Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine genaue, kostengünstige, schnelle und ungiftige Methode zur Bestimmung des Geschlechts eines Schweineembryos am Tag 30 mittels PCR-Methode nach dem Mahlen eines Embryos zu Pulver ohne Phenol-Chloroform-Extraktion und DNA-Säulenreinigung.

Abstract

Die Erforschung pränatale Programmierung in das Schwein hat gezeigt, dass das Geschlecht des sich entwickelnden Embryo oder Fötus das Entwicklungsergebnis beeinflussen können. Daher ist die Fähigkeit, ein Embryo, das Geschlecht zu bestimmen, ist notwendig, viele Experimente besonders früh Entwicklung. Dieses Protokoll zeigt, eine kostengünstige, schnelle und nicht-toxische Herstellung von Schweine genomische DNA zur Verwendung mit PCR. Tag 30 Embryonen auf humane Weise den Richtlinien festgelegt nach durch Institutional Animal Politik und Wohlfahrtsausschüsse für das vorliegende Protokoll gesammelt werden müssen. Die Herstellung des gesamten Embryos für diese PCR basiert sexing Technik einfach beinhaltet die gefrorenen Embryos zu einem feinen Pulver Mahlen eines vorgekühlten Mörser und Pistill. PCR-Qualität-DNA wird aus einer kleinen Menge von Embryo Pulver freigesetzt durch eine heiße Inkubation in einem alkalischen Lyse-Reagenz aufgebracht wird. Als nächstes wird die DNA-Lösung mit Neutralisationspuffer gemischt und direkt für die PCR verwendet. Zwei Primerpaare erzeugt UVEKt bestimmte Geschlechtsbestimmungsbereich des Y-Chromosoms (SRY) und ZFX Bereich des X- Chromosoms mit hoher Genauigkeit und Spezifität. Das gleiche Protokoll kann auf andere längliche Embryonen (Tag 10 bis Tag 14) früher als Tag angewendet werden 30. Auch kann dieses Protokoll mit 96 quoll Platten durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Embryos Screening, so dass es möglich für die Automation und Hoch Durchsatz Sex Typisierung.

Introduction

Das Hausschwein hat sowohl eine grundlegende Forschungsgegenstand in der Entwicklung, Genetik und Ernährung in den Bereichen Mensch und Vieh werden. Das Potential von Schweinen als biomedizinische Modelle für die Forschung mit menschlichen können, um ihre physiologischen Ähnlichkeiten zurückgeführt werden. In Nutztiere, kann die Manipulation von Geschlechterverhältnis, die Wirksamkeit der Selektion und Zuchtprogramme ¹ erhöhen. Sexing einzelnen Embryonen ist ein grundlegendes Werkzeug in vielen experimentellen Untersuchungen verwendet, einschließlich, jedoch nicht zu Genotyp, Epigenetik und X-Inaktivierung von Geschlechtsunterschied in der frühen Embryonalentwicklung ² beschränkt.

Studien an Mäusen legen nahe, dass mütterliche Ernährung und andere Faktoren in Geschlechterungleichgewicht ³ führen kann. Bei Schweinen Ursachen des Ungleichgewichts Geschlechterverhältnis sind väterlichen Zucht ^4, Gebärmutter-Kapazität ^5, und die Stoffwechsellage der Sau ^6. Da die beobachteten Unterschiede in Embryonen und Würfe können durch an sich beeinflusst werdenxual Dimorphismus, sollten Forscher bewusst Embryo Sex und Geschlechterverhältnisse, bevor Rückschlüsse auf ihre Forschung zu ziehen. Die Entwicklung von leistungsfähigen Werkzeugen und Protokollen für die Geschlechtsbestimmung Schwein Embryonen an Tag 30 der Entwicklung werden hier diskutiert.

Verschiedene Methoden der Geschlechtstypisierung wurden für genetische Studien in Modellorganismen und Viehzucht entwickelt. Besonders in der Tierhaltung, frühen Embryonen männliche und weibliche Identifizierung ist eine sehr gängige Praxis genetische Selektion für Zuchtprogramme zu verbessern. Am frühen Embryonen in der Schweine Karyotypisierung mit Giemsa ^{7 oder} die intensive Fluoreszenz ^8,9 Techniken wurden für Sex Typisierung verwendet. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und eignet sich nicht für das Screening einer großen Anzahl von Embryonen schnell und genau.

Die effektivste Methode ist, sex Typisierung DNA-Amplifikation eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primern. DNA-Geschlechtsbestimmung durch PCR-Methode ist präziser, schneller und empfindlicher, our erfordert eine winzige Menge von Schaumstoffen. Die erste PCR-basierte Embryo Geschlechtsbestimmung ^{wurde am 10.} Menschen durchgeführt und später in Mäusen ^11, Rinder ^12, Büffel, Schafe ^{13 14} pre-Implantation-Embryonen. Beim Schwein wurde der früheste DNA Sex Typisierungsmethode für Präimplantationsembryonen etabliert über ein einziges Paar von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Primer ^15. Jedoch waren die häufigsten PCR-Primer für die Geschlechtsbestimmung von dem Y-Chromosom der männlichen spezifischen Gens SRY ¹⁶ ausgewählt, und der nicht-geschlechtsspezifischen diskriminierende Bereich einer Zinkfinger-Gen an beiden X und Y-Chromosom ¹⁷ befindet. Anschließend wurden diese Primer wurden in dieser Studie mit verbesserter Spezifität der Primer zu erfassen nur die X- Chromosom eines Zinkfinger-Gen, das Geschlecht Tag 30-Embryonen zu bestimmen aufgetragen.

Genomische DNA aus Schweine Präimplantationsembryonen kann durch Belichten eines intakten Blastozyste mit proteinas zum Puffern extrahiert werdene ^{K 16} oder durch eine Biopsie von wenigen Zellen aus den einzelnen frühen Spaltung unter Embryonen ¹⁵ und für direkte PCR. Jedoch Freisetzung von DNA aus Schweineblut, Haare, Gewebe oder einem großen conceptus über einige Zentimeter groß ist nicht effektiv getan, um die Proteinase K-Methode. DNA-Extraktionsverfahren für diese Materialien wurden ¹⁸ entweder zeitaufwendig Phenol / Chloroform-Protokolle ^{6 oder} teuer Spalte basiert Kits hergestellt. Um die Verwendung von potentiell toxischen Chemikalien zu vermeiden, gibt es einen Trend kostengünstig, einfach und phenolfrei DNA Extraktionsverfahren zu entwickeln. Diese Art von Protokoll für die Isolierung von PCR-Qualität genomische DNA von der Maus ^{19 und} Zebrafisch ²⁰ Geweben wurde unter Verwendung von heißem Natriumhydroxid und Tris (HOTSHOT) etabliert. Diese Studie liefert ein Protokoll DNA mit modifizierten Hotshot und neu gestaltet Duplex Primerpaare für die PCR-Sex Eingabe direkt aus Zelllysaten von Tag 30 Schweineembryonen zu erhalten mithohe Genauigkeit.

Protocol

In Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien und mit Zustimmung der Fakultät Tierpolitik und Wohlfahrtsausschuss - Viehzucht von der University of Alberta, wurden trächtige Sauen durch geschultes Personal bei ungefähr Tag eingeschläfert 30 der Schwangerschaft und Embryonen wurden gesammelt. Verwenden Untersuchungshandschuhen jederzeit im Verlauf der Verfahren.

1. Probenentnahme und Probenlagerung

1. Euthanize Sau mit durch Ausbluten gefolgt Bolzen. Tragen Untersuchungshandschuhe, die Fortpflanzungsorgane und Embryonen aus jeder eingeschläfert Sau zu sammeln.
   Hinweis: Schnelle Entnahme von Proben und Transfer-Embryonen Eis oder flüssiger Stickstoff zum Trocknen in höherer Qualität Gewebe für andere molekulare Arbeiten wie Microarray und qPCR führen.
2. Präparieren Sie die Gebärmutter und sanft trennen alle Embryonen in ihren extraPlazentaMembranen von der darunter liegenden Gebärmutterwand ^21. Achten Sie darauf, keine mütterliche Gewebe Kontamination ist.
3. ReKabellänge und Gewicht aller lebensfähigen Embryonen vor dem Einfrieren.
4. Sammeln Sie jeden einzelnen Embryo und sofort einpacken in einer Aluminiumfolie vor Schnapp mit flüssigem Stickstoff einfrieren.
5. Übertragen Sie die eingefrorenen Embryonen aus flüssigem Stickstoff direkt zu einem -80 ° C Gefrierschrank.

2. Schleif Embryonen

1. Beschriftet alle Probenröhrchen (15 ml) mit dem ID Probe für die Anzahl der erforderlichen Proben werden analysiert.
2. Füllen Thermobehälter mit Trockeneis zu halb voll und legen Sie die Pre-markierten Probenröhrchen in dem Trockeneis.
3. Wear Winterhandschuh mit einem anderen Paar von Untersuchungshandschuhe an der Spitze für die Übertragung der vorgekühlten Mörser und Stößel von -80 ° C Gefrierschrank Eisbehälter zu trocknen.
4. Das tiefgefrorene Embryos innerhalb der Mörtel auf dem Trockeneis.
5. Gießen Sie ausreichend flüssigem Stickstoff, den Embryo zu decken und schleifen sie mit dem Stößel zu einem feinen Pulver.
6. Übertragen des Embryos Pulver zu einer vorher markierten Probenröhrchen mit einem MICRospatula (Abbildung 1) und legen Sie den Schlauch in einem -80 ° C Gefrierschrank.
7. Verwenden Sie ein sauberes vorgekühlten Mörser und Stößel für jeden Embryo und ändern Sie die Untersuchungshandschuhe nach jeder Embryo Schleifkreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.

3. Die genomische DNA-Präparation mit modifizierten Natriumhydroxid Methode

1. Label alle Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml), die für die Anzahl von zu analysierenden Proben.
2. Übertragen Sie die Probenröhrchen enthält Embryo-Pulver aus dem -80 ° C Gefrierschrank in einen Behälter mit Trockeneis vor dem Start.
3. Pipettieren 180 ul 50 mM NaOH (Natriumhydroxid) in jedes pre-markierten Reaktionsgefäß.
4. Aktivieren eines Inkubators und Vorheizen auf 95 ° C.
5. Verwenden einen Zahnstocher die richtige Menge an Pulver Embryo zu übertragen (etwa 5-10 mg) (Abbildung 2) aus dem Probenröhrchen in eine vorge markierten Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 mM NaOH-Lösung enthält.
6. ziehen up die gleiche Zahnstocher langsam die DNA Lysat als klebrig, klebrig, weiß transparent artige Substanz (Abbildung 3) zu visualisieren.
7. Übertragen die Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA Lysat vorgeheizten Brutschrank bei 95 ° C für fünf Minuten. Sofortüberweisung um die Röhre zu einer Styroporbox mit Eis gefüllt.
8. In 20 ul 1 M Tris-HCl direkt in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen. Verwenden, um eine pH-Papier, um sicherzustellen, der pH-Wert beträgt etwa 8,0 (4) vor der Zentrifugation.
   Hinweis: Wenn Sie mit einer großen Anzahl von Probenvorbereitungen zu tun, es akzeptabel ist, nach dem Zufallsprinzip einige Proben nehmen Sie den pH-Wert zu überprüfen.
9. Zentrifugieren des Röhrchens mit der DNA Lysat bei 2000 xg in einer Mikrozentrifuge für zwei Minuten bei Raumtemperatur ungelöst Gewebetrümmer zu entfernen.
10. Transfer 150 ul der oben klare Überstand in ein neues Röhrchen oder Platten mit 96 Vertiefungen.
    Hinweis: Die klare DNA Lysat bereit ist, als Vorlage im PC nutzenR Reaktion und es ist stabil bei 4 ° C für zwei Wochen oder er kann für ein Jahr bei -20 ° C aufbewahrt werden.

4. Design Sex-spezifische PCR-Primer

1. Erhalten Zugangsnummern für Schweine Geschlecht bestimmende Region Y (SRY) (NM_214452.3) und und Zinkfinger-Protein X-chromosomal (ZFX) Gene (XM_005673501.1) von NCBI Webseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Kopieren Sie diese NCBI-Zugangsnummern zu einer Online-Primer-Design-Tool.
   Hinweis: Die beste Primer Informationen einschließlich der Länge, Tm und GC% sowie PCR-Produkt Größe (bp) wird auf dem Bildschirm erzeugt werden (Abbildung 5).
3. Überprüfen der Spezifität dieser Primer Nukleotid BLAST-Programm (Blastn) gegen den Strom porcine genomischen Datenbank 104 diese Sequenzen, um sicherzustellen, werden nur sich auf X und Y-Chromosom für SRY und ZFX jeweils (Abbildung 6).

5. genomischer DNA PCR direkt aus DNA Lysate

1. Benutzennur 1 ul der DNA-Lysat als Vorlage für eine Reaktion 15 ul PCR.
   Hinweis: Ein Hochdurchsatz-Screeningverfahren für 96-Well-Platten PCR kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden, um eine Mehrkanalpipette.
2. Sie haben folgende Möglichkeiten nur für die erste PCR: Vorbereitung einer PCR-Röhrchen für die keine Vorlage Negativkontrolle und zwei zusätzliche Rohre für positive Kontrollen durch Zugabe von 1 & mgr; l (0,5 ng) im Handel erhältlich bekannt Sex Schweine genomischer DNA. Später gehören eine Probe aus dem letzten erfolgreichen Geschlechtsbestimmung Analyse als eine positive Kontrolle und gemeinsam für die Geschlechtsbestimmung mit dem neuen PCR-Reaktion führen.
3. Verwenden Sie eine beliebige HotStart Fertigmischung PCR Enzym und bereiten durch Zugabe von Primern einen Master-Mix und Nuclease Reaktionen freies Wasser in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der PCR. 1 ul der DNA-Lysat in einem bereits vorhandenen PCR-Röhrchen mit 14 ul des PCR-Mastermix. Hinzufügen Primer, so dass die Endkonzentration der Primer aus zwei geschlechtsspezifische Gene 0,3 uM in insgesamt 15 ul PCR reaction.
4. Legen Sie die folgende PCR-Programm in einem Thermocycler up: 95 ° C für 3 min, 35 Zyklen mit jeweils 20 sec Schmelzschritt 98 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Temperschritt bei 65 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Elongationsschritt bei 72 ° C. In einem letzten Schritt, Inkubieren der Reaktionen für 1 min bei 72 ° C und weiter bei 4 ° C bis zur Entfernung der PCR-Röhrchen für die Gelelektrophorese Überprüfung zu inkubieren, das Geschlecht zu bestimmen.
   Hinweis: Die PCR-Bedingungen und Optimierung werden entsprechend der Bedienungsanleitung des PCR-Kits in der Werkstoff-Tabelle erwähnt.
5. In der entsprechenden Menge an nicht-toxischen grün- fluoreszierenden SYBR DNA Gel Fleck, wenn eine 2% TBE Agarose-Gel vor.
   Hinweis: Ethidiumbromid kann für Grün- Fluoreszenzfarbstoff ersetzt werden, wenn es nicht verfügbar ist.
6. In 1,5 ul der Ladepuffer (10x) in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch die Reaktion Puffer PCR Pipettieren up-and-down.
7. Last 10 ul der Probe in die Vertiefung und run das Agarosegel mit entsprechenden Spannungseinstellungen (small Gel-Apparatur bei 100 V, 96-Well-Gel-Apparatur bei 150 V, bis der Farbstoff Band läuft auf halbem Weg durch das Gel).
8. Bitte beachten und die Bänder Intensitäten unter dem Fluoreszenzlicht Einstellung anpassen, um eine Laser-Scanner und ein Bild des Gels erfassen. Hinweis: Gemeinsame Gel-Imager für den Ethidiumbromidgel ersetzt werden.
9. Bestimmen Sie das Geschlecht der Schweineembryonen von Embryonen mit einer Band als eine weibliche und zwei Bänder als männlich (Abbildung 7) zu identifizieren.

Results

Ein repräsentatives Ergebnis der Geschlechtsbestimmung von 345 DNA Lysaten Screening mittels PCR ist in Abbildung 7 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt.

Wie bei 65 ° C in Figur 7 ist der Primer Glühtemperatur sehen ist, ist die optimale Bedingung in diesem PCR-Protokoll ähnliche Intensität und prädizierten Amplikongrößen erzeugen (Figur 5) zwischen de...

Discussion

Die meisten der bestehenden Protokolle im Zusammenhang mit Schweineembryonen DNA Sex Typisierung sind nur für den frühen Stadium vor der Implantation Stufe ^15,16. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für Schweineembryos Screening während der späten Schwangerschaft entwickelt. Basierend auf Studien mit ähnlichen Entwicklungsstadien von Embryonen aus früheren Studien ^6,18 ist die vorliegende Protokoll als sicherer und kostengünstig zu sein.

Dieses Protokoll ist für eine gr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR-Kit	KAPABiosystems	KR0370	andere Hot Start Taq-Polymerase kann nach der Optimierung verwendet werden
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidiumbromid kann durch SYBR Safe
Pig weibliche und männliche genomische DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Positive Kontrollen aus dem Gewebe bekannter Geschlechts-DNA können verwendet werden.
Typhoon FLA 9500 Laserscanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	anderes Bildgebungssystem kann verwendet werden
Kostenlose weiche Nitril-Untersuchungshandschuhe	WWR	89038-270	jeder andere Untersuchungshandschuh kann verwendet werden
Natriumhydroxid, fest	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1,5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	hitzebeständig
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Verwendung als Inkubator für 95 ° C , müssen die Heizung nicht verwenden
Zahnstocher	Bunzl Plc	75200815	Es können alle runden Holzzahnstocher verwendet werden -
Qualitätsholz Mikrozentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	Dieses Modell wurde eingestellt. Es kann aber auch ein anderes neueres Modell verwendet werden
Der Mikroskopspatel	Fisher	SDI28540115	vor jedem Gebrauch autoklaviert.