprinsipp en prøve under overflaten visualisering og den tredimensjonale struktur rekonstruksjon av de forskjellige oppnådde dybdebilder; noe som resulterer i mer nøyaktige og mer strukturelle detaljer 29, 30. Den foreliggende video-studien er et eksempel på bruk av tredimensjonal intervall Confocal Laser Skanning Mikroskopi (3D-CLSM) kombinert med live / Døde fluorescerende merking og signal kvantifisering som en innovativ metode. Den teknikk som presenteres i dette papiret har fordelen av å muliggjøre evaluering følsom og tidsserie avbildning av levende celler uten å endre ligningscellestruktur. Ingen forberedelse trinn er nødvendig før konfokal analyse. Tidligere var det samme farging brukes for å vurdere levedyktigheten til dyrkede spongiosa kjerner 31, men uten konfokal time-lapse følgende. Tilsvarende den samme tidsforsinkelse konfokal fremgangsmåte ble brukt for å vurdere tids erytromycin-kill aktivitet i bakterier av aktivert slam i henhold til deres Gram Type 32 ved hjelp av en bestemt bakterie Lev / døde flekker. Disse fremgangsmåter er nylig blitt tilpasset og brukt til å sammenligne toksisiteten av dental-kompositter basert på metakrylatmonomerer 11.
Protocol
Protokollen består av tre trinn: det første trinnet omfatter utarbeidelse av kompositt ekstrakt i kultur media; Det andre gjelder primære humane Gingival fibroblaster (HGF) cellekultur, kontakt av celler med de sammensatte ekstrakter og cellefarging; det tredje trinn består av konfokal avbildning og det fluorescente signalet analyse. For gingivale vev å ta, ble protokollen godkjent i henhold til fransk lov, informert samtykke og lokal etisk komité.
1. Composite Ekstrakter Forberedelse
Bruk Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) som elueringsmiddel medium. Sørge for at forholdet mellom overflatearealet av prøvene og volumet av ekstraksjonsmediet er på det laveste nivået av de ISO 10993/12 krav. Fremgangsmåten er nylig beskrevet 11 og skissert kort nedenfor:
- Dannelse av sfæriske prøver av det uherdede kompositttann ved hjelp av en skreddersydd holdeh. Holderen størrelse er 2 mm i radius, som er i overensstemmelse med generelt anbefalt herdedybden i munn klinisk behandling.
- Forbered platebrønnene, hver inneholdende 1 ml kulturmedium (DMEM), med en 5% blanding av penicillin / streptomycin, 1% av amfotericin, men uten føtalt bovint serum (FBS).
- Cure prøver innenfor brønnen inneholder DMEM medium ved hjelp av en LED-lys lampe med en 1070 mW cm -2 intensitet (λ = 465-475 nm) i 40 sekunder. Sørge for at avstanden mellom herdespissen og prøvene er i området på 0,5 mm. Bruk av dette herdemodus for å simulere den midlertidige kontakt mellom tann og den ikke-herdede dental kompositt. I klinisk situasjon oppstår når kontakten Restorative kompositten er plassert i munnhulen.
- Inkuber prøver (kompositter belegg i DMEM-medium) ved 37 ° C under fuktig atmosfære med 5% CO2 i luft. Inkuber DMEM-medium (uten sammensatte prøver) for kontrollceller i de samme betingelser.
2. HGF Cell Culture, Composite Ekstrakter Testing og celler Beising
- Vekst og vedlikehold av cellekulturer
Isoler menneskelige gingivale fibroblaster fra friske gingivale vev biopsi av pasienter tatt under rutinekjeveortopedisk ekstraksjon.- Dyrke humane gingivale fibroblaster i DMEM, i nærvær av 10% FBS, 5% penicillin / streptomycin, 1% Amphotericin B. Oppretthold celler ved 37 ° C i inkubator under en fuktig atmosfære med 5% CO2 i luft.
- Endret mellom hver 3. dag, og passage celler hver 5 dager. Etter å ha nådd konfluens, slakte celler ved trypsinering.
- Sentrifuger cellene ved 90 xg i 5 min og re-suspendere dem i kulturmediet. Telle celle med et septer håndholdt automatisert celleteller.
- Seed cellesuspensjon ved en celletetthet på 2,5 x 10 4 celler / ml i et kammer glidesystem. Tillat inkubering av cellene over natten ved 37 ° C i en 5% atmosfære.
- Tilsetning av sammensatte ekstrakter til cellene i kultur
- Erstatte mediet av to brønner i kammeret lysbilde ved 1 ml av de testede sammensatte ekstrakter (etter 24 timers inkubasjon).
- Opprettholde de to resterende brønnene (kontrollceller) i samme forhold.
- Inkuber i kammeret lysbilde som inneholder de fire brønnene ved 37 ° C i inkubator, under en fuktig atmosfære med 5% CO2 i luft.
- Fluorescentfarvningsteknikk
Bruk Live / Død cytotoksisitet flekken for eukaryote celler i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: settet gir en rask to-farge fluorescerende analyse for å bestemme levedyktigheten til celler i en populasjon basert på plasmamembran integritet og esterase aktivitet. Flekken skille levende fra skadede celler ved samtidig merking med grønn-fluorescerende Calcein-AM å indikere intracellulære esterase aktivitet og rød-fluorescerende Ethidium homodimer-1 (EthD-1) for å indikere tap av membrane integritet.- Tilbered en arbeidsløsning av de to flekk reagenser inneholdende 2 uM av Calcein AM og 4 uM EthD-1 (sluttkonsentrasjon rapportert å være egnet for fibroblast-farging). Legg flekken til de dyrkede adherente celler i nærvær eller fravær av de valgte sammensatte ekstrakter.
- Observere direkte og raskt farget cellepopulasjoner på minst 15 min etter farging og gjennom time-lapse imaging. Ikke sentrifuger og ikke fixe de fargede cellene.
3. Confocal Time Lapse Imaging og Signal Analysis
Det system som benyttes er utstyrt med en fire laserdiodeenhetene og en multi-farget bilde for opptil fire fluorescerende fargestoffer for hver prøve. Systemet kan utføre en kartlegging bilde (10X forstørrelse) som gir en oversikt over testprøven hvor man kan bevege å observere en region av interesse (forstørrelse 600X).
- Tid lapse bildebehandling
- Plasser specimens (kammeret lysbildet som inneholder farget prøver) på det mørke rommet av det konfokale integrert inkubator (37 ° C, 5% av CO 2 og fuktig atmosfære).
- Velg de tilsvarende lasere. Bruk to laserkilder 473 nm (15 mW) og 559 nm (18 mW) for å opphisse Calcein og EthD-1.
- Bruke en to sekvensiell modus for å hente bilder gjennom linjesekvenser uten crosstalk i bildebehandling med de to brukte fluorescens fargestoffer.
- Bruke en detektor med en nylig utviklet spektrum for automatisk å angi forholdene i samsvar med fluorescens-fargestoff i skanneenhet.
- Optimal de båndbredder av den detekterte fluorescens for hver kanal til det maksimale. Rekord alle oppkjøp sekvensielt for å unngå potensiell kryss snakker.
- Velge de mest egnede bildeforholdene basert på fluorescerende fargestoff valget med oppkjøpet programvare.
- Tilegne seg et kartbilde som opprettes automatisk fra sentrum i et spiralmønster,med interesseområdet blir lett valgt for nærmere undersøkelse.
- Velg observasjon modus. Velg opp til fem typer observasjonsmodi inkludert time-lapse, Z-stack, og multi-området etter behov. Bruk en kombinasjon av Z-stack og time-lapse moduser i denne studien og fullføre raskt bilde fange,
- Endre og slå den fluorescerende fargestoff. Alternativt overlappe fluorescerende og bilder lys kontrast med hverandre. Observere levende bilde ved hjelp av det valgte punktet på venstre nedre kartskjermen.
- Bestem bildeområdet ved hjelp av rammer og zooming funksjoner. Eventuelt bytte mellom skjermene for hver type fluorescens fargestoff.
MERK: Mikroskopet brukes i denne protokollen har samme funksjonalitet som en høy konvensjonell confocal i en kompakt design. Mikroskopet er utstyrt med inverterte vann-immersion mål som er optimalt for stabil time-lapse avbildning av levende celler med en forenklet innebygd inkubator. - Signal analyse og kvantifisering
- Bruk bildebehandlingsprogrammer for å kvantifisere fluorescens signal. Skaff fem kartbilder med 10X objektiv for både testet prøven og cellekontroll.
- Innhentet 1024 × 1024 piksler vanlige bilder, med en 0,231 mikrometer × 0,231 mikrometer pikselstørrelse. Lagre bilder som for signalanalyse Olympus Image Format (OIF). Dette formatet gjør det mulig å lagre forskjellige parameterinnstillinger og bilder sammen. Bruke ulike analyseverktøy (måling av intensitet profil, intensitet forholdet mellom de to brukte kanaler).
- Oppbevar de maksimale projeksjonsbildene som 12 bits / pixel TIFF-filer.
- Preform statistiske analyser ved hjelp av R commander programvare. Analyser forskjeller ved hjelp av en-veis analyse av varians (ANOVA) med en repetisjonstest. Rapporter resulterer som gjennomsnittlig standardavvik (± SD) og statistisk signifikans ved p <0,05.
Representative Results
Figur 1 viser en oversikt over de live / Døde fargede celler i innhentet kartbildene (10X objektiv) for både kontroll og celler eksponert for de testede kompositt ekstrakter (ELS ekstra lav krymping). Den tredimensjonale strukturen av cellene som kan bli visualisert ved 600X forstørrelse. Visualisering av celler som samles i styrekammeret og av celler som er samlet i kammeret, i nærvær av de testede sammensatte ekstraktene er presentert i figur 2. Den maksimale fremspring (60X objektiv) viser skjebnen til utvalgte cellepopulasjoner ved starten av tidsintervall (ved 15 min), og ved slutten av tidsintervallperiode (ved 5 timer). Femti syv stabler av bilder (xyzt mod scan, 39 bilder per stabler, voxel-dybde 1,00 mikrometer) ble oppnådd i denne perioden. En liten reduksjon i det grønne fluorescente signalet og svært liten variasjon i den røde fluorescerende ble oppnådd i eksponerte celler. Ingen signifikant variasjon ble observert for kontrollceller. Kompositt ekstrakter utsatte celler antas lik spindel morfologi å kontrollere celler; morfologi ble ikke endret i disse eksperimentelle betingelser (til tross for den grønne signal reduksjon, og den røde signaløkning i nærvær av de testede kompositt). Bildeanalyse ble utført på fem utvalgte forskjellige bildestakker svarende til forskjellige cellepopulasjoner fra de oppnådde bildene for den testede kompositten sammenlignet med negative kontrollceller for både rødt og grønt signal. Den intensitetsprofilen til fargede celler er illustrert i figur 3; de grønne og røde signal utviklingen av cellene i kontakt med det sammensatte testet var sammenlignbare med de av kontrollceller. Calcein og EthD-en fluorescens utslippsintensitet ble målt på kontrollceller og på kompositt eksponerte celler. Målingen ble utført ved en times intervaller i opp til fem timer. Den grønn / rød fluorescens ratio (basert på integrerte intensiteter av den grønne 495-515 nm og røde 620-650 nm-signaler) Ble beregnet i løpet av time-lapse perioden. Levedyktigheten forholdstall for kontroll og synlige celler til ELS ekstra lav krymping ekstrakter er vist i T stand 1. I nærvær av de testede kompositten, ble prosentandelen av levende celler funnet å avta svakt fra 100% til 93,9% etter 1 time av kontakt. Signifikant forskjell ble observert mellom den testede kompositt og den negative kontroll (celler uten noen sammensatte ekstrakter) etter 5 timers av det angitte tidsintervallperioden.
Figur 1: Oversikt over kartlegging bilde viste farget celler ved objektiv 10X, (A) kontrollceller og (B) celler i nærvær av kompositt ekstrakter (ELS ekstra lav krymping) i begynnelsen av tiden lapse perioden (t = 15 min). Grønne områder er levende celler og røde områder er ødelagte celler. I denneeksperimentforholdene, ingen variasjon (for både grønn og rød fluorescens) ble observert for kompositter eksponerte celler i forhold til negative kontrollceller.
Figur 2: CLSM bilder ved 60X objektiv av en cellepopulasjon fra (A) og styrekammeret (B) sammensatte ekstrakter kammer i begynnelsen og slutten av eksponeringstidsintervallperiode (I: 15 min og II: 5 timer, respektivt ). Grønne områder er levende celler og røde områder er ødelagte celler. Panelet av bildene viste liten endring i intensiteten signalet (svak nedgang i det grønne signal og meget svak økning i den røde). Ingen cellemorfologi endringer ble observert i nærvær av komposittekstrakter; eksponere celler vedlikeholdt sin spindel-formet og fibroblastisk morfologi som kontrollceller.
Figur 3: Line profil av celler observert i time-lapse mikroskopi (A) Kontroll celler (B) Composite ekstrakter eksponerte celler, (I) på 15 min og (II) ved 5 t.. Ingen synlig variasjon i den grønne signalutvikling i nærvær av kompositt testet uavhengig tids kontakt. Det ble imidlertid svak økning av det røde signal observert i nærvær av kompositten etter 5 timers kontakt.
| Kontakttid (time) | Cell Livskraftig (%) | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Kontrollceller | 100 | 100 | 100 </ Td> | 100 | 100 |
| ELS ekstra lav krymping ® | 93,9 ± 7 | 91,3 ± 5 * | 89,5 ± 3 * | 87,6 ± 2 * | 87,7 ± 3 * |
Tabell 1:. Rate av levende celler HGF evolusjon etter 1, 2, 3, 4 og 5 timer for kontakt med sammensatte ekstrakter Cellenes levedyktighet ble analysert ved farging ved hjelp av Levende / Døde cytotoksisitet kit. Data viser gjennomsnittsverdier ± SD fem bilder stabler analyse. Verdier er signifikant forskjellig fra kontrollceller ved p <0,05.
Discussion
Biokompatibilitet materialoppførsel er den mest forutsetning parameter som skal evalueres før medisinsk bruk. Internasjonale standarder dekker medisinsk utstyr ISO 10993 33 og spesielt dentale materialer ISO 7405 34. Fraværet av de toksiske effektene til de omkringliggende cellene er nøkkelen normen i biokompatibilitet evaluering av slike materialer. Det er derfor cytotoksisitetstesting har slik betydning i vurderingen av tannmateriale biokompabilitet 35-37. ISO foreslo testmetoder kan være basert på metabolsk aktivitet eller membran integritet. Valgte endepunkter bør følge bestemte forhold for klassifisering uønskede bivirkninger indusert av et testmateriale for å minimere tiden og kostnaden av vurderings analyser. Den nåværende metoden for undersøkelse (3D konfokal time lapse imaging) er membran integritet basert. Cytotoksisitet evaluering via dette endepunktet synes å være en verdifull markør for celle biocompatibility med testede materialer og det er også godkjent ISO endepunkt. In vitro tester er utformet for å bestemme hvordan en materialprøve påvirker en bestemt celletype. Den kolorimetrisk MTT-analysen ble opprinnelig beskrevet av Mossman (1983) som en nyttig metode for måling av in vitro-cytotoksisitet og celleproliferasjon. MTT-testen er basert på omdannelsen av tetrazoliumsaltet i formazankrystaller med aktive celler, som bestemmer mitokondrielle aktivitet. Dette kan oversettes med levedyktighet sats 38. Gupta og medarbeidere rapporterte at smeltestyrketesten er den mest brukte metoden for å måle cytotoksisitet av kompositt harpikser. Ravsyre dehydrogenase og responser alkalisk fosfatase har også vært anvendt for samme formål 39. Imidlertid kan de skjebnen cellene ikke bli fulgt opp, ettersom MTT-analysen trenger å drepe cellene på hvert tidsmålepunkt. For å overvåke nærmere oppførselen til de fargede celler i den aktuelle studien, direkte observasjon av levende celler ble utført, takket være tid forfalle CLSM bildebehandling kombinert med en kort protokoll farging, automatisert bildeanalyse og fluorescerende signal kvantifisering.
Dental kompositter kommer i nær kontakt med orale vev, spesielt gingival og pulpal celler. Fibroblaster ville være målet for komponenter utgitt fra disse restorative kompositter 40-41. Videre har flere studier har rapportert at udødeliggjort celler og primære celler kan ha ulike cellulære responser i kontakt med biomaterialer. Primære celler ble funnet å være mer hensiktsmessig å vurdere biomaterialer effekter 42. Dette forklarer bruken av primære, humane fibroblastceller gingivale som cellemodell for vurdering av cytotoksisitet testet tann kompositt i denne studien. Giftig potensialet i de frigjorte stoffer fra tann kompositt har vært mye studert 43-44. For å kunne vurdere tHan cytotoksisk potensiale av materialer, kunne to kontaktmodell celler bli utført. I den direkte kontaktmodellsystem materialet blir direkte plassert med målceller, mens i indirekte kontakt-system, målrette celler som er i kontakt med eluerer fra biologiske medier. I kliniske applikasjoner og for restorative prosedyrer, blir tann kompositt plassert i indirekte kontakt med gingivale vev. Av denne grunn ble den aktuelle eksperimentelle protokoll fokusert på indirekte kontakt system med humane gingivale fibroblaster (celler i nærvær av de testede sammensatte ekstrakter). Som tidligere rapportert av Dahl og medarbeidere, cytotoksiske responser ble rangert som alvorlig (<30%), moderat (30-60%), liten (60-90%) eller ikke-cytotoksisk (> 90%) basert på aktiviteten i forhold til verdier oppnådd for 45 kontrollene. Derfor, i henhold til denne rangering og i lys av de oppnådde resultater (tabell 1), sammensatt ELS ekstra lav krymping kan bli rangert som very litt cytotoksiske og viste sammenlignbare atferd for å kontrollere celler under hele tiden lapse perioden. Ved hjelp av den nøyaktig samme fremgangsmåte undersøkelse, kan resultatene av denne undersøkelse sammenlignes med de av en nylig publisert studie. Den ELS ekstra lav krymping kompositt vist overlegen biokompatibilitet i forhold til de to tidligere testede kompositter anvendes for samme kliniske programmet som er den direkte restaurering 11. Videre studier er fortsatt nødvendig å etablere mer fullstendig sammenligning.
Når du bestemmer hvilken Cvtotoksisitetsmålinq å godkjenne for en bestemt endepunkt vurdering, er det viktig å forstå fordeler og begrensninger av hver analyse. Hovedformålet med konfokalt avbildnings er å oppnå en 3-D-arkitektur av celler og organer. Teknikken er i stand til å avsløre ikke bare en prøveoverflaten, men også dens undergrunnen. Protokollen er beskrevet her understreker bruken av 3D CLSM tid forfalle confocal bildebehandling, som sensitive fremgangsmåte for å vurdere in vitro biologiske forenelighetsmiddel oppførsel av en dental kompositt. Imidlertid, for å unngå de begrensninger som oppstår i dette arbeidet, anti-vibrasjons arbeidsstasjoner kan brukes for å tillate mer stabil og lengre tidsinnstilte avbildning; tabletop kunne isolere brukt konfokalmikroskoper systemet fra de skadelige effektene som vibrasjoner i laboratoriet kan forårsake. Videre materialer som skal brukes i munnhulen bør ideelt sett være uskadelig for de gingivale vev og bør ikke inneholde noen stoffer som kan forårsake systemisk toksisitet. I henhold til metodene som er brukt, og resultatene fra denne studien kan det konkluderes med at testet kompositt (ELS ekstra lav krymping) er ikke cytotoksisk i dagens forsøksbetingelser. Som følsomt CLSM metoden kan gi den initiale sats av levedyktige celler, kan andre muligheter bli forutsett for å vurdere flere endepunkter. Spesielt, som det har nylig blitt rapportert at kompositt monomerer påvirker celler through reaktive oksygenforbindelser (ROS) 46- 48, er ytterligere undersøkelser for å vurdere sammenhenger hvis noen mellom cytotoksisitet signale nettverk og ROS produksjon. Fremtiden protokollen kan være utformet for å samtidig evaluere ROS produksjon (H 2 O 2 og / eller O 2 - farging) og cytotoksisitet ratio (Live / dead flekker) ved hjelp av time lapse CLSM bildebehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
| O2/CO2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
| Live/Dead Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
| ELS extra low shrinkage | Saremco | Dental composite | |
| DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
| Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
| chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
| penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
| Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
| Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |
References
- Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
- Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
- Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
- Geurtsen, W.
- Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
- Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
- Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
- Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
- Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
- Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
- Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
- Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
- Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
- Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
- Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
- Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
- Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
- Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
- Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
- Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
- Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
- Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
- Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
- Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
- Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
- Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
- White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
- Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
- Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
- Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
- Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
- Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
- Williams, D. F.
- Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
- Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
- Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
- Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
- Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
- Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
- Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
- Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
- Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
- Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).
