Medicine

歯科用複合材料の細胞適合性評価のための効率的な方法として、共焦点タイムラプスイメージング

Published: November 9, 2014 doi: 10.3791/51949

Ghania Nina Attik¹, Kerstin Gritsch^1,2, Pierre Colon^1,3, Brigitte Grosgogeat^1,2

¹Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, ²UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, ³UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

Summary

歯科用複合材料の生体適合性の最も研究された側面は、蛍光シグナルの定量化と組み合わせたそれらの細胞毒性3D CLSMタイムラプスイメージングは、時間をかけて細胞の運命の敏感な評価を可能にする。この方法を利用することは歯科用複合材料の細胞適合性を評価するための効率的なツールである可能性があります。

Abstract

一般的には、 インビトロでの細胞物質との相互作用に歯科材料の生体適合性を評価するのに有用な基準であることが認められている。本研究の目的は、歯科用複合材料のin vitro生体適合性を評価するために、3D CLSMタイムラプス共焦点イメージングを使用することであった。この方法は、歯科用複合抽出物と接触している生細胞率の正確かつ敏感な指標を提供する。 ELS余分な低収縮、直接修復に使用される歯科用複合材料は、例としてとられている。 インビトロ評価を、生/死染色を使用して培養された初代ヒト歯肉線維芽細胞上で行った。画像は、共焦点FV10i生物学的に反転システムで得られたとFV10-ASW 3.1ソフトウェアを用いて分析した。画像解析は、時間経過の5時間後に試験した複合体の存在下で非常にわずかな細胞毒性を示した。細胞生存率のわずかな減少がcomparはテスト複合抽出物と接触して示された細胞を制御するために編所見は、定性的および定量的に歯科用複合材料の生体適合性の挙動を評価するための感度の高い方法として、3D CLSMタイムラプスイメージングを使用することを強調した。

Introduction

生体適合性を定義するISO勧告に引用主基準の一つは、細胞への物質の毒性が存在しないことである。樹脂ベースの歯科用複合材料は、時間にわたって^1-4による部分的な重合および/ またはそれにより分解プロセスに最初にすることができた、樹脂状マトリックスから成分を放出することができる。これらのリリースのコンポーネントは、マイトジェンに対する免疫抑制または免疫刺激、I型コラーゲンタンパク質⁷上の歯肉線維芽細胞の形態及び削減の修正、口腔組織と接触し、蕁麻疹および粘膜の反応⁵のような種々の欠点を有していてもよく、患者⁶のアレルギーや過敏反応の開発⁹彼らの遺伝毒性の可能性を強調して駆動型精製Tリンパ球および脾臓細胞の増殖⁸および初代ヒト歯肉線維芽細胞におけるDNA損傷。多くのパラメータは、cがシェードとして歯科用複合毒性に影響を与えることができるomposite、光硬化性樹脂モノマーの化学組成、充填剤、変換^10〜13度。 インビトロ以来の物質の毒性は、in vivoの状況で予測してもよいし、いくつかの関連するエンドポイントの研究によって臨床状況と比較することができた。歯科用複合材料およびそれらの成分の細胞毒性は、広く細胞培養系^14〜16を使用して評価されてきた。

これらのin vitro系は、期間内の歯科用複合材料の生体適合性を評価するために開発されている：セル^17、ヒト歯肉線維芽細胞における細胞毒性の¹⁸のようなTHP-1monocytesを使用して、細胞増殖、および細胞アポトーシス、HaCaT細胞における炎症電位がセル^2、セルの機能のようなケラチノサイトodontoblast- MDPC-23細胞は¹⁹のように、ヒト歯肉上の総RNAレベルの減少、およびアポトーシスの誘導の有意な増加が²⁰ケラチノサイトおよび歯肉と歯髄線維芽細胞²¹上のDNA損傷。

異なる方法論は、歯科用複合材料の生体適合性を調査するために提案されている。特定の着色剤及び光吸収測定を含む比色アッセイは、それらの相対的な単純性と低コスト^{22- 26}に、最も一般的に使用されるままである。光のコントラストによる顕微鏡分析は、頻繁に多くの時間を消費し、コスト高を招く。しかし、これらの顕微鏡技術は、いくつかの重要な利点を有する。セル構造の観察は、より関連性の高い機密性の高いデータを提供し、経験豊富な毒性影響についての拡張情報を提供します。具体的には、共焦点顕微鏡²⁷の導入は、従来の広視野イメージング蛍光顕微鏡に比べて軸方向の解像度を向上させるとの生物学的構造の観察を可能にした。したがって、共焦点イメージングは、異なる分野の強力な調査ツールとなっている医学と科学研究。電子顕微鏡技術とは対照的に、走査型共焦点顕微鏡は、特定の蛍光マーカーの取り込みにより、細胞の別個の構成要素を視覚化する能力を提供する。これらの特定のトレーサーの大半は、臨床での使用だけでなく、実験室での調査研究を可能にする^、28、水性環境中で安定で賢明に測定可能な、安価で非毒性である。また、従来の電子顕微鏡分析に必要な試料の乾燥および固定がタイムラプス共焦点イメージングのための必要がなく、したがって、時間依存性の獲得は、サンプルにも可能である。二次元イメージングと比較して、共焦点画像化の原理は、試料表面下の視覚化と異なるられた奥行き画像から三次元構造の再構築を可能にする。三次元タイムラプスCの使用の例は^30、より正確でより詳細な構造²⁹をもたらす。現在の映像研究である革新的な方法としてライブ/デッド蛍光標識や信号の定量化と組み合わせたレーザー走査顕微鏡（3D-CLSM）onfocal。この論文で提示された技術が評価されたセル構造を変えずに、生細胞の感受性の評価とタイムラプスイメージングを可能にするという利点を有する。いいえ準備手順は、共焦点解析の前に必要とされない。以前に、同一の染色は、培養海綿骨のコア³¹の生存率を評価するためではなく、以下の共焦点タイムラプスすることなく使用した。同様に、同じタイムラプス共焦点手順は/特定の細菌が生きデッド染色を使用して、グラム型³²に応じて活性汚泥の細菌にエリスロマイシン時間殺傷活性を評価するために使用された。これらの方法は、最近適合さメタクリレートモノマー¹¹に基づく歯科用複合材料の毒性を比較するために使用されてきた。

Protocol

プロトコルは、3つの主要な手順で構成されます。最初のステップは、培養培地中で複合抽出物の調製を含み;第二の懸念初代ヒト歯肉線維芽（HGF）、細胞培養、複合抽出物および細胞染色による細胞の接触。第3のステップは、共焦点イメージング、蛍光信号解析で構成されています。服用歯肉組織の場合、プロトコルは、フランスの法律、インフォームドコンセント及び地域の倫理委員会に準拠して承認されました。

1.コンポジット抽出物の準備

溶出媒体としてダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用します。試験片の表面積と抽出媒体の体積との比は、ISO 12分の10993要件の最低レベルであることを確認します。手順は、最近^11を説明し、下に簡単に概説する。

オーダーメイドのホールドを使用して未硬化歯科複合材料の球状のサンプルを形成えー。ホルダーの大きさは、経口臨床治療において一般に助言硬化深度に応じた半径2mmである。
プレートのウェルを準備し、それぞれのペニシリン/ストレプトマイシン及びアンホテリシンの1％、5％のミックスが、ウシ胎児血清（FBS）を含まない培地を1ml（DMEM）を含む。
40秒間1070メガワットcm ^-2の強度（λ= 465から475 nm）を有するLEDライトランプを用いよく含むDMEM培地内で硬化サンプル。硬化先端とサンプル間の距離は0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。歯と未硬化歯科用複合の間の一時的な接触をシミュレートするために、この硬化モードを使用します。修復複合材料を口腔内に配置されたときに臨床的状況では、接触が起こる。
空気中5％CO ₂の加湿雰囲気下、37℃でのサンプル（DMEM培地中の複合試料）を培養する。同じ条件での対照細胞について（コンポジットサンプルなし）DMEM培地をインキュベートする。

2. HGF細胞培養、コンポジットエキステストと細胞の染色

成長および細胞培養の維持
ルーチン歯列矯正の抽出中に撮影患者の健康歯肉組織生検からヒト歯肉線維芽細胞を分離します。
1. 10％FBSの存在下で、DMEM中のヒト歯肉線維芽細胞を養う、5％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％アンホテリシンBを、空気中5％CO ₂の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で細胞を維持する。
2. 5日毎、3日毎に培地を変更し、継代細胞。トリプシン処理によりフルエンシー、収穫細胞に到達した後。
3. 5分間90×gで遠心分離細胞培養培地中で再懸濁する。笏ハンドヘルド自動細胞計数器で細胞を数える。
4. チャンバースライドシステムにおいて2.5×10 ⁴細胞/ mlの細胞密度でシード細胞懸濁液。 5％の雰囲気中で37℃で一晩細胞のインキュベーションを許可します。
培養中の細胞への複合抽出物のほか
1. （インキュベーションの24時間後）は、試験した複合抽出物の1ミリリットルによってチャンバースライドの2井戸のメディアを交換してください。
2. 同じ条件で、残りの2つのウェル（対照細胞）を維持する。
3. 空気中5％CO ₂の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で4つのウェルを含むチャンバースライドをインキュベートする。
蛍光染色
メーカーの指示に従って、真核細胞のためのライブ/デッド細胞毒性ステインを使用してください。
注：このキットは、細胞膜の完全性およびエステラーゼ活性に基づいて、集団中の細胞の生存率を決定するための迅速な二色蛍光アッセイを提供する。染色を同時にmembranの損失を示すために、細胞内エステラーゼ活性を示し、赤色蛍光ジウムホモダイマー-1（のEthD-1）緑色蛍光カルセインAMで標識することによって損傷を受けた細胞からのライブ区別するEの整合性。
1. カルセインAM及び4μMとのEthD-1（線維芽細胞の染色に適していることが報告された最終濃度）の2μMを含む二つの染色試薬のワーキング溶液を調製する。選択された複合抽出物の存在下または非存在下で培養した接着細胞を染色を加える。
2. 染色後とタイムラプスイメージングを通じて少なくとも15分で直接かつ迅速に染色された細胞集団を観察します。遠心操作は行なわないと染色された細胞をFIXEません。

3.共焦点タイムラプスイメージングと信号解析

使用されるシステムは、4つのダイオードレーザユニットと各検体のために最大4つの蛍光色素のためのマルチ染色像を備えている。システムは、1つは関心（600X倍率）の領域を観察するために移動することができる上、試験サンプルの概要を示したマッピング像（倍率10倍）を行うことができます。

タイムラプスイメージング
1. Sを配置共焦点統合インキュベーター（37の暗い部屋にpecimens（染色されたサンプルを含むチャンバースライド） °C、CO ₂湿潤雰囲気の5％）。
2. 対応するレーザーを選択します。カルセインとのEthD-1を励起するために2つのレーザ源を473 nmの（15 mW）とし、559 nmの（18 MW）を使用してください。
3. 2使用済みの蛍光色素とイメージングにおけるクロストークずにライン配列を介して画像を取得するために2シーケンシャルモードを使用してください。
4. 自動的に走査ユニット内の蛍光色素に応じた条件を設定し、新たに開発されたスペクトル検出器を用いる。
5. 最大各チャンネルごとに検出された蛍光の帯域幅を最適化します。レコードに順次、すべての買収は、潜在的なクロストークを回避するため。
6. 取得ソフトウェアを使用して、蛍光色素の選択に基づいて最適な撮影条件を選択してください。
7. 、自動的に螺旋パターンで中心から作成された地図画像を取得する関心のある領域で簡単に綿密に検討するために選択されている。
8. 観察モードを選択します。タイムラプス、Zスタック、および必要に応じて、多領域を含む観察モードの5種類まで選択。本研究ではZスタックとタイムラプスモードの組み合わせを使用して、迅速に撮影を完了
9. 蛍光色素を変更し、切り替えます。代替的に、互いに蛍光および光コントラスト画像を重ねる。左下地図画面上で選択したポイントを使用したライブ画像を観察する。
10. フレーミングを使用し、機能をズームにより撮影領域を決定します。必要に応じて、蛍光色素の種類ごとに表示の切り替え。
  注：このプロトコルで使用される顕微鏡は、コンパクトな設計で高い従来の共焦点と同じ機能を持っています。顕微鏡は簡略化され、組み込みのインキュベーターとの生細胞の安定したタイムラプスイメージングのために最適に適して倒立水浸対物レンズが装備されています。
11. 信号解析および定量
  1. 蛍光シグナルを定量化するイメージングソフトウェアを使用してください。試験される試料および細胞制御の両方のための10倍の対物レンズで5地図画像を取得します。
  2. 0.231ミクロン×0.231μmのピクセルサイズで、1024×1024画素の定期的な画像を得た。信号解析のためのオリンパスの画像フォーマットなどの画像（OIF）を保管してください。この形式は、さまざまなパラメータ設定や画像を一緒に保存することができます。別の解析ツール（強度プロファイルの測定二つ使用するチャネル間の強度比）を使用する。
  3. 12ビット/ピクセルのTIFFファイルとして最大の投影画像を保存する。
  4. Rコマンダーソフトウェアを使用して統計分析をリフォーム。反復試験で一元配置分散分析（ANOVA）を使用して差異を分析する。報告書は、（±SD）として平均値、標準偏差およびp <0.05で統計的有意性をもたらす。

Representative Results

図1は、制御して試験複合エキス（ELS余分な低収縮）に曝露された細胞の両方について得られたマッピング像（10×対物レンズ）で生/死染色された細胞の概要を示した。細胞の3次元構造は、倍率600Xで可視化することができた。制御室では、試験した複合抽出物の存在下でチャンバー内に収集された細胞から回収した細胞の可視化は、図2に示されている。最大突出部（対物レンズ60X）は、時間経過の開始時に選択された細胞集団の運命を示す（15分）を行い、時間の経過期間の終わり（5時間で）。画像の五十7スタック（xyzt MODスキャン、スタックあたり39画像、ボクセル深さ1.00μm）をこの期間中に得られた。赤色蛍光の緑色の蛍光シグナルのわずかな減少と非常にわずかな変化が暴露された細胞で得られた。有意な変動は制御のために認められなかった細胞。複合抽出物を曝露された細胞は、対照細胞と同様、スピンドル形態を想定。形態は（緑のシグナルが減少し、試験し、複合体の存在下で赤信号増加にもかかわらず）は、これらの実験条件では変化しなかった。画像解析は、緑と赤の両方の信号のための陰性対照細胞と比較して試験した合成のための得られた画像から、異なる細胞集団に対応する5つの選択された異なる画像スタックで行った。染色された細胞の強度プロファイルは、図3に示されている。試験された複合材料と接触している細胞の緑と赤のシグナルの発生は、対照細胞のものと同等であった。カルセインとのEthD-1蛍光発光強度は、対照細胞に複合曝露した細胞で測定した。測定は、最大5時間、一時間間隔で行った。緑の495から515ナノメートルの積分強度と赤の620から650 nmの信号に基づいて、緑/赤蛍光比（）タイムラプス期間中に計算された。 ELS超低収縮エキスに生存能力制御のための比と曝露された細胞を、1できTに示した。試験された複合体の存在下では、生細胞の割合は、1時間後に93.9％、100％からわずかに減少させることが見出された接触。有意差が示されたタイムラプス周期の5時間後に試験したコンポジットおよび陰性対照（任意複合抽出物なしの細胞）の間で観察された。

図1マッピング画像の概要の時間経過期間（時刻t = 15分）の初めに複合抽出物（ELS超低収縮）の存在下で目的10X、（A）対照細胞および（B）細胞の細胞染色を示した 。緑の領域は、生きた細胞であり、赤のエリアは、損傷した細胞である。この中で実験条件は、（両方の緑と赤の蛍光のための）変化がない陰性対照細胞と比較して複合暴露した細胞につき観察された。

図2：それぞれ5時間、15分およびII：（A）制御室からの細胞集団および開始と露光時間の経過期間（Iの最後に（B）複合抽出チャンバーの目的60XでのCLSM画像）。緑の領域は、生きた細胞であり、赤のエリアは、損傷した細胞である。画像のパネルは、輝度信号（緑色信号のわずかな減少と赤のいずれかの非常にわずかな増加）のわずかな変化を示した。無細胞形態の変化は、複合抽出物の存在下では観察されなかった。露光する細胞は、対照細胞としての紡錘状線維芽細胞と形態を維持した。

図3：タイムラプス顕微鏡で観察する細胞のラインプロファイル 、15分および（II）において、（A）コントロール細胞（B）複合曝露した細胞抽出物、（I）の5時間で。。テストされ、複合体の存在下で緑の信号進化における目に見える変化しない時間に関係なく接触。しかし、赤色信号のわずかな増加は、接触の5時間後に、複合体の存在下で観察された。

接触時間（時）	細胞生存率（％）
接触時間（時）	1	2	3	4	5
対照細胞	100	100	100 </ TD>	100	100
ELS余分な低収縮^®	93.9±7	91.3±5 *	89.5±3 *	87.6±2 *	87.7±3 *

表1：複合抽出物による細胞生存率の接触1,2,3,4および5時間後の生HGF細胞の進化の速度は、生/死細胞毒性キットを用いて染色することにより分析した。データは、5枚の画像スタック解析の平均±SD値を示している。値は、p <0.05で対照細胞とは有意に異なっている。

Discussion

生体適合性材料の挙動は、医学的使用の前に評価されるべき最も前提条件パラメータです。国際規格は、ISO 7405 ³⁴医療機器のISO 10993 ^33、具体的には歯科材料をカバーしています。周囲の細胞への毒性作用の欠如は、このような材料の生体適合性評価において重要な規範です。 ^{37 -}細胞毒性試験は、歯科材料の生体適合性³⁵の評価においてそのような重要性を持っている理由です。 ISO試験方法は、代謝活性または膜の完全性に基づくことができるが示唆された。選択されたエンドポイントは、時間と評価アッセイのコストを最小限にするために、試験物質によって誘発される副作用をランク付けするための特定の条件に従うべきである。調査（3D共焦点タイムラプスイメージング）の現在の方法は、ベース膜の完全性である。このエンドポイントを経由して細胞毒性の評価は、細胞の貴重なマーカーであると思われるbiocompa試験した材料とのtibility、それはISOがエンドポイントを承認したこともある。in vitro試験は、材料サンプルは、特定の細胞型にどのように影響するかを決定するために設計されています。比色MTTアッセイは、もともとインビトロでの細胞毒性及び細胞増殖を測定するための有用な方法としてモスマン（1983）により記載されている。 MTT試験は、ミトコンドリア活性を決定し、アクティブ細胞によるホルマザン結晶へのテトラゾリウム塩の変換に基づいている。これは生存率率³⁸によって変換することができます。グプタと共同研究者は、MTT試験は、コンポジットレジンの細胞毒性を測定するために最も広く用いられている方法であることを報告した。コハク酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼ反応はまた、同じ目的³⁹のために使用されている。 MTTアッセイは、各測定時点で細胞を死滅させる必要がありので、運命の細胞を追跡することができない。より密接に現在の研究では染色された細胞の挙動をモニターするために、ジ生細胞の矩形観察は、短いプロトコル染色、自動画像分析、蛍光シグナルの定量化と組み合わせタイムラプスCLSM画像のおかげで行った。

歯科用複合材料は、口腔組織、特に歯肉および歯髄細胞に密着。 ^{41 -}線維芽細胞はこれらの修復複合材料⁴⁰から放出されたコンポーネントのターゲットになります。さらに、いくつかの研究は、不死化細胞及び初代細胞は、生体材料と接触して異なる細胞応答を有し得ることを報告している。初代細胞は、生体材料⁴²の効果^を評価すること^がより適切であることが見出された。これは、現在の研究で試験歯科用コンポジットの細胞毒性評価のための細胞モデルとして初代ヒト歯肉線維芽細胞の使用を説明しています。 ^{44 -}歯科用複合材料から放出される物質の毒性の可能性は、広く^43を検討されている。 tで評価するために彼は、2つの接触モデル細胞が実行することができ、材料の潜在的な細胞毒性。間接接触システムにおいて、標的細胞は、生物学的媒体からの溶出液と接触している間の直接接触モデル系で材料を直接標的細胞に配置される。臨床応用ではと修復処置のために、歯科用複合材料は、歯肉組織と間接的に接触するように配置されている。このため、現在の実験プロトコルは、（試験した複合抽出物の存在下で細胞）ヒト歯肉線維芽細胞との間接接触システムに焦点を当てた。以前ダールと共同研究者によって報告されるように、細胞毒性応答はに対する活性に基づいて、<（90％）、（30％、中程度（30-60％）、わずかに（60から90パーセント）または非細胞毒性）>重度としてランク付けしたコントロール⁴⁵について得られた値。したがって、このランキングに、得られた結果（ 表1）に照らしに従って、複合ELS超低収縮verはとしてランク付けすることができyはわずかに細胞毒性および全時間経過期間中、対照細胞と同等の挙動を示した。正確に同じ調査方法を使用して、この研究の結果は、最近公表された研究のものと比較してもよい。 ELS余分な低収縮複合材料は、直接修復¹¹で同じ臨床応用のために使用される2つの以前に試験複合材料と比較して、優れた生体適合性を実証した。さらなる研究は、より一層完全な比較を確立するために必要である。

特定のエンドポイント評価のために承認するどの細胞毒性アッセイを決定するとき、それは利点と各アッセイの限界を理解することが重要です。共焦点イメージングの主な目的は、細胞や臓器の3-D構造を達成することである。技術は、試料の表面だけでなく、その表面下だけでなく明らかにすることができる。本明細書中に記載されるプロトコルは、センシとして3D CLSMタイムラプス共焦点イメージングの使用を強調歯科用コンポジットのin vitro生体適合性の挙動を評価するための電性法。しかし、この研究で遭遇制限を回避するために、防振ワークステーションは、より安定し、より長いタイムラプスイメージングを可能にするために使用することができる。卓上には、ラボでの振動が生じる可能性があること有害な影響から使用される共焦点システムを隔離することができます。また、口腔内で使用される材料は、理想的には歯肉組織に対して無害でなければならず、全身毒性を引き起こす可能性がない物質を含まないべきである。使用した方法と現在の研究から得られた結果に応じて、それは、試験した複合（ELS超低収縮）は、本実験条件において、細胞傷害性ではないと結論付けることができる。 CLSM法は敏感に生存細胞の初期速度を与えることができるように、他の可能性は、複数のエンドポイントを評価するために予見することができる。特に、最近報告されているように、複合モノマーはthrの細胞に影響を与えることウワーッ活性酸素種^{（ROS）46〜48、}さらに調査があればシグナル伝達ネットワーク細胞毒性およびROS産生との間の相関を評価するために必要とされる。そしてタイムラプスCLSMイメージングを用いて細胞毒性率（ライブ/デッド染色） ^-将来のプロトコルは、同時にROS産生（染色H ₂ O ₂および/ またはO _2）を評価するように設計することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Fluoview FV10i	Olympus		Confocal microscope
O₂/CO₂ Incubator	Pnasonic	MCO 5M	Cell incubation
Live/Dead Kit	Invitrogen	MP 03224	Stain
ELS extra low shrinkage	Saremco		Dental composite
DMEM medium	Sigma	D 6046	Culture medium
Trypsin	Sigma	T1426	harvesting cells
chamber slide system	PAA	14220040X	Culture chamber
penicillin/streptomycin	PAA	P11-010	Cell culture
Amphotericin B	PAA	P11-001	Cell culture
Fetal bovine serum	PAA	A11-101	Cell culture
Cell Counter	Merck Millipore	00110230TP1	Cell counting