A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.
Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.
האפשרות לתפעל את הפעילות הסלולר עם רזולוציה מרחב ובזמן מדויקת מייצגת אסטרטגיה מרכזית במחקר נירולוגית מדעי ובטיפול בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. 1 שיטות מסורתיות מבוססות על גירוי חשמלי של תאים באמצעות אלקטרודות הממוקמים בקרבה או במגע עם המערכת ממוקדת, 2 אשר יכול להיות שונות של מורכבות (תא בודד, רשת סלולרית, פרוסות מוח, ב- vivo רקמות מוח). במאות השנים האחרונות, השימוש בתיקון מהדק, מתכת ואלקטרודות משולבות מצע סיפק תמונה מפורטת של הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של נוירונים בודדים ושל מנגנוני התפקוד של רשתות עצביות. עם זאת, גירוי חשמלי סובל ממגבלות חשובות. הראשון קשורה לרזולוציה מרחבית ירודה בדרך כלל עקב ממדיו הפיזיים של אלקטרודות והגיאומטריה הקבועה שלהם, שלא ניתן להתאים בקלותלמערכות מאורגנות מורכבות כמו רקמות ביולוגיות. כמו כן, בעיות הקשורות לעכבת אלקטרודות ודיבורים צולבים בין מערכות גירוי והקלטה עלולות להידרדר יחס אות לרעש הסופי של המדידות. 3 מצד השני, השימוש באור לגירוי עשוי לעזור להתגבר על מגבלות רבות של גישת החשמל. קודם כל, היא מציעה מרחבי חסרי תקדים (<1 מיקרומטר) ורזולוציה של זמן (אלפיות שנייה <1), מה שמאפשר למקד סוגי תאים ספציפיים או אפילו תאים תת-תא. בנוסף זה מאוד לא פולשנית שכן הוא נמנע מכל מגע פיזי עם הרקמה של עניין ומתיר גירוי מהקלטה. יתר על כן, שתי עוצמת אור באורך גל ויכולים להיות מוסדר דווקא וניתן ליישם פרוטוקולי גירוי כך מגוונים. 3,4
עם זאת, הרוב המכריע של תאים של בעלי חיים אינו מציג שום רגישות ספציפית לאור. כמה אסטרטגיות לstimulatio אופטיn יש לי כך הוצע, או ניצול מתווכים מולקולריים רגיש לאור סמוך או בתוך התאים, או באמצעות מכשיר photoactive להציב חיצוני, קרוב לתא. הקטגוריה לשעבר מתייחסת למנגנונים אנדוגניים כמו הגירוי באמצעות אור נראה או אינפרא אדום (IR), כמו גם השימוש בשני תרכובות photoisomerizable / photocleavable או הביטוי הגנטי של מפעילים רגישים מולקולריים (optogenetics). הכיתה האחרונה כוללת טכניקות לגירוי אקסוגני שהושג עם השימוש של ננו / מיקרו-חלקיקים אורגניים או מצעי סיליקון photoconductive. 5 עם זאת, יש את כל המערכות הללו צדדים וחסרונות בהירים. בפרט, קליטת אנדוגני של תאים בטווח הנראה לעין היא חלשה ולא אמינה, והדור הנלווה של מיני חמצן מגיבים עלולה להזיק לתא. באופן כללי, IR משמש לגרימת חימום תרמי מקומי עקב ספיגת מים, אבל מקדם ההכחדה של מים הוא קטן, ולכן דורש stאור אינפרא אדום רונג (מעשרות עד מאות W / 2 מ"מ) שקשה לספק באמצעות אופטיקה מיקרוסקופ הרגילה ועלולים להוות חששות בטיחות עבור יישומים ב- vivo. מצד השני, יש לי תרכובות כליאת צילום החלפה מוגבלת פעולה בזמן ולעתים קרובות דורשות אור UV שקשה לספק בשל חדירת רקמה מוגבלת. בנוסף הם סובלים מבעיות דיפוזיה של התרכובות מופעלות על photolysis מחוץ לאזור המואר. לבסוף, כלים optogenetic אפשרו למדענים לכוון תת-אוכלוסייה סלולרית ספציפית ותת-תאים והם מתפתחים במהירות כאחת הטכנולוגיות המרכזיות במחקר נירולוגית מדעי. עם זאת, החדרת מקטע DNA אקסוגני באמצעות וקטור ויראלי מעלה סוגיות בטיחות חשובות, במיוחד לאור האימוץ בחולים אנושיים. 5,6 מסיבות אלה, מחקר על חומרים ומכשירים חדשים מסוגלים מניפולציה אופטית תא הוא נושא חם מאוד.
לאחרונה, רומןהגישה מבוססת על השימוש בפולימרים מצומדות רגיש לאור, יוכלו transduce גירוי אופטי ביעילות לאפנון של פעילות החשמלית של תאים, הוצעה. גירוי התא על ידי פולימר Photoexcitation (CSPP) טכניקה מנצלת תכונות רבות המאפשרים מפתח האופייני של מוליכים למחצה אורגניים: הם מהותי רגישים לאור בטווח הנראה לעין; 7 הם ביולוגית, רכים וconformable והגמישות המכנית שלהם מאפשרת ממשק אינטימי עם רקמה גם במבחנה וב- vivo 8-10. חוץ מזה, הם יכולים להיות פונקציונליות בקלות טובה יותר להסתגל לממשק עם תאי חיים, ולאפשר לעירור ספציפי, חיטוט וחישת יכולות. 11,12 יתר על כן, הם תומכים אלקטרוניים, כמו גם תחבורה יונית, שהופך אותם אידיאליים לשילוב ביולוגיה מודעת אלקטרוניקה. 13,14 מעניין, הם יכולים לעבוד במצב פוטו, למנוע את הצורך ליישם F הטיה חיצוניאו גירוי אופטי תא יעיל. 15
האמינות של טכניקת CSPP כבר הוכיחה בעבר בכמה מערכות, כוללים נוירונים עיקריים, 15,16 האסטרוציטים, 17 קווים משניים תא 18 ורקמות רשתית explanted. 16 בעבודה זו, בכל הצעדים הדרושים כדי להמציא ביו-פולימר רגיש לאור ממשק 19 לגירוי אופטי של מערכות ב- מבחנה מתואר בפירוט. כמקרה מבחן, תערובת פוטו אורגנית טיפוסית של האזור-רגיל פולי (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), מתפקד כתורם אלקטרונים, ואסתר פניל-C61-butyric-חומצה-מתיל (PCBM), הפועל כ מקבל אלקטרונים הוא מועסק. כמערכת הביולוגית, תאי כליה העוברית אנושי (HEK-293) משמשים. דוגמא לפרוטוקול photostimulation עם ההקלטה היחסית של פעילות תאים באמצעות מדידות אלקטרו מסופקת.
הפלטפורמה תיארהעם זאת תוקף כללי, וניתן להאריכה בקלות לשימוש בפולימרים מצומדות אחרים (על ידי התאמת תהליך פתרון ההכנה ופרמטרי התצהיר כראוי), תאים מסוגים שונים (על ידי שינוי כראוי פרוטוקול תרבית תאים, ציפוי הליך ושעה רצוי לזריעת תאים והתפשטות) ופרוטוקולים שונים גירוי (אורך גל אור, תדירות ומשך זמן גירויים, צפיפות photoexcitation).
שלבים קריטיים של הפרוטוקול דיווח ב- מבחנה גירוי אופטי של תאים בעיקר נוגע לבחירה של הפולימר רגיש לאור, פרמטרים עיקור התרמיים, העצמה והמשך הזמן של גירויי אור. P3HT: סרט דק PCBM נבחר כאן, שכן הוא מבטיח יציבות זמנית ואלקטרוכימיים טובה. עם זאת, יש לשים לב שלא כל הפולימרים הר…
The authors have nothing to disclose.
The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA,
Telethon – Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).
rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |