Summary
Den mest undersøgte aspekt af biokompatibilitet dental kompositter er deres cytotoksicitet 3D CLSM tidsforskydningen billeddannelse kombineret med fluorescerende signal kvantificering tillader følsom evaluering af cellens skæbne over tid. Ved hjælp af denne metode kan være et effektivt redskab til at vurdere cytocompatibility af dental kompositter.
Abstract
Det er generelt accepteret, at in vitro celle materiale interaktion er et nyttigt kriterium i evalueringen af dentalmateriale biokompatibilitet. Formålet med denne undersøgelse var at bruge 3D CLSM tid bortfalder konfokal billeddannelse til at vurdere in vitro biokompatibilitet dental kompositter. Denne metode giver en nøjagtig og følsom indikation af levedygtige celler sats i kontakt med dental komposit ekstrakter. ELS ekstra lav krympning, en dental komposit anvendes til direkte restaurering, der er taget som eksempel. In vitro evaluering blev udført på dyrkede primære humane gingivale fibroblastceller bruger Live / Dead farvning. Billeder blev opnået med FV10i konfokale biologiske omvendt system, og analyseres med det FV10-ASW 3.1 Software. Billede analyse viste en meget svag cytotoksicitet i nærvær af det testede komposit efter 5 timers tidsforløb. Et lille fald i cellelevedygtighed blev vist i kontakt med den testede sammensatte ekstrakter compared at kontrollere celler. Resultaterne fremhævede brugen af 3D CLSM tid bortfalder billeddannelse som en følsom metode til kvalitativt og kvantitativt vurdere biokompatibilitet adfærd dental kompositter.
Introduction
En af de vigtigste standarder citeret i ISO anbefalinger til at definere biokompatibilitet er fraværet af materiale toksicitet for cellerne. Harpiks-baserede dental kompositter kan frigive komponenter fra harpiksholdige matrix, som kunne være i første omgang på grund af delvis polymerisation, og / eller senere på grund af nedbrydningsprocesser over tid 1-4. Disse frigivne komponenter kommer i kontakt med orale væv og kan have forskellige ulemper såsom urtikarielt og slimhindereaktioner 5, udvikling af allergi og overfølsomhedsreaktioner hos patienter, 6, modifikationer af gingivale fibroblaster morfologi og reduktion på type I kollagen 7 immunosuppression eller immunstimulerende på mitogen rent faktisk sikrer proliferation af oprensede T-lymfocytter og miltceller 8 og DNA-skader i primære humane gingivale fibroblaster, hvilket understreger deres genotoksisk potentiale 9. Mange parametre kan påvirke dental komposit toksicitet såsom skyggen af composite, lyset hærdning, den kemiske sammensætning af harpiksmonomeren, fyldstof og graden af omdannelse 10- 13. Da in vitro toksiske potentiale af materialer in vivo situationer kan forudsige og kan sammenlignes med kliniske situationer ved studiet af nogle relevante endpoints. Cytotoksicitet dental kompositter og deres komponenter er blevet evalueret vidt og bredt ved hjælp cellekultursystemer 14- 16.
Er blevet udviklet disse in vitro-systemer til at vurdere dental kompositter biokompatibilitet på sigt af: cellevækst, og celleapoptose hjælp THP-1monocytes lignende celler 17, cytotoksicitet i humane gingivale fibroblaster 18, inflammatorisk potentiale i HaCaT keratinocytter lignende celler 2, cellefunktionalitet odontoblast- ligesom MDPC-23 celler 19, reduktion af total RNA niveauer, og en betydelig stigning i induktion af apoptose på human gingival keratinocytter 20 ogDNA-skader på gingivale og papirmasse fibroblastceller 21.
Forskellige metoder er foreslået for at undersøge biokompatibilitet dentale kompositter. Kolorimetriske assays, som involverer særlige farvestoffer og lette adsorptionsstoffer målinger, er fortsat det mest almindeligt anvendte, på grund af deres relative enkelhed og lave omkostninger 22- 26. Mikroskopianalyse af lyskontrast ofte bruger mere tid og medfører højere omkostninger. Men disse mikroskopiteknikker har nogle vigtige fordele. Observationen af cellestruktur giver udvidet information om erfarne toksiske effekter, hvilket giver mere relevante og følsomme data. Navnlig har indførelsen af konfokalmikroskopi 27 tilladt for observation af biologiske strukturer med at forbedre aksial opløsning sammenlignet med traditionelle wide-field imaging fluorescens mikroskoper. Derfor har konfokal billeddannelse blevet et magtfuldt undersøgende redskab i forskellige områder afmedicinske og naturvidenskabelige forskning. I modsætning til elektroniske mikroskopiteknikker, konfokal mikroskopi giver mulighed for at visualisere særskilte elementer i celler ved inkorporering af specifikke fluorescerende markører. De fleste af disse specifikke sporstoffer er stabile i et vandigt miljø, fornuftigt målbare, billig og ikke-toksisk 28, så deres anvendelse i klinisk samt laboratorium forskningsundersøgelser. Desuden prøven tørring og fiksering nødvendigt for konventionel elektronisk mikroskopi analyse er ikke nødvendig for tidsforskydningen konfokal billeddannelse, således tidsafhængig erhvervelse er også muligt på prøver. Sammenlignet med den todimensionale afbildning konfokal billeddannelse princippet muliggør en prøve undergrunden visualisering og den tredimensionelle struktur rekonstruktion af de forskellige opnåede dybde billeder; hvilket resulterer i, mere præcise og mere strukturelle detaljer 29, 30. Den nuværende video Undersøgelsen er et eksempel på brugen af tre-dimensionelle tidsforskudt Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) kombineret med levende / Dead fluorescensmærkning og signal kvantificering som en innovativ metode. Teknikken i dette papir har den fordel, at følsom evaluering og time-lapse billeddannelse af levende celler uden at ændre den vurderede cellestruktur. Ingen forberedelse trin er nødvendige før konfokal analyse. Tidligere blev den samme farvning bruges til at vurdere levedygtigheden af dyrkede spongiosa kerner 31, men uden konfokal time-lapse efter. Tilsvarende samme time-lapse konfokal procedure blev anvendt til at vurdere erythromycin tid-kill-aktivitet i bakterier af aktiveret slam i henhold til deres Gram typen 32 ved anvendelse af et specifikt bakterier lever / dead farvning. Disse fremgangsmåder er for nylig blevet tilpasset og anvendes til at sammenligne toksiciteten af dentale kompositter baseret på methacrylatmonomerer 11.
Protocol
Protokollen består af tre vigtige trin: det første trin omfatter fremstilling af sammensatte ekstrakt i kultur medier; det andet vedrører den primære humane Gingival fibroblaster (HGF) cellekultur, kontakten af celler med de sammensatte ekstrakter og cellefarvning; det tredje trin består af konfokal billeddannelse og det fluorescerende signal analyse. For gingivale væv tager blev protokollen godkendt i overensstemmelse med fransk lovgivning, informeret samtykke og lokal etisk komite.
1. Composite Uddrag Forberedelse
Brug Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) som elueringen medium. Sikre, at forholdet mellem overfladearealet af prøverne og mængden af ekstraktionsmediet er på det laveste niveau af ISO 10993/12 krav. Proceduren er for nylig beskrevet 11 og skitserede kort nedenfor:
- Form sfæriske prøver af uhærdet dental komposit ved hjælp af et skræddersyet holdis. Holderen størrelse er 2 mm i radius, hvilket er i overensstemmelse med generelt tilrådes hærdning dybde i oral kliniske behandling.
- Forbered brønde, der hver indeholder 1 ml dyrkningsmedium (DMEM), med en 5% blanding af penicillin / streptomycin og 1% af amphotericin men uden føtalt bovint serum (FBS).
- Cure prøver inden for den brønd indeholdende DMEM medium ved hjælp af en LED lampe med en 1.070 mW cm -2 intensitet (λ = 465-475 nm) i 40 sek. Sikre, at afstanden mellem hærdningen spids og prøverne er i området på 0,5 mm. Brug denne hærdning tilstand til at simulere den midlertidige kontakt mellem tand og det uhærdede dental komposit. I kliniske situation kontakten opstår, når genoprettende komposit anbringes i mundhulen.
- Inkuber prøver (kompositter prøver i DMEM-medium) ved 37 ° C under fugtig atmosfære af 5% CO2 i luft. Inkuber DMEM medium (uden sammensatte prøver) for kontrol celler i de samme betingelser.
2. HGF Cell Culture, Composite Uddrag Test og celler Farvning
- Vækst og opretholdelse af cellekulturer
Isoler humane gingivale fibroblaster fra sunde tandkødsvæv biopsier af patienter, der er truffet under rutinemæssige tandregulering ekstraktioner.- Dyrke humane gingivale fibroblaster i DMEM i nærværelse af 10% FBS, 5% Penicillin / Streptomycin og 1% amphotericin B. Vedligehold celler ved 37 ° C i inkubatoren under en fugtig atmosfære af 5% CO2 i luft.
- Ændret medium hver 3 dage, og passage celler hver 5 dage. Efter at have nået konfluens, høst celler ved trypsinbehandling.
- Centrifuger cellerne ved 90 x g i 5 minutter, og re-suspendere dem i dyrkningsmediet. Tæl celle med et scepter håndholdt automatiseret celle tæller.
- Seed cellesuspension ved en celledensitet på 2,5 x 10 4 celler / ml i et kammer slide system. Tillade inkubation af cellerne natten over ved 37 ° C i en 5% atmosfære.
- Tilsætning af sammensatte ekstrakter til celler i kultur
- Udskift papiret to brønde i kammeret slide med 1 ml af de testede sammensatte ekstrakter (efter 24 timers inkubation).
- Bevare de to resterende brønde (kontrol celler) i de samme betingelser.
- Inkubér kammeret slide indeholder fire brønde ved 37 ° C i inkubatoren, under en fugtig atmosfære af 5% CO2 i luft.
- Fluorescensfarvede
Brug Live / Dead cytotoksicitet pletten for eukaryote celler i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: kittet giver en hurtig tofarvet fluorescerende assay for at bestemme levedygtigheden af celler i en population baseret på plasmamembranen integritet og esteraseaktivitet. Pletten skelne levende fra beskadigede celler ved samtidig mærkning med grønt fluorescerende calcein-AM til at indikere intracellulær esteraseaktivitet og røde fluorescerende Ethidium homodimer-1 (EthD-1) for at angive tab af membrane integritet.- Forberede en brugsopløsning af de to pletter reagenser indeholdende 2 uM Calcein AM og 4 uM EthD-1 (slutkoncentration rapporteret at være egnet til fibroblast farvning). Tilføj pletten til de dyrkede adhærente celler i nærvær eller fravær af de udvalgte sammensatte ekstrakter.
- Observere direkte og hurtigt de farvede cellepopulationer på mindst 15 min efter farvning og gennem time-lapse billeddannelse. Må ikke centrifuge og ikke fixe de farvede celler.
3. Konfokal Time Lapse Imaging og Signal Analysis
Det anvendte system er udstyret med en fire diode laser enheder og en multi-farvede billede for op til fire fluorescerende farvestoffer til hver prøve. Systemet kan udføre en kortlægning billede (10X forstørrelse), der giver et overblik over prøven, som man kan flytte til observere en region af interesse (600X forstørrelse).
- Time lapse imaging
- Placer specimens (kammeret slide indeholdende de farvede prøver) på det mørke rum af det konfokale integreret inkubator (37 ° C, 5% CO 2 og fugtig atmosfære).
- Vælg de tilsvarende lasere. Brug de to laserkilder 473 nm (15 MW) og 559 nm (18 mW) at ophidse Calcein og EthD-1.
- Brug en to sekventiel funktion til at erhverve billeder via line-sekvenser uden crosstalk i billedbehandling med de to brugte fluorescensfarvestoffer.
- Brug en detektor med en nyudviklet spektrum at indstilles automatisk forhold i overensstemmelse med fluorescens farvestof i scanning enhed.
- Optimere båndbredder af det detekterede fluorescens for hver kanal til det maksimale. Optag alle erhvervelser sekventielt for at undgå potentiel cross-taler.
- Vælge den bedst egnede billeddiagnostiske vindstille baseret på den fluorescerende farvestof valget med erhvervelse software.
- Anskaf et kort billede, der er oprettet automatisk fra midten i et spiralmønster,med interesseområdet bliver nemt udvalgt til nærmere undersøgelse.
- Vælg observation mode. Vælg op til fem typer af observation transportformer, herunder time-lapse, Z-stack, og multi-område efter behov. Brug en kombination af Z-stack og time-lapse modes i nærværende undersøgelse og færdiggøre hurtigt billedet fanger,
- Ændre og skifte fluorescerende farvestof. Alternativt overlejre fluorescerende og de lyse kontrast billeder med hinanden. Overhold live-billedet ved hjælp af det valgte punkt på venstre nedre kortskærmen.
- Bestem imaging område ved hjælp af framing og zoom funktioner. Eventuelt skifte mellem de displays for hver type af fluorescens farvestof.
BEMÆRK: Mikroskopet bruges i denne protokol har samme funktionalitet som en høj konventionel konfokal i et kompakt design. Mikroskopet er udstyret med omvendte vand-nedsænkning mål, som er optimalt egnede til stabil time-lapse billeddannelse af levende celler med en forenklet indbygget inkubator. - Signal analyse og kvantificering
- Brug imaging software at kvantificere fluorescenssignalet. Opnå fem kort billeder med 10X mål for både testede prøve og celle kontrol.
- Opnået 1.024 × 1.024 pixel regelmæssige billeder, med en 0,231 um × 0,231 um pixelstørrelse. Gem billeder som Olympus Image Format (OIF) for signal analyse. Dette format gør det muligt at lagre forskellige parameterindstillinger og billeder sammen. Brug forskellige analyseværktøjer (måling af intensitet profil, intensitet forholdet mellem de to anvendte kanaler).
- Opbevar den maksimale projektion billeder som 12 bits / pixel TIFF-filer.
- Præforme statistiske analyser ved hjælp af R Commander-softwaren. Analysere forskelle ved hjælp af envejs-variansanalyse (ANOVA) med en gentagelse test. Rapport resultater som gennemsnit standardafvigelse (± SD) og statistisk signifikans ved p <0,05.
Representative Results
Figur 1 viser en oversigt over Live / Dead farvede celler i opnåede kortbilleder (10X objektiv) for både kontrol- og celler udsat for de testede sammensatte ekstrakter (ELS ekstra lav krympning). Den tredimensionelle struktur af celler kunne visualiseres ved forstørrelse 600X. Visualisering af celler indsamlet i styrekammeret og celler opsamlet i kammeret i nærværelse af de testede sammensatte ekstrakter er præsenteret i figur 2. Den maksimale fremspring (mål 60X) viser skæbnen af udvalgte cellepopulationer ved begyndelsen af tidsforskydningen (efter 15 minutter) og ved afslutningen af tidsforløbet periode (5 timer). Halvtreds syv stakke af billeder (xyzt mod scanning, 39 billeder pr stakke, voxel-dybde 1,00 um) blev opnået i denne periode. Et lille fald i den grønne fluorescerende signal og meget lille variation i den røde fluorescerende blev opnået i eksponerede celler. Ingen signifikant variation blev observeret for kontrolceller. Composite ekstrakter eksponerede celler antages lignende spindel morfologi til at styre celler; morfologi blev ikke ændret i disse eksperimentelle betingelser (trods det grønne signal fald og den røde stigning signal i nærvær af den testede komposit). Billedanalyse blev udført på fem udvalgte forskellige billedstakke svarende til forskellige cellepopulationer fra de opnåede billeder af den testede komposit sammenlignet med negative celler for både grøn og rød signalanlæg. Intensiteten profil farvede celler er vist i figur 3; Den grønne og røde signal udviklingen af cellerne i kontakt med den afprøvede komposit var sammenlignelige med dem for kontrolceller. Calcein og EthD-1-Fluorescensemission intensiteter blev målt på kontrol-celler og på sammensatte udsatte celler. Målingen blev udført ved en times mellemrum i op til fem timer. Den grøn / rød fluorescensforhold (baseret på integrerede intensiteter af grønne 495-515 nm og røde 620-650 nm-signaler) Blev beregnet under time-lapse periode. Levedygtighed nøgletal for kontrol og udsatte celler ELS ekstra lav svind ekstrakter vist i T abel 1. I nærværelse af det testede komposit, blev procentdelen af levende celler fundet at falde en smule fra 100% til 93,9% efter 1 time af kontakt. Signifikant forskel blev observeret mellem den testede komposit og den negative kontrol (celler uden nogen sammensatte uddrag) efter 5 timer af den angivne time-lapse periode.
Figur 1: Oversigt over kortlægning billede viste farvede celler på mål 10X, (A) kontrol celler og (B) celler i nærværelse af sammensatte ekstrakter (ELS ekstra lav krympning) i begyndelsen af tidsforløbet periode (t = 15 min). Grønne områder er levende celler og røde områder er beskadigede celler. I denneforsøgsbetingelserne, ingen variation (for både grøn og rød fluorescens) blev observeret for kompositter eksponerede celler i forhold til negative kontrol-celler.
Figur 2: CLSM billeder ved objektiv 60X af en celle population fra (A) kontrol kammer og (B) sammensatte ekstrakter kammer i starten og slutningen af eksponeringen time-lapse periode (I: 15 min og II: 5 timer, henholdsvis ). Grønne områder er levende celler og røde områder er beskadigede celler. Panelet af billederne vist lille ændring i intensitet signal (et mindre fald i den grønne signal og meget lille stigning i den røde). Ingen cellemorfologien ændringer blev observeret i nærværelse af sammensatte planteekstrakter; eksponere celler opretholdt deres spindel-formet og fibroblastisk morfologi som kontrol celler.
Figur 3: Linje profil af celler observeret i time-lapse mikroskopi (a) Kontrollen celler (B) Composite ekstrakter eksponerede celler (i) på 15 minutter, og (II) ved 5 timer.. Ingen synlige variation i det grønne signal udviklingen i nærvær af afprøvet komposit uanset tidspunktet kontakt. Blev imidlertid lille forøgelse af røde signal observeret i nærvær af komposit efter 5 timer for kontakt.
| Kontakt tid (timer) | Cellelevedygtighed (%) | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Kontrolceller | 100 | 100 | 100 </ Td> | 100 | 100 |
| ELS ekstra lav krympning ® | 93,9 ± 7 | 91,3 ± 5 * | 89,5 ± 3 * | 87,6 ± 2 * | 87,7 ± 3 * |
Tabel 1:. Rate af levende celler HGF evolution efter 1, 2, 3, 4 og 5 timer kontakt med sammensatte ekstrakter Cellelevedygtighed blev analyseret ved farvning under anvendelse Live / Dead cytotoksicitet kit. Data viser middelværdier ± SD fem billeder stakke analyse. Værdier er signifikant forskellig fra kontrol celler ved p <0,05.
Discussion
Biokompatibilitet materiale adfærd er den mest forudsætning parameter, der skal evalueres, inden medicinsk brug. Internationale standarder omfatter medicinsk udstyr ISO 10993 33 og specifikt dentalmaterialer ISO 7405 34. Fraværet af de toksiske effekter til de omkringliggende celler er nøglen normen i biokompatibilitet evaluering af sådanne materialer. Derfor er cytotoksicitet test har så stor betydning i vurderingen af dental materiale biokompatibilitet 35-37. ISO foreslog testmetoder kunne baseres på metabolisk aktivitet eller membran integritet. Udvalgte endepunkter bør følge særlige betingelser for ranking bivirkninger som følge af en test materiale for at minimere den tid, og omkostningerne ved de vurderingskriterier assays. Den nuværende metode til undersøgelse (3D konfokal tid lapse imaging) er membran integritet baseret på. Cytotoksiciteten evaluering via denne endpoint synes at være en værdifuld markør for celle biocompatige med testede materialer, og det er også ISO godkendte endepunkt. In vitro tests er designet til at bestemme, hvordan en materialeprøve rammer en særlig celletype. Den kolorimetriske MTT-assay blev oprindeligt beskrevet af Mossman (1983) som en nyttig metode til måling af in vitro cytotoksicitet og celleproliferation. MTT testen er baseret på omdannelsen af tetrazoliumsaltet i formazankrystaller af aktive celler, der bestemmer mitokondriel aktivitet. Dette kan oversættes af levedygtighed sats 38. Gupta og samarbejdspartnere rapporterede, at MTT test er den mest anvendte metode til måling af cytotoksicitet af sammensatte harpikser. Ravsyre dehydrogenase og alkalisk fosfatase reaktioner er også blevet anvendt til samme formål 39. Imidlertid kan fate cellerne ikke følges op, da MTT-assayet kræver dræbe celler på hvert måletidspunkt. For at overvåge nøjere adfærd af de farvede celler i den aktuelle undersøgelse, direkte observation af levende celler blev udført, takket være tid bortfalder CLSM billeddannelse kombineret med en kort protokol farvning, automatiseret billedanalyse og fluorescerende signal kvantificering.
Dental kompositter kommer i tæt kontakt med orale væv, især gingival og pulpa celler. Fibroblaster ville være mål for komponenter frigives fra disse genoprettende kompositter 40-41. Desuden har adskillige undersøgelser rapporteret, at immortaliserede celler og primære celler kan have forskellige cellulære responser i kontakt med biomaterialer. Primære celler blev fundet at være mere hensigtsmæssigt at vurdere biomaterialer effekter 42. Dette forklarer brugen af primære humane gingivale fibroblastceller som celle model for cytotoksicitet vurdering af den testede dental komposit i den aktuelle undersøgelse. Den potentielle toksicitet af de frigivne stoffer fra dental komposit er blevet bredt studeret 43-44. For at vurdere than cytotoksiske potentiale af materialer, kan to kontakt model celler udføres. I direkte kontakt modelsystem materialet placeres direkte med målceller, mens i indirekte kontakt system målceller er i kontakt med elueres fra biologiske medier. I kliniske applikationer og til genoprettende procedurer, er dental komposit placeres i indirekte kontakt med gingival væv. Af denne grund blev den nuværende forsøgsprotokol fokuseret på indirekte kontakt systemet med humane gingivale fibroblaster (celler i nærværelse af de testede sammensatte uddrag). Som tidligere rapporteret af Dahl og samarbejdspartnere, blev cytotoksicitet responser rangeret som alvorlig (<30%), moderat (30-60%), let (60-90%) eller ikke-cytotoksiske (> 90%) baseret på aktivitet i forhold til opnåede værdier for kontrollen 45. Derfor ifølge denne rangordning og på baggrund af de opnåede resultater (tabel 1), komposit ELS ekstra lav krympning kunne rangeret som very svagt cytotoksisk og viste sammenlignelig adfærd til at styre celler i hele tidsforløbet periode. Ved hjælp af nøjagtigt samme undersøgelsesmetode, kan resultaterne af denne undersøgelse i forhold til dem af en nyligt offentliggjort undersøgelse. ELS ekstra lav krympning komposit demonstreret overlegen biokompatibilitet forhold til de to tidligere testede kompositter, der anvendes til samme kliniske anvendelse, der er den direkte restaurering 11. Yderligere undersøgelser er stadig nødvendigt at etablere mere komplet sammenligning.
Når det besluttes, hvilke cytotoksicitetsassay at godkende for en given effektparameter vurdering, er det vigtigt at forstå de fordele og begrænsninger af hver analyse. Hovedformålet med konfokal billeddannelse er at opnå en 3-D struktur af celler og organer. Teknikken er i stand til at afsløre ikke kun en prøve overflade, men også dens undergrunden. Den heri beskrevne protokol understreger anvendelsen af 3D CLSM tid lapse konfokal billeddannelse, som sensitiv metode til vurdering af in vitro-biokompatibilitet opførsel af en dental komposit. Men for at undgå de begrænsninger forekommer i dette arbejde, Vibrationsdæmpende arbejdsstationer kan anvendes for at muliggøre en mere stabil og længere tid bortfalder billeddannelse; bordpladen kunne isolere det brugte konfokale system fra de skadelige virkninger, at vibrationer i laboratoriet kan forårsage. Desuden materialer, som skal anvendes i mundhulen bør ideelt set være uskadeligt for gingival væv og må ikke indeholde stoffer, der kan forårsage systemisk toksicitet. I overensstemmelse med den anvendte metode og de opnåede resultater fra den aktuelle undersøgelse kan det konkluderes, at den testede komposit (ELS ekstra lav krympning) ikke er cytotoksisk i de foreliggende eksperimentelle betingelser. Som CLSM metode følsomt kan give den oprindelige sats på levedygtige celler, kunne forudses andre muligheder for at vurdere flere endpoints. Især da det er blevet for nylig rapporteret, at sammensatte monomerer påvirker cellerne thrdybdegående reaktive ilt arter (ROS) 46- 48, der er behov for yderligere undersøgelser for at vurdere korrelationer hvis nogen mellem cytotoksicitet signalering netværk og ROS produktion. Den fremtidige protokol kunne designes til samtidigt at vurdere produktionen af ROS (H 2 O 2 og / eller O 2 - farvning) og cytotoksicitet forholdet (Live / dead farvning) ved hjælp af tidsforskydningen CLSM billeddannelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
| O2/CO2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
| Live/Dead Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
| ELS extra low shrinkage | Saremco | Dental composite | |
| DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
| Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
| chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
| penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
| Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
| Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |
References
- Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
- Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
- Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
- Geurtsen, W.
- Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
- Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
- Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
- Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
- Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
- Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
- Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
- Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
- Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
- Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
- Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
- Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
- Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
- Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
- Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
- Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
- Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
- Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
- Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
- Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
- Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
- Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
- White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
- Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
- Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
- Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
- Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
- Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
- Williams, D. F.
- Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
- Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
- Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
- Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
- Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
- Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
- Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
- Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
- Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
- Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).
