Introduction
A possibilidade de manipular a actividade celular com uma resolução espacial e temporal precisa representa uma estratégia importante na investigação neuroscientific e no tratamento de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. 1 Os métodos tradicionais são baseados na estimulação eléctrica de células usando eléctrodos posicionado na proximidade ou em contacto com o sistema-alvo, 2 que pode ser de complexidade diferente (célula única rede celular, fatias de cérebro, in vivo tecidos cerebrais). Durante o século passado, o uso de patch-clamp, metal e eletrodos integrados de substrato proporcionaram um quadro detalhado da fisiologia e fisiopatologia de neurônios individuais e dos mecanismos de funcionamento das redes neurais. No entanto, a estimulação elétrica sofre de limitações importantes. O primeiro está relacionado com uma resolução espacial geralmente pobres devido às dimensões físicas dos eléctrodos e sua geometria fixa, que não pode ser facilmente adaptadopara sistemas complexos organizados como tecidos biológicos. Além disso, os problemas relacionados com a impedância de eléctrodos e de conversas cruzadas entre os sistemas de estimulação e de registo pode deteriorar-se a proporção final de sinal-para-ruído das medições. 3 Por outro lado, o uso de luz para a estimulação pode ajudar a superar muitas limitações da abordagem eléctrica. Primeiro de tudo, oferece espacial sem precedentes (<1 mm) e a resolução temporal (<1 ms), tornando-se possível para atingir tipos celulares específicos ou mesmo compartimentos sub-celulares. Além disso, é altamente não-invasivo, uma vez que evita qualquer contacto físico com o tecido de interesse e disentangles estimulação de gravação. Além disso, tanto a intensidade da luz de comprimento de onda e pode ser regulada com precisão e, consequentemente, diferentes protocolos de estimulação pode ser aplicada. 3,4
No entanto, a grande maioria das células de animais não apresentam sensibilidade específica à luz. Várias estratégias para stimulatio ópticoN foram assim propostas, quer explorando mediadores moleculares sensível à luz próxima ou no interior das células, ou utilizando um dispositivo fotoactivo colocado externamente, perto da célula. A primeira categoria refere-se a mecanismos endógenos como a estimulação através de (IR) de luz infravermelha ou visível, bem como a utilização quer de compostos photoisomerizable / fotoclivável ou a expressão genética de actuadores moleculares fotossensíveis (Optogenetics). Esta última classe inclui técnicas de estimulação exógena alcançado com o uso de nano / micro-partículas inorgânicas ou substratos de silício fotocondutoras. 5 No entanto, todos estes sistemas têm lados e inconvenientes brilhantes. Em particular, a absorção de células endógenas na gama do visível é fraco e não é fiável, e a geração concomitante de espécies de oxigénio reactivas pode ser prejudicial para a célula. Em geral, RI é usado para a indução de aquecimento térmico local, devido à absorção de água, mas o coeficiente de extinção de água é pequena, necessitando assim de rRong luz infravermelha (a partir de dezenas a centenas de W / mm2), que é difícil de entregar através de microscopia óptica padrão e podem representar as preocupações de segurança para aplicações in vivo. Por outro lado, os compostos de enjaulamento foto-comutável têm uma ação limitada de tempo e muitas vezes necessitam de luz UV que é difícil de entregar devido à penetração nos tecidos limitado. Além disso, eles sofrem de problemas de difusão dos compostos activada após fotólise fora da área iluminada. Finalmente, ferramentas optogenética permitiram aos cientistas direcionar subpopulação celular específica e sub-compartimentos e estão a emergir rapidamente como uma das tecnologias-chave na pesquisa neurocientífica. No entanto, a inserção de um segmento de DNA exógeno através de um vetor viral levanta questões importantes de segurança, especialmente em vista da adopção, em pacientes humanos. 5,6 Por estas razões, a investigação sobre novos materiais e dispositivos capazes de manipulação óptica celular é um tema extremamente quente.
Recentemente, um romanceabordagem com base na utilização de polímeros conjugados sensíveis à luz, capaz de transduzir eficientemente um estímulo óptico numa modulação da actividade eléctrica da célula, tem sido proposto. A estimulação das células por Polymer fotoexcitação (CSPP) técnica explora muitas características-chave de habilitação típico de semicondutores orgânicos: são intrinsecamente sensível à luz na faixa visível; 7 eles são biocompatíveis, macio e moldável e sua flexibilidade mecânica permite uma interface íntimo com o tecido tanto in vitro e in vivo 8-10. Além disso, eles podem ser facilmente funcionalizados para uma melhor adaptação à interface com células vivas, e para permitir a excitação específica, sentindo capacidades sondagem e 11,12. Além disso, eles oferecem suporte electrónico, bem como transporte iônico, tornando-os ideais para a combinação da biologia anúncio eletrônica 13,14 Curiosamente., eles podem trabalhar no modo fotovoltaico, evitando a necessidade de aplicar um viés externo f15 ou a estimulação da célula óptica eficiente.
A fiabilidade da técnica CSPP foi anteriormente demonstrada em vários sistemas, incluindo neurónios primárias, 15,16 astrócitos, 17 linhas de células secundárias 18 e tecidos da retina explantados. 16 Neste trabalho, todos os passos necessários para o fabrico de um bio-polímero sensível à luz de interface 19 para a estimulação óptico de sistemas in vitro são descritos em detalhe. Como estudo de caso, uma mistura fotovoltaica orgânica prototípico da região regular poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), funcionando como o doador de elétrons, e éster de fenil-C61-butírico-ácido-metil (PCBM), atuando como o receptor de elétrons é empregado. À medida que o sistema biológico, rim embrionário humano (HEK-293), as células são usadas. Um exemplo de um protocolo fotoestimulação com a gravação relativa da actividade das células através de medições electrofisiológicas é fornecido.
A plataforma descritoNo entanto, é de aplicabilidade geral, e pode ser facilmente adaptado para o uso de outros polímeros conjugados (ajustando adequadamente o processo de solução de preparação e os parâmetros de deposição), diferentes tipos de células (por mudar apropriadamente o protocolo de cultura de células, chapeamento procedimento e tempo requerido para semeadura e proliferação celular) e diferentes protocolos de estimulação (comprimento de onda de luz, estímulos de frequência e duração, densidade fotoexcitação).
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Protocol
1. Preparação de Substratos fotoactivos
- Prepara-se uma P3HT: PCBM solução (1: 1 w / w) em clorobenzeno a uma concentração P3HT a 20 g / L. Misture a solução com um agitador magnético durante pelo menos 4 h a 60 ° C. Considere-se um volume de 150 ul de solução para cada substrato a ser preparado.
- Limpas lâminas de vidro revestido de ITO (R-S = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, espessura 170 um) com lavagens sucessivas de água desionizada, acetona e isopropanol num sonicador (10 minutos para cada etapa). Seque as lamelas com uma arma de azoto. Coloque as amostras em um aspirador de plasma potência de 100 W durante 10 minutos.
- Depositar uma película fina de a camada activa sobre os substratos limpos através de spin-coating.
- Com uma ponta de diamante, corte uma lâmina de vidro de microscópio, (≈ espessura 1 mm) para as mesmas dimensões laterais dos substratos revestidos com ITO. Remover o P3HT: PCBM solução de a placa de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente.
- Definir um dois-steps programa spin-coater: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Coloque o slide no mandril do spin-coater e iniciar o vácuo para corrigi-lo. Colocar uma gota de acetona na corrediça e, em seguida, o substrato limpo, com o lado do ITO voltado para cima-revestido. Comece a rotação spin-coater para se livrar do excesso de acetona.
- Coloque 150 ul de P3HT: solução PCBM sobre os substratos e começar de novo o spin-coater (usar o mesmo protocolo descrito em 1.3.2).
- Após o spin-coater tiver terminado, retire a amostra e retire cuidadosamente o substrato revestido a partir da lâmina de vidro. Limpar a parte de trás do substrato com um cotonete de sala limpa embebido em acetona.
Nota: Os substratos fotoactivos pode ser armazenado durante alguns dias numa caixa escura até à sua utilização. Para períodos mais longos, mantê-los em uma caixa de luvas com gás inerte.
2. Preparação de Cultura de Células de médio e Eletrofisiologia Solutions
- Prepara-se o meio de crescimento completo (CGM) paraCélulas HEK-293: Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) inactivado pelo calor não, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Esteriliza-se o meio com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C.
- Preparar a solução extracelular em água ultrapura (concentrações em mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 de glucose, 1,8 CaCl 2, 1 MgCl2. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C.
- Preparar a solução intracelular em água ultrapura (concentrações em mM): KCl 12, 125 K-gluconato, 1 de MgCl2, 0,1 de CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 de ATP-Na2. Note-se que o ATP-Na 2 é sensível ao calor e adicioná-lo pela última vez. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um, da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C.
3. chapeamento HEK-293sobre os substratos Activo
- Colocar o substrato fotoactivo em um copo de vidro coberto com alumínio ou uma placa de Petri fechada e colocar num forno a 120 ° C durante 2 horas, para a esterilização. A partir desse momento, realizar todas as operações em condições estéreis. Coloque as amostras em uma capa estéril e deixe-os arrefecer.
- Revestir o substrato fotoactivo com uma camada de adesão para reduzir a hidrofobicidade de superfície e para promover a adesão celular.
- Coloque os substratos ativos em uma placa de Petri P35 ou uma placa com múltiplas cavidades 6. Dada a hidrofobia da camada de polímero conjugado, fazer um polidimetilsiloxano (PDMS) também para fixar a amostra e confinar as soluções.
- Misturar PDMS e catalisador em uma mistura 10: 1 de proporção com uma vareta de vidro para se obter uma suspensão viscosa.
- Verter a suspensão em uma placa com múltiplas cavidades 6, distribuir uma quantidade suficiente para cobrir a metade de cada poço.
- Espere por polimerização PDMS em RT.
- Corte as PDMS curado no meio para obtaining uma forma quadrada da mesma dimensão da amostra de polímero.
- Esteriliza-se o PDMS poços por imersão em uma mistura de etanol-água a 70% durante pelo menos 30 min.
- Se bem usando os PDMS, arranhar a camada fotoactivo ao longo de toda a borda do poço com uma pinça de pontas, a fim de evitar o desprendimento da camada inteira quando a remoção do PDMS bem após a cultura de célula.
- Cobrir toda a superfície de cada uma das amostras com uma solução de fibronectina (2 mg / L em PBS). Um volume entre 500-750 mL por amostra é geralmente suficiente se um PDMS bem é utilizado (superfície clara do bem: 15x15 mm 2). Sem o PDMS assim, cerca de 2 ml de solução de fibronectina são necessárias para imergir completamente a amostra; prestar atenção que o substrato não flutua na adição da solução. Incubar as amostras a 37 ° C durante pelo menos 1 h.
- Remover a solução de fibronectina com uma pipeta de vidro e lavar uma vez com 2 ml de PBS.
- Coloque os substratos ativos em uma placa de Petri P35 ou uma placa com múltiplas cavidades 6. Dada a hidrofobia da camada de polímero conjugado, fazer um polidimetilsiloxano (PDMS) também para fixar a amostra e confinar as soluções.
- PlComeram células HEK-293 em amostras tratadas com fibronectina a uma densidade de 15.000 células / cm2 em meio de crescimento completo. Utilizar um volume de 750-1.000 ul de CGM para cada amostra, se um PDMS poço é usado, caso contrário, 2-3 ml de CGM são necessárias. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24-48 horas.
4. Optical Stimulation Protocolo e Medidas eletrofisiológicas
- Coloque a solução extracelular num banho de água a 37 ° C a thermalize; descongelar a solução intracelular, colocá-lo em uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 34 e mantê-lo em contato com o gelo para evitar a degradação do ATP.
- Tomar um substrato revestido de células a partir do incubador e remover cuidadosamente o PDMS bem se presente. Remova o meio de crescimento com uma pipeta de vidro e enxaguar a amostra com solução extracelular. Prossiga lentamente para evitar desprendimento de células.
- Coloque o dispositivo para dentro do porta-amostras da estação de electrofisiologia com solutio extracelularn eo eletrodo de referência. Preparar uma solução de micropipetas de vidro para patch-clamp com um puxador (resistência ideal é na gama de 2-4 MQ). Encha metade da pipeta com solução intracelular e montá-lo na micromanipulador.
- Procure uma célula saudável para patch no dispositivo. Para evitar a excitação não desejada do substrato fotoactivo, utilize iluminação IR para a imagiologia, a colocação de um filtro de passagem de comprimento de onda longo (por exemplo, um corte de comprimento de onda λ = 750 nm, pode ser utilizado para os polímeros de absorção no visível) na frente do iluminador microscópio.
- Remendo da célula seleccionada e aplicar o protocolo desejado para a estimulação óptica através da apresentação de luz para a amostra através do caminho de excitação de fluorescência do microscópio (Figura 1). Uma descrição detalhada do protocolo de patch-clamp podem ser encontrados na referência 20.
- Posicionar a pipeta de adesivo em estreita proximidade com a membrana celular com um manipulador micrométrica. Durante o posicionamento, aplicar overpressurE para a pipeta, a fim de evitar a aderência sujidade na ponta. A pipeta deve ser alguns mícrons acima da célula.
- Começar a baixar a pipeta para a membrana celular, enquanto controla a resistência pipeta sobre o software de controle de patch. Quando a resistência da pipeta aumentou cerca de 1 mohms, remover a sobrepressão da pipeta durante a aplicação de uma sucção suave, a fim de formar o gigaseal entre a pipeta e a membrana da célula (isto é, a resistência medida deve aumentar para valores superiores a 1 GÊ) .
- Aplicar um potencial negativo para a pipeta junto à célula esperado potencial de repouso (por célula HEK293 um potencial de -40 mV podem ser usados) para ajudar a estabilizar o vedante. Compensar os transientes capacitivos devido à capacitância pipeta com os comandos relativos, o amplificador de patch e / ou o software de controlo de remendo.
- Quebrar a membrana para permitir o acesso eléctrico para o citoplasma da célula por aplicação de um breve pulso de sucção e intensapara a pipeta. Definir o amplificador de patch para o modo de fixação de corrente (i = 0, ou seja, sem corrente injectada para dentro da célula) para controlar o potencial de membrana celular. Espera alguns minutos para ver se o potencial da célula é estável.
- Aplicar o protocolo de iluminação desejado para a célula e registar o efeito sobre o potencial de membrana.
Nota: A iluminação pode ser entregue à amostra, quer a partir do fundo ou do topo, dependendo da arquitectura do microscópio.- Seleccionar um comprimento de onda de excitação que é bem absorvido pelo material activo; para o P3HT: PCBM mistura, um comprimento de onda na gama de 450-600 nm podem ser usados. Densidades fotoexcitação adequados estão na gama de 10-100 mW / mm 2.
Nota: pulsos curtos de luz (abaixo de 10-20 ms) resultam de uma despolarização transiente da célula, enquanto que com iluminação prolongada (centenas de milisegundos ou mais) de pulsos hiperpolarização prolongada é observado até que a luz é desligada.
- Seleccionar um comprimento de onda de excitação que é bem absorvido pelo material activo; para o P3HT: PCBM mistura, um comprimento de onda na gama de 450-600 nm podem ser usados. Densidades fotoexcitação adequados estão na gama de 10-100 mW / mm 2.
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Representative Results
As células podem ser facilmente cultivadas em P3HT: substratos PCBM, desde que uma camada de adesão é depositado adequado (como a fibronectina usado no passo 3.2 do protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorção óptica na parte verde do espectro visível; No entanto, outros polímeros conjugados sensíveis à luz pode ser seleccionada, de acordo com a faixa de comprimentos de onda preferida fotoestimulação (Figura 2). A biocompatibilidade destes substratos foi demonstrada não apenas com linhas de células, como células HEK-18,21 293, mas também com culturas primárias de neurónios e astrócitos 17 15 Uma micrografia típica de saudáveis HEK-293 células cultivadas em um P3HT:. PCBM filme é mostrado na Figura 3. óptica estimulação de células mediada pelos substratos fotoactivos pode resultar em diferentes efeitos sobre a membrana celular, dependendo da duração do estímulo luminoso. 18 Com o aparecimento do impulso de luz, umapico rápido (com uma intensidade de cerca de 3 mV e uma duração de cerca de 1 ms) pode ser observada na membrana celular gravações potenciais (Figura 4). Este sinal é devido a uma carga capacitiva da interface polímero / electrólito sobre geração de carga no material activo.
Após este cravação inicial rápido, uma despolarização transitória (com uma intensidade de cerca de 1 mV e uma duração da ordem de dezenas de milissegundos) é observada na célula (Figura 4). Para pulsos curtos de luz, como a luz é desligada, um comportamento oposto é observado. Estes sinais foram atribuídos a uma variação na capacitância da membrana devido a um aquecimento local a seguir à absorção de luz.
Para a iluminação prolongada, no entanto, a despolarização inicial durante os pulsos de luz se transforma em uma hiperpolarização celular (Figura 5). Este fenómeno tem umobter uma origem térmica, mas, neste caso, está relacionado com uma variação do potencial de equilíbrio da membrana devido a uma mudança nos canais iónicos condutividades induzidos pelo aumento da temperatura.
Figura 1. Esquema do substrato fotoactivo. As interfaces fotoactivos utilizadas para a estimulação celular óptica são feitos de uma fina película de semicondutores orgânicos que são depositados sobre um substrato de vidro ITO revestido. As células podem ser cultivadas diretamente sobre as superfícies do dispositivo depois de ter sido tratada com uma camada de adesão adequada (por exemplo, fibronectina). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Absorp Os espectros ção de diferentes polímeros conjugados. A utilização de películas finas de semicondutores orgânicos podem permitir grande comprimento de onda de excitação em tunability mantendo uma transparência parcial do substrato. Como exemplo, o espectro de absorção de diferentes polímeros conjugados normalmente utilizados em sistemas fotovoltaicos são relatados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. células HEK-293 cultivadas num substrato fotoactivo. Micrografia típica de células HEK-293 células de cultura na superfície de um substrato fotoactivo após 24 h de incubação. Barra de escala, 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. estimulação óptica de células HEK-293 com 20 pulsos de luz mseg. Variação do potencial de membrana de uma célula HEK-293 induzida por um impulso de 20 ms de luz. Um pico inicial rápido sobre o início da luz é seguido por uma despolarização da célula durante o impulso. Como a luz é desligada, um comportamento oposto é observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. estimulação óptica de células HEK-293 com 200 impulsos de luz mseg. Variação do potencial de membrana de uma célula HEK-293 induzida por um pulso de 200 ms de luz. A despolarização inicial observado para curto illuminação é apenas um fenômeno transitório, que depois de algumas dezenas de milissegundos de iluminação prolongada transforma em uma hiperpolarização da célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas do protocolo relatado para in-vitro estimulação óptica de células essencialmente com a escolha do polímero sensível à luz, os parâmetros de esterilização térmica, a intensidade ea duração dos estímulos luminosos. A P3HT: película fina PCBM foi selecionada aqui, uma vez que garante uma boa estabilidade temporal e eletroquímica. No entanto, deve-se notar que nem todos os polímeros sensíveis à luz pode oferecer performances analógicos, 22, mais especificamente, sobre a iluminação. Além disso, neste caso, seleccionado de esterilização térmica parâmetros não conduza a uma degradação considerável dos recursos optoelectrónicos de polímero; aviso no entanto, que, no caso do método de esterilização ou os parâmetros de tratamento térmico são alteradas, possíveis efeitos sobre as propriedades do polímero deve ser avaliada cuidadosamente. Sabe-se, por exemplo, que a exposição à radiação UV conduz rapidamente ao branqueamento polímero degradação irreversível e, devido à perda de conjugação. Além disso, o recozimento diferentetemperaturas e duração podem levar a ordem diferente morfológica de superfície do polímero, com efeitos negativos sobre as propriedades de transporte de carga eléctrica. Os parâmetros do protocolo fotoexcitação devem ser cuidadosamente avaliadas, bem como: densidade de excitação acima de 100 mW / cm 2, e / ou estímulos prolongados, pode facilmente levar a degradação do polímero e falha do protocolo fotoestimulação. Outro passo crítico no protocolo consiste na utilização de uma camada de adesão de proteína, devido ao elevado grau de hidrofobicidade do P3HT: PCBM superfície. Se não houver camada de adesão é utilizado na realização do interface de bio-polímero, a sementeira e a proliferação celular pode ser seriamente comprometida.
Dentro dos passos e restrições críticas acima mencionadas, no entanto, o protocolo relatado pode ser directamente modificada, de acordo com as necessidades e objectivos específicos experimentais. Outros polímeros sensíveis à luz estáveis podem ser encontrados, 7 a partir de vários COMmercial fornecedores ou por sintetizar novos compostos corretamente. Isto permite o uso de comprimentos de onda de excitação diferentes, que vão desde o azul ao vermelho e gama NIR. Além disso, a técnica de deposição de polímero não se restringe à utilização de revestimento por rotação. Com efeito, pode prever-se outros métodos que assegurem uma boa homogeneidade e espessura de filme adequado, tal como impressão por jacto de tinta, revestimento por pulverização, ou BLADING Os efeitos do contacto prolongado com os suportes de cultura da célula e do método de esterilização deve ser avaliada para cada novo material tomados em consideração. Embora o uso de camadas de adesão de proteínas é necessária para obter boas culturas de células no topo das superfícies de polímeros, a utilização específica da fibronectina, como aqui relatado, não é obrigatório. Diferentes camadas proteína de adesão podem ser utilizados, também, de acordo com a linha de células a crescer; 21 Por exemplo, as células neuronais são geralmente cultivadas em uma camada de poli-L-lisina. Finalmente, os protocolos de iluminação pode ser alterada e adaptada para o SPecific necessidades, em termos de comprimento de onda, tamanho do ponto, a densidade de energia de excitação, duração do estímulo tempo e frequência, sentido de incidência da luz (a partir do substrato, ou a partir do banho de electrólito). Como brevemente mencionado acima, no entanto, a definição dos parâmetros de protocolo deve levar em conta a gama de polímero óptico absorção e possíveis efeitos de degradação, que pode variar muito de caso para caso.
A estabilidade temporal limitado e eletroquímica de alguns polímeros sensíveis à luz, na verdade, representa as principais limitações da técnica. Além disso, a utilização de polímeros comerciais sem qualquer purificação adicional pode conduzir em alguns casos a repetibilidade limitado de resultados entre diferentes lotes de material, devido aos diferentes graus de pureza.
Observamos também que os mecanismos precisos na base do efeito phototransduction em protocolos CSPP ainda precisa ser mais bem investigado e caracterizadas. Térmica, elétrica e química phenomena são possivelmente envolvidos, em diferentes graus em diferentes modelos biológicos. Um entendimento completo será fundamental para explorar plenamente a técnica. Em particular, a ocorrência de fenómenos mediados por calor deve ser revisto como uma limitação da técnica, uma vez que podem ser mal controlada, e pode conduzir a efeitos sobreaquecimento local, em especial no caso de aplicações in vivo. A implementação específica do dispositivo, destinado a controlar a difusão de calor no ambiente extracelular pela engenharia adequada dos caminhos condutores de calor, pode revelar necessário no futuro próximo para a plena exploração da técnica.
Na literatura, diversas técnicas que utilizam impulsos ópticos para estimulação mediada por temperatura de células e tecidos, podem ser encontrados tanto in vitro e in vivo. Nestes estudos, a absorção de raios laser infravermelhos pela água é normalmente utilizada como um mecanismo de transdução. 23-25 No que diz respeito ao infravermelhoEstimulação Neural, o mecanismo CSPP tem vantagens distintas, especialmente para experimentação in vitro. CSPP baseia-se na luz na gama do visível e de intensidade moderada, de modo que a estimulação pode ser fornecida pelo caminho de excitação de um microscópio de fluorescência padrão. Pelo contrário, a absorção de água exige que comprimentos de onda no infravermelho (principalmente em torno de 1,45 uM e 1,93 uM), que tem que ser entregue à amostra através de fontes externas, como fibras ópticas micromanipulados na proximidade da preparação, uma vez que o trem óptico de um padrão microscópio não pode ser usado em tais comprimentos de onda. No caso de CSPP, os padrões de luz obtidos com sistemas de controlo de laser, bem como os moduladores espaciais de luz pode ser acoplada directamente ao trem óptico da maioria dos microscópios. Desta forma, a fotoestimulação de substratos à base de semicondutores orgânicos pode tornar possível a obtenção de estimulação de várias células no campo de visão de forma independente, com uma elevada tanto temporais resolução espacial nd.
Outra alternativa altamente valiosa para a estimulação óptico é oferecido por métodos genéticos, com base na expressão de sondas segmentado em células geneticamente fotoactiváveis. Optogenetics oferece hoje em dia resolução temporal e espacial sem precedentes, com intensidades de iluminação típicos na gama de algumas dezenas de mW / mm 2, tanto pode estimular e inibir a actividade eléctrica, e pode ser geneticamente orientada para sub-populações específicas de regiões específicas do cérebro de interesse. No entanto, ainda apresenta alguns problemas que têm de ser resolvidos. Em particular, as preocupações de segurança relacionadas com a utilização de vírus para a expressão génica, especialmente nos seres humanos, e a consecução da expressão da proteína heteróloga estável e controlada de longo prazo ainda representam os maiores desafios. CSPP técnica permite contornar a necessidade de transferência de genes, e todos os problemas de segurança relacionados, que são particularmente relevantes para aplicações in vivo.
jove_content "> Em resumo, o método CSPP oferece várias vantagens em relação às técnicas de fotoestimulação endógenos. Uma vez que não é invasiva, que pode ser facilmente acoplado a qualquer estação de trabalho electrofisiológico existente e não requer fontes de laser complexos ou transfecção genética, enquanto manter a alta seletividade espacial e temporal. Por estas razões, CSPP é uma promessa para se tornar uma ferramenta complementar na neurociência in-vitro investigações, e abrir novas perspectivas em aplicações in vivo. No entanto, um grande esforço da ciência dos materiais, física e engenharia comunidades é esperado nos próximos anos, necessários para refinar, otimizar e explorar plenamente a técnica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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