Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

La possibilità di manipolare l'attività cellulare con una risoluzione spaziale e temporale preciso rappresenta una strategia fondamentale nella ricerca neuroscientifica e nel trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici. ¹ metodi tradizionali si basano sulla stimolazione elettrica delle cellule utilizzando elettrodi posizionati in prossimità o in contatto con il sistema mirato, ² che può essere di diversa complessità (singola cellula, rete cellulare, sezioni di cervello, in vivo tessuti cerebrali). Nel secolo scorso, l'uso di patch-clamp, metallo e elettrodi substrato integrato hanno fornito un quadro dettagliato della fisiologia e fisiopatologia dei singoli neuroni e dei meccanismi di funzionamento delle reti neurali. Tuttavia, la stimolazione elettrica soffre di importanti limitazioni. Il primo è legato a una risoluzione spaziale generalmente scarsa a causa delle dimensioni fisiche degli elettrodi e la loro geometria fissa, che non può essere facilmente adattatoa sistemi organizzati complessi come i tessuti biologici. Inoltre, i problemi relativi alla impedenza elettrodi e di cross-talk tra sistemi di stimolazione e di registrazione possono deteriorare il rapporto finale segnale-rumore delle misurazioni. ³ D'altra parte, l'uso di luce per stimolazione può contribuire a superare molte limitazioni dell'approccio elettrico. Prima di tutto, offre spaziale senza precedenti (<1 um) e risoluzione temporale (<1 msec), rendendo possibile bersaglio specifici tipi cellulari o anche compartimenti sub-cellulari. Inoltre è altamente non invasiva poiché evita qualsiasi contatto fisico con il tessuto di interesse e districa stimolazione da registrazione. Inoltre, sia l'intensità della luce e lunghezza d'onda può essere regolata con precisione e possono essere applicati protocolli di stimolazione così diverse. ^3,4

Tuttavia, la maggior parte delle cellule animali non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce. Diverse strategie per stimulatio ottican sono stati quindi proposti, sia sfruttando mediatori molecolari fotosensibili nelle vicinanze o all'interno delle cellule, o utilizzando un dispositivo fotoattivi collocato esternamente, vicino alla cella. La prima categoria si riferisce a meccanismi endogeni come la stimolazione tramite (IR) di luce visibile o infrarossa, così come l'uso di composti photoisomerizable / photocleavable o l'espressione genetica di attuatori molecolari fotosensibili (optogenetics). Quest'ultima categoria comprende tecniche di stimolazione esogena ottenuta con l'uso di nano / micro-particelle inorganiche o substrati di silicio fotoconduttori. ⁵ Tuttavia, tutti questi sistemi hanno lati luminosi e svantaggi. In particolare, l'assorbimento endogena di cellule nel visibile è debole e non affidabile, e la generazione contemporanea di specie reattive dell'ossigeno può essere dannoso per la cella. In generale, IR viene utilizzato per indurre il riscaldamento termico locale dovuto all'assorbimento di acqua, ma il coefficiente di estinzione dell'acqua è piccola, richiedendo così strong luce infrarossa (da decine a centinaia di W / mm ²⁾ che è difficile da trasportare via ottica microscopio standard e può comportare problemi di sicurezza per le applicazioni in-vivo. D'altra parte, foto-commutabile ingabbiamento composti hanno un'azione limitata tempo e spesso richiedono la luce UV che è difficile da trasportare a causa della penetrazione tissutale limitata. Inoltre essi soffrono di problemi di diffusione dei composti attivati ​​su fotolisi fuori dell'area illuminata. Infine, gli strumenti optogenetic hanno permesso agli scienziati di indirizzare sottopopolazione cellulare specifico e sotto-scompartimenti e stanno rapidamente emergendo come una delle tecnologie chiave nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, l'inserimento di un segmento di DNA esogeno tramite un vettore virale solleva importanti problemi di sicurezza, soprattutto in vista di adozione su pazienti umani. ^5,6 Per queste ragioni, la ricerca di nuovi materiali e dispositivi in grado di cellula manipolazione ottica è un argomento estremamente caldo.

Recentemente, un romanzo, è stato proposto approccio basato sull'uso di polimeri coniugati fotosensibili, in grado di trasdurre efficientemente uno stimolo ottico in una modulazione di cellula attività elettrica. La stimolazione delle cellule da Polymer fotoeccitazione (CSPP) tecnica sfrutta molte caratteristiche chiave di abilitazione tipico di semiconduttori organici: sono intrinsecamente sensibili alla luce nel campo del ^visibile, 7 sono biocompatibili, morbida e adattabile e la loro flessibilità meccanica permette un'interfaccia intima con tessuti sia in vitro e in vivo ^8-10. Oltre a questo, possono essere facilmente funzionalizzati per meglio adattarsi all'interfaccia con cellule viventi, e per consentire l'eccitazione specifico, sondando e sentendo capacità. ^11,12 Inoltre, essi sostengono elettronica e trasporto ionico, che li rende ideali per la combinazione dell'elettronica annuncio biologia. ^13,14 interessante, possono lavorare in modalità fotovoltaico, evitando la necessità di applicare una polarizzazione esterna fo la stimolazione ottica cella efficiente. ¹⁵

L'affidabilità della tecnica CSPP è già stata dimostrata in diversi sistemi, compresi i neuroni primari, ^{15,16 astrociti,} 17 linee di cellule secondarie ^{18 e} tessuti retinici espiantati. ¹⁶ In questo lavoro, tutti i passi necessari per fabbricare un biopolimero sensibile alla luce interfaccia ¹⁹ per la stimolazione ottica di sistemi in vitro sono descritte in dettaglio. Come caso di studio, una miscela fotovoltaico organico prototipo di regione-regolare poli (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), che funge da donatore di elettroni, e fenil estere-C61-butirrico acido-metile (PCBM), in qualità di accettore di elettroni è impiegato. Poiché il sistema biologico, sono utilizzati embrionali umane di rene (HEK-293) le cellule. Viene fornito un esempio di un protocollo fotostimolazione con la relativa registrazione dell'attività delle cellule tramite misurazioni elettrofisiologiche.

La piattaforma descrittaè tuttavia di validità generale, e può essere facilmente esteso per l'uso di altri polimeri coniugati (regolando correttamente il processo di soluzione preparazione ei parametri di deposizione), diversi tipi di cellule (modificando adeguatamente il protocollo coltura cellulare, placcatura procedura e il tempo richiesto per la semina e la proliferazione delle cellule), e diversi protocolli di stimolazione (lunghezza d'onda della luce, frequenza stimoli e durata, densità fotoeccitazione).

Protocol

1. Preparazione di substrati fotoattivi Preparare una P3HT: soluzione PCBM (1: 1 w / w) in clorobenzene ad una concentrazione di 20 g P3HT / L. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno 4 ore a 60 ° C. Consideriamo un volume di 150 ml di soluzione per ciascun substrato da preparare. Pulire vetrini ITO rivestite (R s = 10 Ω / sq, 18×18 mm 2, spessore 170 micron), con bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore (10 min per …

Representative Results

Le cellule possono essere facilmente coltivate su P3HT: substrati PCBM, a condizione che uno strato di adesione è depositato adatto (come la fibronectina utilizzato nel passaggio 3.2 del protocollo descritto). P3HT: PCBM picchi di assorbimento ottico nella parte verde dello spettro visibile; tuttavia altri polimeri coniugati fotosensibili possono essere selezionati, secondo la gamma d'onda fotostimolazione preferita (figura 2). Biocompatibilità di questi substrati …

Discussion

Passaggi critici del protocollo riportato in vitro per stimolazione ottica di cellule riguardano principalmente la scelta del polimero fotosensibile, i parametri di sterilizzazione termica, l'intensità e la durata di stimoli luminosi. A P3HT: film sottile PCBM stato selezionato qui, dal momento che garantisce una buona stabilità temporale e elettrochimica. Tuttavia, si dovrebbe notare che non tutti i polimeri fotosensibili in grado di offrire prestazioni analogici, ²² più specificamente su ill…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020