Introduction
Medicinsk forskning har nydt uhyre fra studiet af både menneskelige cellelinjer og dyremodeller. Cellelinier mulighed for bedre styring af komponenter i et system, samt anvendelse af celler fra den korrekte organisme. Arbejde med humane celler, mens mere repræsentativ, præsenterer en drastisk forenklet øjebliksbillede af mekanismer, som kan være ansvarlig for sundhed og sygdom, fordi cellelinjer ikke kan rekapitulere virkningen af andre celler, stromale komponenter, og organer, der kan påvirke svarene 1. På den anden side, dyremodeller, men ikke helt korrekt at reproducere sygdom hos mennesker og genetisk heterogenitet, tilbyder yderligere indsigt ved at tillade indgang af hele dyret i de fleste modeller 2,3.
Mangler til side, begge metoder har deres fordele og supplerer hinanden. , Det vigtigste mål er dog stadig at studere humane celler og organer, i en fuld krop, multi-organsystem. Derfor translationel forskning har pleaseda store fremskridt i at lette studiet af menneskelige organer og væv udvundet fra patienter, for bedre at forstå de mekanismer underliggende sygdom. Translationel forskning giver den fordel af at studere resultatet af behandlinger og sygdomme i hele kroppen og i egnede celler, hvilket giver det bedste fra begge verdener mellem celle og dyrs arbejde 4.
Translationel forskning er heller ikke uden fejl. Høstede prøver fra humane patienter, ved fjernelse fra værten, der straks udsat for iskæmi og andre eksterne faktorer, som de ville blive ellers beskyttes. Dette kan resultere i stress-induceret molekylære og genetiske ændringer, og forårsage skævhed i efterfølgende undersøgelser. Derfor har mange kræfter er blevet lagt i udvinding og forarbejdning af væv gennem strenge metoder til at bedst at bevare orgel og celle integritet for downstream undersøgelser 5. Vigtigt er det, skal fremtidige applikationer overvejes nøje, når der vælges metoder of behandling humane prøver, som visse metoder kan være til skade for cellulære komponenter og signalveje, mens besparende andre.
For enhver forskning, der involverer menneskelige væv, skal lovgivningsmæssige spørgsmål tages op. Efter Tuskegee og Belmont rapporter, var der en stigende accept af, at biomedicinsk forskning var forbundet med iboende risici ofte resulterer i uundgåelige etiske 6 dilemmaer. Behovet for nationale standarder, blev anerkendt, og den føderale regering skabte Institutional Review Boards (IRBS) som et middel til at værne om principperne om Belmont-rapporten (Respekt for personer, godgørenhed, retfærdighed).
Enhver institutions IRB er et udvalg af læger, forskere og community-medlemmer, der er ansvarlige for at beskytte forskning deltagere. Det kræver, at frivilligt samtykke indhentes fra alle deltagerne i biomedicinske forskningsundersøgelser, og at dette samtykke dokumenteres i et informeret samtykke fo rm. Den informerede samtykke proces har til formål at give tilstrækkelig information til en deltager, således at en informeret beslutning kan foretages om, hvorvidt at tilmelde sig en undersøgelse, eller at fortsætte deltagelsen. I denne forbindelse skal det informerede samtykke dokumentet har god læsbarhed og skal skrives i et sprog, der let kan begribes (6 th til 8. klasse læseniveau) ved målgruppen. Muligheden for tvang eller utilbørlig påvirkning skal minimeres, og skal gives emnet rigelig tid til at overveje deltagelse. Deltageren skal også have lov til at udøve deres ret på noget tidspunkt at trække samtykke i løbet af studiet uden straf. Frivillig informeret samtykke er en obligatorisk forudsætning for et emne deltagelse i forskning, og det er også lovligt effektiv 7.
Som pr reglerne for beskyttelse af forsøgspersoner 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), skal undersøgelsens deltagere underrettes om formålet med forskning, procedurer, der er involveret i forskning, alternativer til deltagelse, alle forudsigelige risici og ubehag (herunder ikke kun fysisk skade, men også muligt psykologiske, sociale eller økonomiske skader, ubehag eller besvær), fordele af forskningen for samfundet og eventuelt til den enkelte, hvor længe forventes emnet at deltage, person til at kontakte for at få svar på spørgsmål eller i tilfælde af en forskningsmæssig skade eller nødsituation, erklæring om, at deltagelse er frivillig, og at afvisning af at deltage, vil ikke medføre nogen konsekvenser eller tab af fordele såsom et kompromis i regelmæssig klinisk pleje at deltageren ellers er berettiget til at modtage som følge af hans / hendes diagnoser, og endelig en erklæring om emnet ret til fortrolighed og retten til at trække sig tilbage fraundersøgelsen til enhver tid uden nogen konsekvenser. Vævsprøver fra deltagere, der trækker samtykke i løbet af undersøgelsen, bør ikke krænges, og skal omgående udtømt. Ophævelse af et eller flere elementer af informeret samtykke kan indhentes hos IRB for nogle forskningsprojekter, der ikke praktisk ske uden en ændring til de nødvendige elementer eller til undersøgelser, hvor nødvendige elementer ikke finder anvendelse. Der skal træffes stor omhu for at sikre datafortrolighed. Health Insurance Mobilitet og Accountability Act (HIPAA) er en føderal lov, der forhindrer brug af eller videregive "beskyttet Health Information" (PHI) uden skriftlig tilladelse fra deltagerne. PHI omfatter, men er ikke begrænset til information om sundhed transmitteres eller opretholdt i nogen form eller medie og indeholder felter, der kunne bruges til at identificere en person 9.
Gennem dette arbejde, vi sigter mod at skitsere den protokol, der skal følges under tissue behandling - herunder indkøb, og opbevaring og understrege vigtigheden af at følge disse strenge retningslinjer for at minimere de skævheder, der kan medføre på grund af de belastninger et væv udsættes for ved ekstraktion. Vi har også bestræbe sig på at give en kort oversigt over de efterfølgende analyser eller analyser (Figur 1), som kan udføres på sådanne enheder, så læserne kan lave en kvalificeret vurdering af, hvad assay (r) passer bedst til deres behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Denne protokol er godkendt af University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Prøve Indkøb
- Saml forskning vævsprøver fra overskydende tumor og relaterede normalt væv 10-12. Gem prøver på våd is for at undgå autolyse.
- Send alle væv, medicinsk udstyr og fremmedlegemer fjernet under en kirurgisk procedure til Patologisk Institut for nødvendigt undersøgelse for at fremme en patologisk diagnose.
- Håndtag væv afsat til forskning i overensstemmelse med gældende forskning og væv bank politikker og procedurer.
BEMÆRK: Biospecimen kollektion indebærer koordinering af patologer, patologer 'assistenter, histotechnologists og væv indkøb specialister.
2. Patologisk kvalitetssikring (QA)
- Udfylde og kontrollere patientjournaler som en tidlig QA foranstaltning og konsultere en patolog til anmeldelse diagnostisk patient poster (patologi rapporter, væv dias, etc.) og vævsprøver. Dommer vævsprøver på morfologiske karakteristika af interesse såsom procent af tumor, nekrose, væv-tumor-interface, etc. Dette er i overensstemmelse med biorepository bedste praksis 10-12.
- Efter indledende gennemgang, føre regelmæssigt tilsyn med biorepository data og forskning prøver under hele længden af opholdet i biospecimen.
- Link resultater og anmærkninger fra histopatologiske og andre undersøgelser til prøver og give disse data til forskerne gennem et proprietært biorepository software system.
BEMÆRK: QA processer sikre integriteten af både de kliniske og tekniske aspekter af biorepository operationer. - Udfør genetiske og molekylære test for at verificere og karakterisere prøverne til klinisk brug.
- Indsamle og analysere data baseret på feedback fra forskere, som har været ved hjælp af prøver til laboratorieforsøg. Sporeprøver ved hjælp af stregkode-teknologi. Dette elektroniske tracking system er også anbefalet i biorespository bedste praksis 10-12.
3. Prøve / Tissue Processing
- Opbevar altid friske vævsprøver på våd is, og processen så hurtigt som muligt, for at begrænse forandringer som følge af udvinding af vævsprøve fra sit naturlige miljø. Proces normal tumor-matchede og tumor vævsprøver separat for at undgå krydskontaminering.
BEMÆRK: Baseret på forskning protokoller, kan biospecimen behandling involvere samling af de prøver i et eller flere medietyper. - Før påbegyndelse af processen, forbereder en steril Petri dyrkningsskål, en skalpel, samt en kanyle eller pincet til vævsbehandling. Sørg for, at rørene er udarbejdet, mærket, og lagt ud for at begrænse tiden på prøve behandling (figur 2).
- Alle relevante væv oplysninger, såsom patientens navn, nummer, behandling, dato forkirurgi, og andre relevante oplysninger, som kan være passende for studiet, bør gøres let tilgængelige i en institutionel væv database. Begrænset patientinformation bør holdes i laboratoriet på papir eller regneark form.
BEMÆRK:. Kun indsamle biospecimen relevante oplysninger om karakteren af den forskning nemlig, grundlæggende biomedicinsk forskning, klinisk forskning, translationel forskning osv For sygdom-specifikke oplysninger, bør biorepository personale indsamle data fra den aktuelle litteratur, der skønnes nødvendige, og for organisationer sikre korrekt diagnose og meningsfuld forskning. Dette omfatter, men er ikke begrænset til tumor kvaliteter og kræft mellemstationer oplysninger. - Planlæg alle ønskede efterfølgende eksperimenter i forvejen, for at træffe afgørelse om størrelsen af vævssnit, der kræves for hver type analyse, samt placeringen af ekscisioner. Ideelt, selv umuligt, bør alle analyser være repræsentative for hele vævssnittet for at tage højde for væv heterogeneity og begrænse skævhed af downstream analyser. Læg alle de krævede elementer i forvejen som vist i figur 2.
- Placer vævspræparatet i det åbne Petri dyrkningsskålen, flade mod overfladen.
BEMÆRK: Lad kun autoriseret biorepository personale til at håndtere identificerede prøver og til at gennemgå identificerede data sundhed. Efterforskere bør få adgang til kun de patient identifikatorer som tilladt af den underskrevne informerede samtykke og som reguleres af IRB. Alle prøver skal være tilstrækkeligt mærket og skal omfatte minimum et unikt væv identifikationsnummer og vævstype. Må ikke indeholde nogen PHI i etiketterne i overensstemmelse med HIPAA regler. - Undersøg prøven fra alle vinkler, for at få en bedre forståelse af dens struktur og dimensioner. Pin prøven til bunden af skålen med nålen, og fortsæt til gennemskære vævet langs dens største og bedste repræsentant akse.
- Klip et lille stykke væv og placere den i et sterilt 1,5 ml MICRocentrifuge rør indeholdende 1 ml af RNA-stabiliserende opløsning. Denne prøve kan placeres på is i den resterende del af processen og opbevaret ved 4 ° C indtil brug.
BEMÆRK: Når du arbejder med RNA, handsker skal altid bæres, og RNAse-fri filter tips bør anvendes til at begrænse risikoen for nedbrydning og RNA forurening. - Lægge ud en åben og præ-mærkede biopsi kassette i låget på Petri dyrkningsskålen. Skære en skive væv ikke tykkere end 3 til 5 mm og overføre den til kassetten. Placer kassetten i 10% Neutral pufret formalin (NBF) for minimum 72 timer. Overfør kassetten i 70% ethanol til langtidsopbevaring før paraffin-indlejring.
BEMÆRK: Mærkning af kassetter bør udføres med blyant eller med anbefalede markører som brug af xylen under behandlingen ellers vil slette etiketter. - Klip et stykke væv og placere den i et væv støbeform. Dæk vævssnittet i optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte, og fryse det sammeved -20 ° C i cryosectioning. Dette vævssnit kan opbevares ved -20 ° C indtil den er klar til cryosectioning.
- Skåret ud af en eller mange vævsstykker og overføre dem til en 50 ml rør indeholdende MACS puffer (1x phosphatpufret saltvand (PBS), 0,5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)) til efterfølgende flowcytometrianalyse . For flowcytometri, kan større prøver være at foretrække som celler kan gå tabt under tumor disassociation, celle fiksering og permeabilisering når det er påkrævet. Generelt kan dette afsnit tages i slutningen, har når alle andre brikker blevet behandlet. Rester af repræsentative tumorprøve kan anvendes til flowcytometri. Eventuelt kan dette rør opbevares ved 4 ° CO / N eller anvendes til flowcytometrisk farvning umiddelbart efter fordøjelse i en cellesuspension (se trin 4 - flowcytometriske farvning).
- Skær resten af væv i stykker ikke større end en maksimal størrelse på 0,5 mm x 0,5 mm og overføre dem til kryogenhætteglas til omgående frysning i flydende nitrogen. Disse snap-frosne prøver kan anvendes til fremtidige analyser og kollaborative formål.
BEMÆRK: Ekstra pleje bør tages, når der arbejdes med flydende nitrogen som direkte kontakt kan forårsage alvorlig personskade. Øjnene skal beskyttes med sikkerhedsbriller med sidebeskyttelse eller med en ansigtsmaske. Kryogene handsker bør også være slidt at beskytte mod flydende nitrogen forbrændinger forårsaget af sprøjt og direkte kontakt. Handsker skal passe ordentligt, men være løs nok til at blive hurtigt fjernes bør flydende nitrogen stænk i dem.
4. flowcytometrisk Farvning
- Tissue Homogenisering
- Forbered fordøjelsen medium med DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) og Collagenase I (2 mg / ml). Fersk eller O / N-lagret tumor i MACS buffer i låget på en petriskål, og nedsænkes med fordøjelsen medium.
BEMÆRK:. Der findes forskellige metoder fordøjelse, hver med fordele (dvs. celleoverfladeprotein expression, levedygtighed). Sørg for at du har den rette metode til den ønskede nedstrøms ansøgning. - Pin tumor til bunden af skålen med en nål, og snit udefra til centrum med en skalpel, indtil tumoren har en pastalignende konsistens. Overfør tumor mix til en 50 ml rør, sæl og sted i en plastikpose for at undgå utætheder. Overføringsrøret til en inkubator, og rotere ved 225 rpm, 37 ° C, 1 time.
- Filter tumorcelle suspensionen gennem en 70 um cellefilter. Centrifuger cellesuspensionen ved 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspender cellepelleten i 1 ml FACS buffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M stamopløsning EDTA, 10 ml FCS eller FBS).
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og resuspender i en koncentration på 1x10 7 celler / ml. Transfer 100 pi per brønd (10 6 celler) i en 96-brønds rundbundet plade til farvning.
- Forbered fordøjelsen medium med DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) og Collagenase I (2 mg / ml). Fersk eller O / N-lagret tumor i MACS buffer i låget på en petriskål, og nedsænkes med fordøjelsen medium.
- Levedygtighed og antistoffarvning
- Tilsæt 200 pi levedygtighedsfarvning opløsning til hver brønd, og bland. INCUBATE i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Spin ned celler ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og supernatanten aspireres.
- Tilføj antistof blanding ved anbefalet / titreret koncentration (som pr fabrikanten) for overfladeantigener i 200 pi FACS-buffer. Cellerne inkuberes ved 4 ° C, 30 min i mørke. Spin ned celler ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og supernatanten aspireres.
- Vask med 200 pi FACS buffer, spin ned celler ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og supernatanten aspireres. Resuspender celler i 200 pi FACS-buffer og fortsæt til flowcytometer til indsamling og analyse.
BEMÆRK: Hvis du udfører intracellulær flowcytometri farvning, udføre fiksering og permeabilisering trin og intracellulær farvning mellem trin 4.2.2 og 4.2.3. Hvis der udføres cytokin-farvning, bør celler være præ-aktiveret foregående farvning som anbefalet, og en hæmmer af intracellulært protein transport og sekretion såsom monensin bør kun anvendes under aktivering tilsikrer tilbageholdelse af opløselige faktorer. Fikserede celler kan opbevares kortsigtede (en uge) ved 4 ° C i mørke forud for erhvervelse på et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor viste resultater skildrer flowcytometri gating strategi for bredt immunrespons fænotypebestemmelse på et forarbejdet melanom tumor. Dagen for farvning blev vævsprøve fordøjet og homogeniseres med collagenase I og DNase I inkubering i 60 minutter ved 37 ° C under 225 RPM rotation. Efter spaltning blev cellesuspensionen filtreres gennem et 70 um cellefilter at fjerne snavs og celler blev farvet med fluorescensmærket flowcytometri antistoffer til immuncelle fænotypebestemmelse. Vist nedenfor (figur 3) er gating strategi og farvning for flere markører på væv opbevaret O / N ved 4 ° C i MACS buffer. Som vist eksemplarer forarbejdet som beskrevet og opbevares O / N i MACS buffer ved 4 ° C viser yderst begrænset dødelighed. Desuden er denne figur viser, at behandling af væv som beskrevet ovenfor tillader flerfarvede brede fænotypebestemmelse af immuncelleundergrupper i melanomtumorer.
s / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
Figur 1. Analyser, der kan gennemføres fra blod- og vævsprøver menneskelige. Oversigt over analyser, der kan udføres efter forarbejdning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Punkter, der kræves til korrekt vævsbehandling og opbevaring. Eksempel på opsætning for vævsbehandling. Væv kan dissekeres i Petri dyrkningsskålen (A) med nålen og skalpel. Repræsentative vævsstykker skal derefter overføres til biopsi kassetten (B), som skal derefter overføres til en beholder NBF (C) for tre dage fiksering ved stuetemperatur. Et andet stykke af væv skal placeres i en kryoformen (D) og dækket i OCT-opløsning før being frosset ved -20 ° C. Et stort stykke væv bør overføres til en 50 ml rør (E) for flowcytometri farvning og kan opbevares ved 4 ° C i MACS buffer O / N. Et lille stykke væv bør overføres til et 1,5 ml rør med RNA-stabiliserende opløsning (F) og opbevaret ved 4 ° C indtil RNA-ekstraktion. Endelig bør sidesten væv skæres i stykker og overført til kryorør (G) til snap-nedfrysning i flydende nitrogen og langtidsopbevaring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flow cytometrisk gating strategi for bredt immunrespons fænotypebestemmelse. Eksempel på bredt immunrespons fænotypebestemmelse gating-strategi ved flowcytometri på melanom tumor lagret O / N ved 4 ° CC. I MACS buffer 13 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I sidste ende, skal metoderne til behandling være dikteret af den ønskede hypotese og forventede tekniske analyser, der skal udføres (figur 1). I det følgende afsnit fungerer som en oversigt til at beskrive potentielle analyser, der kan udføres på sådanne vævssnit. Det er på ingen måde en udtømmende oversigt, men har til formål at hjælpe med vejledning prøve forarbejdningsmetoder og valg af downstream analyser ved at beskrive teknikker og notering deres styrker og svagheder.
Flowcytometri farvning kan udføres på frisk dissekerede vævssnit eller fragmenter lagret O / N i MACS buffer ved 4 ° C. Flowcytometri letter meget specifik fænotypebestemmelse og analyse af cellepopulationer udvundet fra vævsprøver, og tillader farvning af op til 17 celleoverflademarkører og intracellulære proteiner, cytokiner og proteaser i en enkelt celle. Endvidere er visse cytometre tillade enkelt celle forstørrelse, for at bestemme localization af proteiner i cellen i stedet for udelukkende positivitet og intensiteten af signaler. Endelig masse cytometri muliggør kvantificering af mere end 35 proteiner i den samme prøve, med Ulempen er, at celler skal lyseres, og kan derfor ikke være yderligere dyrkes, sorteres, eller analyseret som helhed 14. Denne teknik muliggør analyse af mange markører og proteiner samt detaljeret karakterisering på en enkelt celle niveau. Men flowcytometri kræver væv homogenisering og tab af væv arkitektur og skal udføres på friskt væv for at minimere ændringer i cellefænotype. Det er vigtigt, forsinket opbevaring af væv beregnet til flowcytometri kan påvirke celleindhold, som nogle celleundergrupper kan være mere sårbare over for iskæmi. Phosphoproteiner kan også være dårligt påvises ved flowcytometri, hvis forarbejdning kinetik er suboptimal 15.
Formalin-fiksering og paraffin-indlejring (FFPE) af vævssnit kan være det bedste valg i tilfælde afusikkerhed med hensyn til fremtidige analyser, fordi det giver mulighed høj fleksibilitet i de typer af assays, der kan udføres. Traditionelt er FFPE sektioner sektioneret på en mikrotom i 5 um snit til immunhistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF) farvning. Imidlertid er FFPE væv velbevarede og kan derfor anvendes til flere formål. Faktisk skære tykkere sektioner fra FFPE blokke tillader både DNA og RNA ekstraktion med kommercielt tilgængelige kits, samt omvendt fase Proteinarray (RPPA) analyse 16-18. Følgelig kan behandlingen vævsprøver i FFPE har den fordel, øget fleksibilitet, samt fordelen ved at opretholde vævsstruktur for immunfarvning og derfor giver en mere nøjagtig in vivo-lignende afbildning af vævsstrukturer og cellepopulationer. FFPE muliggør vævssnit, der skal bevares i lange perioder. Denne teknik giver dog har visse ulemper. Tynde sektioner anvendes til FFPE gøreikke højde for væv heterogenitet fra sekventielle snit og vævssnit begynder at oxidere, når de udsættes for omgivende luft derved svække RNA og DNA kvalitet. Endelig, på grund af tværbinding, co-farvning af multiple proteiner ved IHC på FFPE sektioner kræver optimering.
Når mikroskopi gennem IHC eller hvis der ønskes, brug af et OLT forbindelsen er at foretrække. Oktober-lagrede sektioner skal skæres med en cryotome inden det bringes på dias og anvendes til IHC og IF. Oktober bevarer antigeniciteten og minimerer baggrund gør det til det optimale teknik til mikroskopi. Oktober giver også omgående frysning og skæring i forhold til FFPE, som kræver flere dage i NBF. På trods af disse fordele, oktober er generelt mindre stabilt og mindre fleksible end FFPE fordi kun IHC og IF kan udføres fra oktober-vævssnit.
Med hensyn til RNA-analyse, prøver opbevaret ved 4 ° C i RNA-stabiliserende opløsning hærde med tiden, hvilket giver bedre RNA extraction gennem kommercielt tilgængelige kits og udvinding TRIzol, blandt andre. RNA-ekstraktion tillader nedstrøms analyser såsom revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at kvantificere ekspression af transskriberede gener, RNA-sekventering analyse og bredspektret analyse af modulerede gener ved microarray eller nanoString analyse. Følgelig kan RNA isoleret fra væv være ekstremt højt udbytte, ved at give omfattende oplysninger om genekspression og veje ramt af behandlingsformer og sygdomme. Vigtigere er imidlertid, RNA-ekspression kan variere drastisk baseret på væv struktur og prøvetagning størrelse, bør tages så ekstra omhu for at undgå forspænding analyser grundet placering stikprøver. Desuden arten af RNA tyder på, at der kan forekomme dynamiske ændringer i ekspressionsniveauer, så bør også tages ekstra pleje for at sikre ordentlige kinetik følges for at studere gener og veje af interesse 19,20; behandling bør begrænses efter ekstraktion fra RNA-stabiliserende solution at sikre stabilitet. Følgelig er lagring af komplementært DNA (cDNA) af forøget stabilitet foretrækkes frem for RNA (hvis i overensstemmelse med efterfølgende analyse) 21. Endelig fordi RNA ofte kan forstærkes i downstream analyser, kan minute fraktioner af kontaminerende celler resultere i store skævheder i opnåede resultater.
DNA-analyse kan udføres på tidligere lynfrosset vævsprøver eller på FFPE vævssnit. Disse metoder gør det muligt efterfølgende hel exome eller hele genomet sekventering, to teknikker, som har vist enorm løfte gennem identifikation af mutationer og polymorfier i tilknytning til patientens respons og prognose i flere sygdomstilstande sammenhænge. DNA-ekstraktion kan endvidere muligt at identificere T-celle og B-celle-receptor (TCR og BCR) sekvenser til stede i prøver, med henblik på at tilegne sig viden vedrørende antigener og immunrespons i terapi og sygdom 20,21. Sammenlignet med RNA, DNA er meget stabile, når ekstraheret imidlertiddet tager hensyn til transkriptionel og translationel regulering af gener samt post-translationelle modifikationer og regulering 22.
Protein kan ekstraheres direkte fra lynfrosset vævssnit eller fra FFPE prøver med henblik på at udføre Western blot analyser, co-immunpræcipitering at identificere protein-interaktioner og netværk, samt RPPA, et højt udbytte teknik tillader relativ kvantificering af hundredvis af proteiner i en enkelt prøve 23. Men denne teknik muliggør identifikation af kendte proteiner gennem dens krav om specifikke antistoffer. Det er vigtigt, yderligere post-translationel modifikation analyse, såsom protein-phosphorylering, kræver hurtig behandling af væv på grund af ustabilitet 15.
Snap-frysning af prøver er enkel og kræver begrænsede ressourcer. Det giver også langtidsopbevaring af prøver, når der endnu ikke er defineret downstream analyser, undtagen itilfælde af flowcytometri som skal udføres på friske prøver. Snap-frosne prøver kan også let blive delt til kollaborative formål.
I sidste ende, den mængde data, der kan ekstraheres fra et enkelt stykke væv er endeløs. Der er ingen universel rigtige svar på hvilke analyser skal udføres i en given undersøgelse. Hver investigator skal derfor sikre, at han / hun tager højde for alle hypoteser, ønskede eksperimenter samt tilgængelige ressourcer, inden de ansætter patienter og forarbejdning af væv, da det dramatisk kan påvirke udformningen af undersøgelser, og de svar, der er opnået.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af filantropiske bidrag fra John G. og Marie Stella Kenedy Mindefond (Grant # 0727033) og melanom Research Alliance. Forfatterne vil gerne takke University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutionel Tissue Bank (ITB) for koordinering af væv distribution og indsamling og fremme translationel forskning, samt Dr. Ignacio WISTUBA, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Cancer Center Institut for Patologi og melanom Månen Shot program. Endelig forfatterne ønsker at anerkende alle patienter og familier ramt af modermærkekræft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
