Introduction
Medisch onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de studie van zowel menselijke cellijnen en diermodellen. Cellijnen zorgen voor betere controle van componenten in een systeem, alsmede het gebruik van cellen van het juiste organisme. Het werken met menselijke cellen, terwijl meer representatieve, presenteert een drastisch vereenvoudigd momentopname van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de gezondheid en ziekte kan zijn, omdat cellijnen de invloed van andere cellen, stromale componenten, en de organen die reacties 1 kunnen beïnvloeden niet kunnen herhalen. Anderzijds, dierlijke modellen, hoewel niet helemaal correct reproduceren menselijke ziekten en genetische heterogeniteit bieden verder inzicht doordat voor het invoeren van gehele dieren in de meeste modellen 2,3.
Tekortkomingen opzij, beide methoden hebben hun voordelen en zijn complementair. Echter, het belangrijkste doel blijft menselijke cellen en organen te bestuderen in een full body, meerdere organen. Dienovereenkomstig, translationeel onderzoek heeft taken grote vooruitgang in het onderzoek van menselijke organen en weefsels geëxtraheerd uit patiënten te vergemakkelijken, om beter begrijpen van de mechanismen onderliggende ziekte. Translationeel onderzoek biedt het voordeel van het bestuderen van het resultaat van behandelingen en ziekten in het lichaam en in geschikte cellen, waardoor het beste van twee werelden tussen cel en proefdierstudies 4.
Translationeel onderzoek is ook niet zonder gebreken. Geoogst monsters van humane patiënten na verwijdering uit de gastheer, onmiddellijk onderworpen aan ischemie en andere externe factoren waarvan zij anders zouden worden beschermd. Dit kan leiden tot stress geïnduceerde moleculaire en genetische veranderingen en bias in latere studies veroorzaken. Daarom is er veel inspanning in de winning en verwerking van weefsels door strikte methoden om beste orgel en mobiele integriteit te bewaren voor downstream studies 5 gezet. Belangrijker nog, moeten toekomstige toepassingen zorgvuldig worden overwogen bij de keuze van methoden of bewerken van menselijke monsters, zoals bepaalde methoden schadelijk voor cellulaire componenten kunnen zijn en signaalwegen terwijl spaarde anderen.
Voor elk onderzoek waarbij menselijke weefsels, moet regelgeving worden aangepakt. Na Tuskegee en Belmont rapporten groeide aanvaard dat biomedisch onderzoek werd geassocieerd met inherente risico vaak tot onvermijdelijke ethische 6 dilemma. De behoefte aan nationale normen werd erkend en de federale overheid opgericht Institutional Review Board (IRB) als een middel om de principes van de Belmont rapport handhaven (respect voor personen, Weldadigheid, Justitie).
IRB Elke instelling is een commissie van artsen, onderzoekers en leden van de gemeenschap die verantwoordelijk zijn voor de bescherming van deelnemers aan het onderzoek. Het vereist dat vrijwillige toestemming worden verkregen van alle deelnemers van biomedisch onderzoek studies, en dat deze toestemming te worden vastgelegd in een geïnformeerde toestemming fo rm. De geïnformeerde toestemming proces is bedoeld om adequate informatie te verstrekken aan een deelnemer, zodat een weloverwogen beslissing kan worden gedaan over het al dan niet in te schrijven in een studie, of te blijven deelnemen. In dit verband moet de geïnformeerde toestemming document goede leesbaarheid en moeten in taal die gemakkelijk kan worden begrepen (6 e tot 8 ste klas leesniveau) van de doelpopulatie worden geschreven. De mogelijkheid van dwang of ongepaste beïnvloeding moet worden geminimaliseerd, en het onderwerp moet worden gegeven voldoende tijd om de deelname te overwegen. De deelnemer moet ook worden toegestaan om hun recht op instemming in elk stadium terug te trekken in de loop van het onderzoek zonder boete uit te oefenen. Vrijwillige geïnformeerde toestemming is een verplichte voorwaarde voor de deelname van een proefpersoon in het onderzoek en het is ook rechtsgeldig 7.
Zoals aangegeven in de regelgeving voor de bescherming van proefpersonen 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), moeten deelnemers worden geïnformeerd over het doel van het onderzoek, de procedures die betrokken zijn bij het onderzoek, alternatieven voor participatie, alle voorzienbare risico's en ongemakken (waaronder niet alleen lichamelijk letsel, maar ook psychologische, sociale of economische schade, ongemak of overlast), de voordelen van het onderzoek voor de samenleving en eventueel aan de individuele, de lengte van de tijd het onderwerp wordt verwacht om deel te nemen, contactpersoon voor antwoorden op vragen of in het geval van een onderzoek met betrekking letsel of noodgeval verklaring waaruit blijkt dat de deelname vrijwillig is en dat de weigering om deel te nemen zal niet resulteren in de gevolgen of een verlies van voordelen, zoals een compromis in de reguliere klinische zorg dat de deelnemer anders heeft het recht om te ontvangen als gevolg van zijn / haar diagnoses, en tot slot een verklaring met betrekking tot het recht van de patiënt om de vertrouwelijkheid en het recht zich terug te trekken uithet onderzoek op elk gewenst moment zonder gevolgen. Weefsel monsters van deelnemers die tijdens de studie toestemming in te trekken moet niet dwarshelling en moet onmiddellijk worden opgebruikt. Afzien van een of meer elementen van informed consent kan worden verkregen van de IRB voor een aantal onderzoeksprojecten die kunnen praktisch niet worden gedaan zonder een wijziging van de benodigde elementen of voor studies indien nodig elementen zijn niet van toepassing. Grote zorg moet worden genomen om de vertrouwelijkheid van de gegevens te verzekeren. Het Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) is een federale wet die voorkomt dat het gebruik of de openbaarmaking van "beschermde gezondheidsinformatie" (PHI) zonder schriftelijke toestemming van de deelnemers. PHI omvat, maar is niet beperkt tot medische informatie verzonden of gehandhaafd in enige vorm of medium bevat en velden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van een individu 9.
Door middel van dit werk, willen we het protocol dat tijdens de tissu moeten worden gevolgd schetsene processing - inclusief aankopen en opslag en benadrukken het belang van het volgen van deze strikte richtlijnen om de vertekeningen die kunnen ontstaan als gevolg van de spanningen een weefsel wordt onderworpen aan extractie bij minimaliseren. We streven er eveneens naar een kort overzicht van de downstream testen of analyses (figuur 1) dat kan worden uitgevoerd op deze specimens te bieden, zodat de lezer een gekwalificeerd oordeel over welke test (s) het best past bij hun behoeften kunnen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring: Dit protocol wordt goedgekeurd door de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Specimen Procurement
- Verzamel onderzoek weefselmonsters van overtollige tumor en aanverwante normaal weefsel 10-12. Exemplaren te slaan op nat ijs om autolyse te voorkomen.
- Stuur alle weefsels, medische hulpmiddelen en vreemde lichamen verwijderd tijdens een chirurgische ingreep aan de afdeling Pathologie voor noodzakelijke onderzoeken om een pathologische diagnose te vergemakkelijken.
- Handvat weefsel voor onderzoek in overeenstemming met de toepasselijke onderzoek en weefsels banking beleid en procedures toegewezen.
OPMERKING: Biospecimen collectie omvat de coördinatie van de pathologen, pathologen 'assistenten, histotechnologists en specialisten weefsels.
2. Pathologie Quality Assurance (QA)
- Voltooien en controleer patiëntendossiers als een vroege QA maatregel en raadpleeg een patholoog om diagnostische pa beoordelentient verslagen (pathologie rapporten, weefsel dia's, enz.) en weefselmonsters. Rechter weefselmonsters op morfologische kenmerken van belang, zoals het percentage van de tumor necrose, tissue-tumor-interface, enz. Dit is in overeenstemming met biorepository best practices 10-12.
- Na de eerste beoordeling, voeren periodieke evaluaties van biorepository gegevens en onderzoek monsters gedurende de gehele lengte van het verblijf van de biospecimen.
- Link resultaten en aantekeningen van histopathologische en andere onderzoeken naar de monsters en geven deze gegevens aan de onderzoekers via een eigen biorepository software systeem.
OPMERKING: QA processen zorgen voor de integriteit van zowel de klinische en technische aspecten van biorepository operaties. - Voer genetische en moleculaire tests om te controleren en te karakteriseren de monsters voor klinisch gebruik.
- Verzamelen en data gebaseerd op feedback van onderzoekers die gebruiken de monsters voor laboratoriumproeven analyseren. Spoormonsters met behulp van barcode-technologie. Deze elektronische tracking systeem wordt ook bepleit in biorespository best practices 10-12.
3. Specimen / Tissue Processing
- Bewaar verse weefselmonsters op nat ijs en proces zo snel mogelijk, om veranderingen geïnduceerd door extractie van het weefselmonster uit zijn natuurlijke milieu te beperken. Proces normale tumor-geëvenaard en tumor weefsel monsters afzonderlijk om kruisbesmetting te voorkomen.
OPMERKING: Op basis van onderzoek protocollen kunnen verwerken biospecimen verzamelen van de monsters omvatten een of meer soorten media. - Voor het begin van het proces, stelt een steriele Petri-kweekschaal, een scalpel, en een naald of forceps weefseldoorwerkingsmethoden voor. Zorg ervoor dat buizen zijn opgesteld, geëtiketteerd, en uit met het oog op de tijd van het monster verwerking (figuur 2) te beperken vastgelegd.
- Alle relevante weefsel informatie, zoals naam van de patiënt, het aantal, de behandeling, de datum vanchirurgie, en andere relevante informatie voor zover van toepassing voor de studie kan zijn, moet gemakkelijk toegankelijk zijn in een institutionele weefsel databank worden gemaakt. Beperkte patiënt informatie moet worden gehouden in het lab op papier of spreadsheet vorm.
NB. Alleen verzamelen biospecimen informatie om de aard van het onderzoek namelijk relevant fundamenteel biomedisch onderzoek, klinisch onderzoek, translationeel onderzoek, enz. Voor de ziekte-specifieke informatie, het biorepository personeel moeten gegevens die door de huidige literatuur noodzakelijk achtte en betreffende organisaties verzamelen om zorgen voor een goede diagnose en zinvolle onderzoek. Dit omvat, maar is niet beperkt tot tumor status en kanker opvoeren informatie. - Plan alle gewenste volgende experimenten vooraf bepalen van de grootte van weefselsecties voor elke soort analyse, evenals de locatie van excisions. Idealiter, hoewel onmogelijk, alle analyses moeten representatief zijn voor de hele sectie weefsel zijn om rekening te houden met het weefsel heterogeneity en beperken vooringenomenheid van de downstream-analyses. Leg alle benodigde items op voorhand zoals weergegeven in figuur 2.
- Plaats het weefsel model in de open Petri cultuur schotel, vlak tegen het oppervlak.
LET OP: Laat alleen geautoriseerde biorepository personeel geïdentificeerd monsters hanteren en te herzien geïdentificeerd gezondheidsgegevens. Onderzoekers moeten toegang krijgen tot alleen die patiënt identifiers zoals toegestaan door de ondertekende geïnformeerde toestemming en zoals gereguleerd door de IRB. Alle monsters moeten adequaat worden geëtiketteerd en moet ten minste, een uniek weefsel identificatienummer en weefsel type. Bevatten geen PHI in de etiketten, in overeenstemming met de HIPAA regelgeving. - Inspecteer het monster vanuit alle hoeken, om een beter begrip van de structuur en afmetingen krijgen. Speld het monster naar de bodem van de schaal met de naald, en ga verder met het weefsel langs de grootste en beste vertegenwoordiger as halveren.
- Knip een klein stukje weefsel en plaats het in een steriele 1,5 ml MICRocentrifuge buis met 1 ml RNA-stabiliserende oplossing. Dit monster kan op ijs geplaatst gedurende de rest van het proces en bewaard bij 4 ° C totdat het nodig is.
OPMERKING: Bij het werken met RNA, handschoenen altijd gedragen en RNAse-vrij tipjes worden gebruikt om de kansen op RNA degradatie en contaminatie. - Lay-out van een open en pre-gelabelde biopsie cassette in de deksel van de Petri cultuur schotel. Snijd een plakje weefsel niet dikker dan 3 tot 5 mm en overbrengen naar de cassette. Plaats de cassette in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) voor minimaal 72 uur. Breng de cassette in 70% ethanol voor de lange termijn opslag voor paraffine-inbedding.
OPMERKING: Labeling van cassettes dient in potlood of met de aanbevolen markers als gebruik van xyleen tijdens de verwerking anders labels gewist worden uitgevoerd. - Knip een stukje weefsel en plaats het in een weefsel mal. Bedek de sectie weefsel in optimale snijtemperatuur (LGO) verbinding, en onmiddellijk bevriezenbij -20 ° C gedurende cryosectioning. Dit weefselsectie kan worden bewaard bij -20 ° C tot klaar voor cryosectioning.
- Knip een of meerdere stukjes weefsel en overbrengen naar een 50 ml buis met MACS-buffer (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 0,5% foetaal runderserum (FBS), 2 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)) voor daaropvolgende flowcytometrieanalyse . Voor flowcytometrie kunnen grotere monsters voorkeur als cellen verloren tijdens tumor dissociatie, cel fixatie en permeabilisatie wanneer nodig. In het algemeen, kan dit gedeelte worden aan het einde hebben als alle andere stukken verwerkt. Overgebleven representatieve tumor monster worden gebruikt voor flowcytometrie. Eventueel kan deze buis worden bewaard bij 4 ° CO / N of voor flowcytometrische kleuring onmiddellijk na omzetting in een celsuspensie (zie Stap 4 - Flow cytometrische kleuring).
- Snij resterende weefsel in stukken niet groter dan een maximale grootte van 0,5 mm x 0,5 mm en overbrengen naar cryogeneflacons voor onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof. Deze snap-ingevroren monsters kunnen worden gebruikt voor toekomstige analyses en samenwerkend doeleinden.
OPMERKING: Extra zorg moet worden genomen bij het werken met vloeibare stikstof als direct contact ernstig letsel kan veroorzaken. Ogen moeten worden beschermd met een veiligheidsbril met zijstukken of een gezichtsbescherming. Cryogene handschoenen moet ook worden gedragen om te beschermen tegen vloeibare stikstof brandwonden veroorzaakt door spatten en direct contact. Handschoenen moeten goed passen, maar zijn los genoeg om snel worden verwijderd moet vloeibare stikstof splash in hen.
4. Flowcytometrische kleuring
- Weefsel Homogenisering
- Bereid digestie met DMEM medium (40 ml), DNase I (50 U / ml) en collagenase I (2 mg / ml). Plaats vers of O / N opgeslagen tumor in MACS buffer in de deksel van een petrischaal en ondergedompeld met digestiemedium.
NB:. Verschillende spijsvertering methoden bestaan, elk met voordelen (dwz celoppervlakeiwit expression, leefbaarheid). Zorg ervoor dat u de juiste methode voor uw gewenste downstream applicatie. - Pin tumor aan de bodem van de schaal met een naald, en gesneden van buitenaf tot centrum met een scalpel, totdat de tumor heeft een pasta-achtige structuur. Transfer tumor mix in een 50 ml buis, seal en plaats in een plastic zak om lekken te voorkomen. Verbindingsleiding een incubator en draaien met 225 rpm, 37 ° C, 1 uur.
- Filter tumorcel suspensie door een 70 urn cel zeef. Centrifugeer celsuspensie bij 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspendeer celpellet in 1 ml FACS buffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M voorraad EDTA, 10 ml FCS of FBS).
- Tellen cellen met een hemocytometer en resuspendeer in een concentratie van 1x10 7 cellen / ml. Transfer 100 ul per putje (10 6 cellen) in een 96 putjes met ronde bodemplaat voor kleuring.
- Bereid digestie met DMEM medium (40 ml), DNase I (50 U / ml) en collagenase I (2 mg / ml). Plaats vers of O / N opgeslagen tumor in MACS buffer in de deksel van een petrischaal en ondergedompeld met digestiemedium.
- Levensvatbaarheid en antilichaamkleuring
- Voeg 200 ul van levensvatbaarheid kleuroplossing aan elke well en meng. Incuverminder gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Spin down cellen bij 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant.
- Voeg antilichaam mengsel bij aanbevolen / bepaalde concentratie (volgens de fabrikant) voor oppervlakte-antigenen in 200 ul FACS buffer. Incubeer de cellen bij 4 ° C, 30 min in het donker. Spin down cellen bij 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant.
- Wassen met 200 ui FACS-buffer, het afsluiten cellen op 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant. Resuspendeer cellen in 200 ul FACS buffer en ga naar cytometer stromen voor acquisitie en analyse.
LET OP: Als het uitvoeren van intracellulaire flowcytometrie kleuring, voeren fixatie en permeabilisatie stappen en intracellulaire kleuring tussen de stappen 4.2.2 en 4.2.3. Bij het uitvoeren cytokine kleuring moeten de cellen vooraf geactiveerde voorafgaande kleuring, zoals aanbevolen, en een remmer van intracellulair eiwit en secretie zoals monensine te worden tijdens activeringzorgen behoud van oplosbare factoren. Gefixeerde cellen kan worden bewaard kort (één week) bij 4 ° C in het donker vóór verkrijging bij flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hieronder weergegeven resultaten tonen flowcytometrie gating strategie voor brede immune fenotypering op een verwerkt melanoom tumor. De dag van kleuring werd weefselmonster geknipt en gehomogeniseerd met collagenase I en DNase I incubatie gedurende 60 min bij 37 ° C onder 225 rpm rotatie. Na digestie werd celsuspensie gefiltreerd door een 70 um cel zeef om vuil te verwijderen en de cellen werden gekleurd met fluorescentie gemerkte antilichamen voor flowcytometrie immuuncel fenotypering. Hieronder (figuur 3) Getoond wordt de gating strategie en kleuring van meerdere merkers aan weefsels opgeslagen O / N bij 4 ° C in MACS buffer. Zoals getoond, worden monsters verwerkt zoals beschreven en opgeslagen O / N in MACS buffer bij 4 ° C vertonen zeer beperkt mortaliteit. Bovendien, deze figuur toont dat de verwerking weefsel zoals hierboven beschreven maakt multi-color brede fenotypering van immuuncelsubklassen in melanoomtumoren.
s / ftp_upload / 53.189 / 53189fig1.jpg "/>
Figuur 1. Analyses die uit menselijk bloed en weefsel monsters kunnen worden uitgevoerd. Overzicht van tests die na verwerking kan worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Benodigdheden voor een goede weefsel verwerking en opslag. Voorbeeld van setup voor weefsel verwerking. Weefsel kan worden ontleed in de Petri cultuur schotel (A) met de naald en scalpel. Representatieve stukjes weefsel moet dan worden overgebracht naar de biopsie cassette (B), die vervolgens worden overgebracht naar een NBF houder (C) gedurende drie dagen bij kamertemperatuur fixeren. Een ander stukje weefsel moet in een cryomold (D) worden geplaatst en bedekt met oktober oplossing voor being bevroren bij -20 ° C. Een groot stuk weefsel moet worden overgebracht naar een 50 ml buis (E) voor flowcytometrie kleuring en kunnen bij 4 ° C worden bewaard in MACS buffer O / N. Een stukje weefsel worden overgebracht naar een 1,5 ml buis met RNA-stabiliserende oplossing (F) en bewaard bij 4 ° C totdat RNA-extractie. Ten slotte moet overgebleven weefsel in stukken worden gesneden en overgebracht naar cryobuizen (G) voor snap-invriezen in vloeibare stikstof en langdurige opslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Flowcytometrische gating strategie voor brede immuun fenotypering. Voorbeeld van een brede immuun fenotypering gating strategie door flowcytometrie op melanoom tumor opgeslagen O / N bij 4 °;. C in MACS buffer 13 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uiteindelijk moet de verwerkingsmethoden worden gedicteerd door de gewenste hypothese en de verwachte technische assays worden uitgevoerd (Figuur 1). Het volgende deel dient als een overzicht van potentiële tests die kunnen worden uitgevoerd op een dergelijke weefsel secties te beschrijven. Het is geenszins een uitputtend overzicht, maar is bedoeld om gids monster verwerkingsmethoden en de keuze van de downstream assays helpen door het beschrijven van technieken en aanbieden van hun sterke en zwakke punten.
Flowcytometrie kleuring kan worden uitgevoerd op vers ontleed weefselcoupes of fragmenten opgeslagen O / N in MACS buffer bij 4 ° C. Flow cytometrie vergemakkelijkt zeer specifieke fenotypering en analyse van celpopulaties geëxtraheerd uit weefselmonsters, en maakt kleuring van maximaal 17 celoppervlakmerkers en intracellulaire eiwitten, cytokinen en proteasen in een enkele cel. Bovendien zijn bepaalde cytometers laat enkele cel vergroting, teneinde te bepalen localization van eiwitten binnen de cel in plaats van uitsluitend positieve en de intensiteit van de signalen. Tenslotte massa cytometrie maakt de kwantificering van meer dan 35 eiwitten in hetzelfde monster, het nadeel is dat de cellen worden gelyseerd en daarom niet verder gekweekt worden, gesorteerd, of geheel 14 geanalyseerd. Deze techniek maakt analyse van vele markers en eiwitten evenals gedetailleerde karakterisatie op een enkele cel niveau. Echter, flowcytometrie vereist weefsel homogenisering en verlies van weefselarchitectuur en moeten worden uitgevoerd op vers weefsel veranderingen in cel fenotype minimaliseren. Belangrijk vertraagde opslag weefsel bestemd voor doorstroomcytometrie kunnen celinhoud beïnvloeden, zoals sommige cel subsets kwetsbaarder ischemie kan zijn. Fosfoproteïnen ook slecht worden gedetecteerd door flowcytometrie als verwerking kinetiek suboptimaal 15.
Formaline-fixatie en paraffine-inbedding (FFPE) weefsel secties kan de beste keuze in het geval van zijnonzekerheid over toekomstige analyses, omdat het mogelijk maakt grote flexibiliteit in soorten tests die kunnen worden uitgevoerd. Traditioneel worden FFPE secties gesegmenteerd op een microtoom in 5 micrometer secties voor immunohistochemie (IHC) of immunofluorescentie (IF) kleuring. Echter, FFPE weefsels zijn goed geconserveerd en wordt gebruikt voor meerdere doeleinden. In feite, snijden dikkere secties uit FFPE blokken kunnen zowel DNA en RNA extractie met commercieel verkrijgbare kits, en omgekeerde fase eiwit array (RPPA) analyse 16-18. Dienovereenkomstig kan verwerken weefselmonsters in FFPE het voordeel van extra flexibiliteit, alsmede het voordeel van het handhaven weefselstructuur voor immunokleuring en daardoor een meer accuraat in vivo-achtige weergave van weefselstructuren en celpopulaties. FFPE maakt weefselcoupes worden geconserveerd gedurende lange tijd. Deze techniek heeft echter een aantal nadelen. Dunne secties gebruikt voor FFPE doenniet goed voor weefsel heterogeniteit van opeenvolgende bezuinigingen en weefsel secties beginnen te oxideren eenmaal blootgesteld aan de lucht waardoor RNA en DNA kwaliteit aantasten. Tenslotte, als gevolg van verknoping, co-kleuring van meerdere eiwitten door IHC op FFPE secties vereist optimalisatie.
Als microscopie met IHC of IF gewenst is, gebruik van een verbinding oktober voorkeur. Oktober opgeslagen profielen moeten met een cryotoom worden gesneden voordat op dia's worden geplaatst en gebruikt voor IHC en IF. Oktober behoudt antigeniciteit en minimaliseert de achtergrond waardoor het de optimale techniek voor microscopie. Oktober maakt het ook onmiddellijke bevriezing en snijden in vergelijking met FFPE die enkele dagen in NBF vereist. Ondanks deze voordelen, oktober is over het algemeen minder stabiel en minder flexibel dan FFPE omdat alleen IHC en IF kan worden uitgevoerd vanaf oktober-ingebedde weefselcoupes.
Met betrekking tot RNA-analyse monsters opgeslagen bij 4 ° C in RNA-stabilisatieoplossing loop der tijd verhardt, waardoor een betere RNA extraction met commercieel verkrijgbare kits extractie en TRIzol, onder anderen. RNA winvergunningen downstream analyses zoals reverse transcriptie polymerase ketenreactie (RT-PCR) om expressie van genen getranscribeerd, RNA sequentieanalyse kwantificeren en breed spectrum analyse van genen gemoduleerd door microarray of NanoString analyse. Dienovereenkomstig kan RNA geïsoleerd uit weefsels extreem hoge opbrengst door uitgebreide informatie over genexpressie en routes die door therapieën en ziekten. Belangrijker is echter, RNA expressie kan variëren sterk gebaseerd op weefselstructuur en bemonstering grootte, moet dus extra zorg worden genomen om te voorkomen voorspanning analyses te wijten aan bemonstering locatie. Bovendien is de aard van RNA suggereert dat dynamische veranderingen in expressieniveaus kunnen houden dus extra zorg moet worden genomen om een goede kinetiek waarborgen worden gevolgd om genen en pathways plaats 19,20 bestuderen; verwerking moet worden beperkt na extractie van RNA-stabiliserende sPLOSSING om de stabiliteit te garanderen. Bijgevolg wordt de opslag van complementaire DNA (cDNA) van verhoogde stabiliteit de voorkeur om RNA (indien overeenkomstig downstream analyse) 21. Tenslotte, omdat vaak RNA kan geamplificeerd worden in stroomafwaartse analyses minuten fracties van contaminerende cellen kan leiden tot grote vertekening bij verkregen resultaten.
DNA-analyse worden uitgevoerd op eerder snap-ingevroren weefselmonsters worden uitgevoerd, of op FFPE weefselcoupes. Deze methoden staan daaropvolgende exoom of whole genome sequencing, twee technieken die hebben aangetoond immense belofte door de identificatie van mutaties en polymorfismen gekoppeld aan respons van de patiënt en de prognose in meerdere ziekte contexten. DNA-extractie kan identificatie van T-cel en B-celreceptor (TCR en BCR) aanwezig in monsters sequenties verder mogelijk maken, teneinde de kennis met betrekking tot antigenen en immuunrespons in therapie en ziekte 20,21 verkrijgen. In vergelijking met RNA, DNA zeer stabiel eenmaal geëxtraheerd echterzij wel rekening met transcriptionele en translationele regulatie van genen en post-translationele modificaties en regulering 22.
Eiwit kan direct worden gewonnen uit snap-ingevroren weefselcoupes of uit FFPE monsters om Western blot analyses uitvoeren, co-immunoprecipitatie eiwit interacties en netwerken te identificeren, evenals RPPA, een high-yield techniek toelaten van relatieve kwantificatie van honderden proteïnen in een enkel monster 23. Deze techniek maakt de identificatie van bekende eiwitten alleen door de eis van specifieke antilichamen. Belangrijk is verder posttranslationele modificatie analyse, zoals proteïne fosforylatie, vereist een snelle verwerking van weefsel vanwege instabiliteit 15.
Snap-bevriezing van de monsters is eenvoudig en vereist beperkte middelen. Het staat ook op lange termijn opslag van monsters bij downstream analyses nog niet zijn vastgesteld, behalve in deBij flowcytometrie die moeten worden uitgevoerd op verse monsters. Snap-ingevroren monsters kunnen ook gemakkelijk worden gedeeld voor collaboratieve doeleinden.
Uiteindelijk is de hoeveelheid gegevens die uit één stuk weefsel kan worden geëxtraheerd eindeloos. Er is geen universele juiste antwoord waarop assays in een bepaalde studie moet worden uitgevoerd. Elke onderzoeker moet er daarom voor zorgen dat hij / zij houdt rekening met alle hypotheses, gewenste experimenten evenals de beschikbare middelen voor de aanwerving van de patiënten en de verwerking van het weefsel, omdat dit kan dramatische gevolgen hebben voor de opzet van studies en de antwoorden die worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de filantropische bijdragen van de John G. en Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) en de Melanoma Research Alliance. De auteurs willen de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center Institutionele Tissue Bank (ITB) bedanken voor de coördinatie van het weefsel distributie en het verzamelen en translationeel onderzoek te vergemakkelijken, evenals Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, de MD Anderson Cancer Center Afdeling pathologie en het melanoom Moon Shot Program. Tot slot, de auteurs willen alle patiënten en families getroffen door melanoom te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al. Animal models of disease. Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32, 526-532 (2002).
