Introduction
Hassas bir uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücre aktivitesini işlemek için bir olasılık sinirbilimsel araştırma ve nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların tedavisinde çok önemli bir strateji temsil eder. 1 geleneksel metotlar çevresinde veya temas sağlayacak şekilde yerleştirilmiş elektrotlar kullanılarak hücrelerin elektrik stimülasyonu dayanmaktadır (in vivo beyin dokularında, tek hücre, hücresel şebeke, beyin dilimleri) farklı karmaşıklık olabilir hedeflenen sistem, 2. Geçtiğimiz yüzyılda, yama-kelepçe, metal ve yüzey entegre elektrotların kullanılması fizyolojisi ve tek nöronların ve sinir ağları işleyişi mekanizmalarının patofizyolojisi detaylı bir resmini sağladı. Ancak, elektriksel uyarım önemli sınırlamalar muzdarip. İlki nedeniyle kolayca adapte olamaz elektrotlar ve sabit geometri fiziksel boyutlar, bir genellikle kötü uzamsal çözünürlük ile ilgilidirBiyolojik dokuların gibi karmaşık organize sistemlere. Ayrıca, elektrotlar empedansına ve stimülasyon ve kayıt sistemler arasında çapraz konuşma ile ilgili sorunlar ölçümlerinin son sinyal-gürültü oranını etkileyebilir. 3 Öte yandan, stimülasyon için ışık kullanılması bir çok sınırlamalar üstesinden gelmeye yardımcı olabilir Elektrik yaklaşım. Her şeyden önce, bu mümkün, belirli hücre tipleri ve hatta alt-hücre bölmeleri hedef yapım görülmemiş uzaysal (<1 mikron) ve temporal çözünürlük (<1 msn) sunmaktadır. Bu ilgi doku ile herhangi bir fiziksel temas önler ve kayıttan stimülasyon disentangles beri ek olarak oldukça non-invaziv olduğunu. Ayrıca, ışık yoğunluğu ve dalga boyu, hem tam olarak kontrol edilebilir ve bu şekilde, farklı stimülasyon protokolleri uygulanabilir. 3,4
Bununla birlikte, hayvan hücrelerinin büyük bir çoğunluğu ışığa herhangi bir hassasiyet göstermezler. Optik stimulatio için çeşitli stratejilern, böylece, her iki yakın veya hücre içinde, ışığa duyarlı bir molekül mediatörler istismar veya hücre yakınında harici olarak yerleştirilen fotoaktif cihazı kullanılarak önerilmiştir. Birinci kategori görünür veya kızılötesi (IR) ışık ile uyarılması, hem de photocleavable / photoisomerizable bileşikler ya da ışığa molekül aktüatörler (optogenetics) 'deki genetik ekspresyonu ya da kullanımı gibi endojen mekanizmaları belirtmektedir. Bu ikinci tür inorganik nano / mikro-parçacıklar ya da foto-iletken silikon alt tabakaların kullanılması ile elde edilen dışsal uyan tekniklerini içerir. 5 Bununla birlikte tüm bu sistemler, parlak taraf ve dezavantajları vardır. Özellikle, görünür aralığında hücrelerin endojen emme, zayıf ve güvenilir değildir ve reaktif oksijen türlerinin üretimi eşlik hücre için zararlı olabilir. Genel olarak, İR nedeniyle su emme yerel termal ısıtma indüklemek için kullanılır, ancak suyun yok olma katsayısı dolayısıyla st gerektiren küçük,Standart mikroskop optik aracılığıyla teslim etmek ve in-vivo uygulamalar için güvenlik endişeleri oluşturabilecek zordur (onlarca W / mm 2 yüzlerce) rong kızılötesi ışık. Diğer taraftan, foto-değiştirilebilir kafes bileşikleri süresi sınırlı bir etkiye sahip olduğu ve çoğu zaman, sınırlı doku penetrasyonu sunmak için çok UV ışığı gerektirir. Ayrıca onlar aydınlatılmış alanı dışında photolysis üzerine aktive bileşiklerin difüzyon sorunları muzdarip. Son olarak, optogenetic araçları belirli hücresel subpopülasyonu ve alt bölmeleri hedef bilim adamları izin ve hızla sinirbilimsel araştırma anahtar teknolojilerden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Ancak, viral vektör yoluyla eksojen DNA segmentini ekleyerek özellikle insan hastalarda benimsenmesi açısından önemli güvenlik sorunlarını ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenlerle 5,6, hücre optik manipülasyon yeteneğine sahip yeni malzemeler ve cihazlar üzerinde araştırmalar son derece sıcak bir konudur.
Son yıllarda, yenietkin bir şekilde hücre elektriksel aktivitenin bir modülasyon giren bir optik uyaran transdüse mümkün ışığa duyarlı konjuge polimerlerin kullanımına dayalı bir yaklaşım, ileri sürülmüştür. 7 Onlar, biyouyumlu yumuşak ve uyumlu ve onların mekanik esneklik dokusu ile samimi bir arayüze sağlar; onlar görünür aralığında ışığa özünde duyarlıdır: Polimer Photoexcitation Hücre Stimülasyon (CSPP) tekniği, tipik organik yarı iletkenler birçok anahtar sağlayan özellikleri patlatır in-vitro ve in-vivo olarak her iki 8-10. Bunun dışında, onlar kolayca daha sondalama ve yeteneklerini algılama, belirli uyarma etkinleştirmek için canlı hücreler ile arayüzüne uyum, ve fonksiyonel hale getirilebilir. 11,12 Ayrıca, kombinasyon için idealdir, iyonik ulaşım yanı sıra elektronik destekleyen elektronik reklam biyoloji. İlginçtir 13,14, onlar harici önyargı f uygulamak gerek kalmaz, fotovoltaik modda çalışabilirya da verimli hücre optik uyarım. 15
CSPP tekniğinin güvenilirliği daha önce primer nöron, 15,16 astrositler, 17, ikincil hücre çizgileri 18 ve eksplante retina dokular da dahil olmak üzere, çeşitli sistemlerde ortaya konmuştur. Bu çalışmada 16, gerekli olan bütün aşamalar, ışığa duyarlı bir biyo-polimer imal etmek için in vitro sistemlerin optik uyarılması için bir arayüz 19 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. Olarak hareket eden bir elektron vericisi olarak işlev uygulama durumlarında, bölge normal poli (3-hexylthiophene) içindeki bir prototip organik fotovoltaik harmanı (rr-P3HT), ve fenil-C61-butirik asit-metil ester (PCBM) olarak elektron alıcısı kullanılır. Biyolojik bir sistem olarak, insan embriyonik böbrek (HEK-293) hücreleri kullanılır. Elektrofizyolojik ölçümler yoluyla hücre aktivitesi göreli kayıt ile photostimulation protokolünün bir örneği temin edilmiştir.
Tarif platformuBununla birlikte, genel geçerliliğinin ve kolayca düzgün hücre kültürü protokolü değiştirilmesi istenen işlem ve zamanı kaplama ile, farklı hücre tipleri ((uygun çözelti hazırlama süreci ve çökelme parametrelerini ayarlayarak) diğer birleşik polimerlerin kullanılması uzatılabilir Hücre tohumlama ve çoğalması) ve farklı stimülasyon protokolleri (ışık dalga boyu, uyarı sıklığı ve süresi, photoexcitation yoğunluğu) için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fotoaktif Substratlar hazırlanması 1.
- Bir P3HT hazırlayın: PCBM çözeltisi: benzen (1 ağ / ağ 1) 20 g / L'lik bir konsantrasyonda P3HT. 60 ° C'de en az 4 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile çözelti karıştırın. Her bir taban hazırlanacak çözeltinin 150 ul'lik bir hacim düşünün.
- Temiz İTO kaplı cam slaytlar bir sonikatöre deiyonize su, aseton ve izopropanol ardışık banyolar ile (R, s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, kalınlık 170 um) (her bir aşama için 10 dakika). Bir azot tabancası ile lamelleri kurulayın. 10 dakika boyunca 100 W gücünde bir plazma temizleyici örnekleri koyun.
- Döndürmeli kaplama ile temizlenmiş alt tabakalar üzerinde aktif tabakanın ince bir film oluşturur.
- Bir Elmas ucu olan, İTO kaplı yüzeylerde aynı yanal boyutları bir mikroskop cam slayt, (kalınlık ≈ 1 mm) kesti. Sıcak plakadan PCBM çözeltisi ve bu, ortam sıcaklığına kadar soğuması: P3HT çıkarın.
- Iki st ayarlamaeps spin-lak programı: i) 800 rpm'de 30 sn; ii) 1600 rpm'de 30 saniye. Spin-kaplayıcının aynanın slayt yerleştirin ve bunu düzeltmek için vakum başlar. İTO kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde slayt aseton bir damla ve daha sonra temizlenmiş substrat, koyun. Fazla aseton kurtulmak için spin-lak rotasyon başlatın.
- Yüzeylerde PCBM çözümü ve tekrar spin-kaplayıcı (1.3.2 açıklanan aynı protokolü kullanın) başlatın: P3HT 150 ul koyun.
- Spin-kaplayıcı bittikten sonra, örneği kaldırmak ve dikkatle cam slayt kaplı alt tabakayı çıkarın. Aseton batırılmış bir bez ile temiz oda substrat arkasını temizleyin.
Not: kullanılana kadar fotoaktif alt-tabakalar ile karanlık bir kutu içinde birkaç gün muhafaza edilebilir. Daha uzun süreler için, soy gaz ile bir eldiven kutusu içinde tutmak.
Hücre Kültürü Orta ve Elektrofizyoloji Çözümleri 2. Hazırlık
- Tam büyüme ortamı (CGM) hazırlayınHEK-293 hücreleri: Dulbecco'nun Eagle ortamında ısı ile inaktive edilmiş olup% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş (DMEM) değiştirildi. 4 ° C 'de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile orta sterilize edin.
- 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 Glikoz, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2: ultra-saf su (mM olarak konsantrasyonlar) hücre dışı çözelti hazırlayın. NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. 4 ° C 'de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile çözelti sterilize edin.
- (MM konsantrasyonları) hücre içi ultra saf su ile çözüm hazırlayın: 12 KCI, 125 K-Glukonat, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. ATP-Na 2 ısıya duyarlı olduğunu unutmayın ve en son ekleyin. NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. -20 ° C'de, bir 0.2 mikron filtre sistemi ile bir çözüm, kısım 1 ml'lik tüplerde ml ve mağaza sterilize edin.
3. Kaplama HEK-293 hücreleriAktif Yüzeyler üzerinde
- Bir cam kabın alüminyum ya da kapalı bir Petri kabı kapatıldı ve sterilizasyon için 2 saat boyunca 120 ° C'de bir fırına konulur olarak fotoaktif substrat yerleştirin. Itibaren bu andan itibaren, steril şartlarda tüm işlemleri gerçekleştirmek. Steril bir kaput örnekleri koymak ve onları soğumasını bekleyin.
- Coat bir yapışma tabakası ile fotoaktif yüzey yüzey hidrofobikliğini azaltmak ve hücre yapışmasını teşvik etmek.
- Bir P35 Petri kabındaki aktif yüzeylerde veya 6 çukurlu plaka koyun. Konjuge polimer tabakasının hidrofobisitesi göz önüne alındığında, bir polidimetilsiloksan (PDMS) iyi örnek düzeltmek ve çözümler sınırlandırmak için yapmak.
- Viskoz bir bulamaç elde etmek için, bir cam çubuk ile 1 oranında a 10 PDMS ve katalizör karıştırılır.
- Her bir yarısı karşılamak için yeterli bir miktar dağıtma, 6 oyuklu bir plaka içerisinde bulamaç dökün.
- Oda sıcaklığında PDMS polimerizasyonu için bekleyin.
- Obta için ortada vulkanize PDMS KesilmişPolimer numunenin aynı boyutta bir kare şekli ining.
- En az 30 dakika boyunca% 70 etanol-su karışımı içine daldırma ile PDMS kuyu sterilize edin.
- Iyi PDMS kullanıyorsanız, iyi hücre kültürü sonrası PDMS sökerken tüm katmanın ayrılmasını önlemek için, sivri cımbız ile kuyunun bütün sınır boyunca fotoaktif tabaka çizmeyin.
- Fibronektin çözeltisi (PBS içinde 2 mg / L) ile, her numunenin tüm yüzeyini kaplar. Bir PDMS iyi (: 15x15 mm 2 de net yüzeyini) kullanıldığı takdirde numune başına 500-750 ul arasında bir hacim genellikle yeterlidir. De PDMS olmadan fibronektin çözeltinin yaklaşık 2 mi numuneyi tamamen sokmak için gerekli olan; çözeltisi eklenirken alt-tabaka taşmaması açısından dikkat edin. En az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir cam pipet ile fibronektin çözeltisi çıkarın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkanır.
- Bir P35 Petri kabındaki aktif yüzeylerde veya 6 çukurlu plaka koyun. Konjuge polimer tabakasının hidrofobisitesi göz önüne alındığında, bir polidimetilsiloksan (PDMS) iyi örnek düzeltmek ve çözümler sınırlandırmak için yapmak.
- Pl15.000 hücre / tam büyüme ortamında cm2 yoğunluğunda fibronektin tedavi edilen örnekler üzerinde HEK-293 hücreleri yedi. Bir kullanıldığında iyi PDMS, aksi takdirde 2-3 mi CGM'nin gerekli olan, her bir örnek için CGM'nin 750-1,000 ul bir hacim kullanın. 24-48 st için CO 2 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
4. Optik Uyarım Protokol ve Elektrofizyolojik Ölçümler
- Isıtmaları için 37 ° C'da bir su banyosu içinde, hücre dışı çözelti koyun; , hücre içi bir çözüm çözülme 34 gauge iğne ile 1 ml şırınga koymak ve ATP bozulmasını önlemek için buz ile temas halinde tutun.
- Dikkatle PDMS kaldırarak de eğer mevcut, inkübatör hücre kaplı alt tabaka atın. Bir cam pipet ile büyüme ortamı çıkarın ve ekstrasellüler çözümü ile numuneyi durulayın. Hücre dekolmanı önlemek için yavaş yavaş ilerleyin.
- Hücre dışı solutio ile elektrofizyoloji istasyonunun numune tutucu içine cihazı koymakn ve referans elektrot. Bir çekici ile yama-kelepçe taze cam mikropipetler hazırlayın (ideal direnç aralığında 2-4 M? Içindedir). Hücre içi çözelti ile pipet yarısını doldurun ve mikromanipülatör monte edilir.
- Cihaz üzerinde yama sağlıklı bir hücrenin arayın. Fotoaktif substratın istenmeyen uyarma önlemek için, mikroskop aydınlatıcının önünde uzun dalga boylu geçiş filtresi (örneğin, bir kesik dalga boyu λ = 750 nm görünür emen polimerler için kullanılabilir) yerleştirilmesi, görüntüleme için IR aydınlatma kullanıldığında.
- Seçili hücreyi yama ve mikroskobu (Şekil 1) floresan uyarma yol üzerinden numune ışık sunarak optik uyarılması için istenen protokolü uygulamak. Patch-clamp protokolünün detaylı tarifi burada referans 20 bulunabilir.
- Bir mikrometrik manipülatör ile hücre zarına yakın yama pipet yerleştirin. Yer belirleme sırasında, overpressur geçerlidirsırayla pipet e ucunda kir yapışmasını önlemek için. Pipet hücre üzerinde birkaç mikron olmalıdır.
- Yama kontrol yazılımı üzerinde pipet direnci kontrol ederken hücre zarının doğru pipet düşürücü başlayın. Pipet direnci yaklaşık 1 M? Arttığında pipet ve hücre zarı arasında gigaseal oluşturmak üzere, bir hafif bir emme uygularken, pipet fazla basıncı çıkarın (yani, ölçülen direnç 1 GΩ daha yüksek değerlerde artmalıdır) .
- Mühür istikrara kavuşturmak için potansiyel (HEK293 -40 potansiyeli hücre için mV kullanılabilir) istirahat beklenen hücreye yakın pipet bir negatif potansiyel uygulayın. Nedeniyle yama amplifikatörü ve / veya yama kontrol yazılımı göreli komutlarla pipet kapasitans kapasitif transientler dengeleyin.
- Kısa ve yoğun emme darbe uygulayarak hücre sitoplazması elektrik erişime izin vermek için membran kırınpipet. Hücre membran potansiyeli izlemek için (hücreye enjekte hiçbir geçerli olan, yani I = 0) geçerli kelepçe moduna yama amplifikatör ayarlayın. Hücre potansiyeli kararlı olup olmadığını görmek için birkaç dakika bekleyin.
- Hücreye istenen aydınlatma protokolünü uygulayın ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini kaydedin.
Not: aydınlatma mikroskop mimarisine bağlı olarak alttan veya üstten ya numune teslim edilebilir.- De aktif madde tarafından emilir bir eksitasyon dalga boyu seçin; P3HT için iyi: PCBM harmanı, 450-600 nm aralığında bir dalga boyunda kullanılabilir. Uygun photoexcitation yoğunlukları aralığı 10-100 mW / mm 2 bulunmaktadır.
Not: Sonuç (10-20 msn altında) Işığın Kısa darbeleri hücrenin geçici depolarizasyon, uzun süreli aydınlatma ise ışığı kapatılana kadar sürekli hiperpolarizasyon görülmektedir (milisaniye veya daha uzun bakliyat yüzlerce).
- De aktif madde tarafından emilir bir eksitasyon dalga boyu seçin; P3HT için iyi: PCBM harmanı, 450-600 nm aralığında bir dalga boyunda kullanılabilir. Uygun photoexcitation yoğunlukları aralığı 10-100 mW / mm 2 bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücreler P3HT kolayca kültürlenebilir: PCBM substratları (tarif edilen protokol aşama 3,2 kullanılan fibronektin benzeri) uygun bir tutunma katmanı yatırılır koşuluyla. P3HT: Görünür spektrumun yeşil kısmında PCBM optik soğurma zirveleri; bununla birlikte diğer ışığa duyarlı eşlenik polimerler Tercih edilen photostimulation dalga boyları aralığında (Şekil 2) göre seçilebilir. . PCBM filmi gösterilmiştir: Bu alt-tabakaların Biyouyumluluk, sadece hücre çizgileri nöronlar 15 ve astrositler primer kültürlerinde ayrıca HEK-293 gibi 18,21, fakat 17, bir P3HT üzerinde kültive sağlıklı HEK-293 hücrelerinde tipik mikrografı ile gösterilmiştir Şekil 3'te. fotoaktif substratlar tarafından aracılık edilen hücre optik uyarı ışık uyarısına süresine bağlı olarak, hücre zarı üzerinde farklı etkileri ile sonuçlanabilir. 18 ışık palsının başlangıcından sonra, bir(yaklaşık 3 mV bir yoğunluk ve yaklaşık 1 ms'lik bir süre ile), hızlı başak hücre membranı potansiyeli kayıtlarında (Şekil 4) 'de görülmektedir. Bu sinyal aktif madde şarj üretimi sırasında polimer / elektrolit arayüzünün bir kapasitif şarj kaynaklanmaktadır.
Bu ilk hızlı spike sonra (yaklaşık 1 mV bir yoğunluk ve milisaniye onlarca düzeyinde bir süre ile), geçici bir depolarizasyon hücresi (Şekil 4) 'de görülmektedir. Işık kapatıldığında olarak ışığın kısa darbeler için, tam tersi bir davranış gözlenir. Bu sinyaller, ışık emilmesinin ameliyatı sonrası lokal ısıtma zar kapasitans bir varyasyonuna bağlanmıştır.
Uzun süreli aydınlatma için, ancak, ışık darbeleri sırasında ilk depolarizasyon bir hücre hiperpolarizasyonuna (Şekil 5) dönüşür. Bu durum, sahip olan birtermal kökenli elde ancak bu durumda artan sıcaklık ile indüklenen iyon kanalları iletkenlikler bir değişiklik, zar denge potansiyelinin bir varyasyonuna ilgilidir.
Fotoaktif alt-tabaka Şekil 1. Çizim. Hücresel optik stimülasyon için kullanılan foto aktif arayüzleri İTO kaplı cam alt-tabaka üzerinde biriken organik yarı iletken ince bir filmden yapılmıştır. Bir uygun yapışma tabakasının (örneğin, fibronektin) ile muamele edildikten sonra hücreler cihaz yüzeylerde direkt yetiştirilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. absorbsiyometri alt-tabakanın bir kısmının şeffaflığın korurken farklı konjüge polimerlerin tion spektrumu. Organik yarıiletkenlerin ince filmlerin kullanılması eksitasyon dalga boyu büyük ayarlanabilirliği izin verebilir. Bir örnek olarak, tipik fotovoltaik kullanılan farklı konjuge polimerlerin absorpsiyon spektrumları bildirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil, bir foto-aktif madde üzerinde 3. eden HEK-293 hücreleri, kültürlenmiş. Kuluçkalamadan 24 saat sonra, bir foto-aktif alt-tabakanın yüzeyi üzerinde kültürlenmiş HEK-293 hücrelerinde tipik mikrografı. Ölçek çubuğu, 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
20 msan ışık darbeleri ile, HEK-293 hücreleri Şekil 4. Optik uyarılması. Işık 20 milisaniye darbe ile ortaya çıkarılan bir HEK-293 hücre membran potansiyelinin değişimi. Işık başlamasından sonra bir başlangıç hızlı başak darbesi sırasında hücrenin depolarizasyon tarafından takip edilir. Işık kapalıysa gibi, tam tersi bir davranış gözlenmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
200 msn ışık darbeleri ile, HEK-293 hücreleri Şekil 5 Optik uyarılması. Varyasyon ışık 200 milisaniye darbe ile ortaya çıkarılan bir HEK-293 hücre membran potansiyeli. Kısa illum için gözlenen ilk depolarizasyonasÙ sadece uzun süreli aydınlatma milisaniye birkaç onlarca sonra hücrenin hiperpolarizasyonuna dönüşür geçici bir olgudur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücrelerin optik uyarımı esas olarak ışığa duyarlı polimer seçimi, ısıl sterilizasyon parametreleri, yoğunluğu ve ışık uyaranlara süresini ilgilidir in vitro için rapor edilen protokol kritik adım. Bir P3HT: iyi zamansal ve elektrokimyasal stabiliteyi garanti beri PCBM ince film, burada seçildi. Ancak, bir bütün ışığa duyarlı polimerler aydınlatma üzerine daha spesifik, 22 analog performansları sunabilir dikkat etmelidir. Buna ek olarak, bu durumda parametre polimerin optoelektronik özellikleri oldukça büyük bir bozulmaya neden olmayan ısı sterilizasyon seçilir; haber oluşmaması durumunda ise sterilizasyon yöntemi veya termal tedavi parametreleri değiştirilir, yani polimer özellikleri üzerinde olası etkileri dikkatle değerlendirilmelidir. Bu, bilinen, örneğin, UV maruziyeti nedeniyle hızla konjugasyon kaybı, geri dönüşü olmayan polimer ağartma ve bozulmaya neden olmaktadır. Ayrıca, farklı tavlamasıcaklıklar ve süreleri elektrik yükü taşıma özelliklerine olumsuz etkileri ile, polimer yüzeyinin farklı morfolojik düzenine yol açabilir. Photoexcitation protokolünün parametreleri dikkatle da değerlendirilmelidir: 100 mW / cm 2, ve / veya uzun süreli uyaranlara üzerinde uyarma yoğunlukları, kolayca polimer bozulması ve photostimulation protokolünün yetmezliğine yol açabilir. PCBM yüzeyi: protokolünde Diğer önemli adım bağlı P3HT yüksek hidrofobisite derecesi, bir protein yapışma tabakasının kullanımı oluşturmaktadır. Hiç bir yapışma tabakası biyo-polimer arayüzü, hücre tohumlama ve çoğalması gerçekleştirilmesinde kullanılması halinde ciddi şekilde tehlikeye olabilir.
Yukarıda belirtilen kritik adımlar ve kısıtlamaları içinde, ancak, bildirilen protokol delikanlı belirli deneysel ihtiyaçlarına ve hedeflerine göre modifiye edilebilir. Diğer stabil, ışığa duyarlı polimerler çeşitli com, 7 bulunabilirmercial tedarikçileri veya doğru yeni bileşikler sentezleyerek. Bu, kırmızı ve NIR aralığında mavi uzanan farklı dalga boylarında uyarım kullanımına izin verir. Ayrıca, polimer birikim tekniği spin kaplama kullanımıyla sınırlı değildir. Gerçekten de, iyi bir homojenlik ve uygun bir film kalınlığına sağlanması için diğer yöntemler, örneğin, mürekkep püskürtmeli baskı, sprey kaplama veya hücre büyüme ortamı ile ve sterilize etme yöntemi uzun süreli temas etkilerini bıçaklama olarak düşünülebilir, her yeni materyal için değerlendirilmelidir dikkate alınır. Protein yapışma tabakalarının kullanımı burada rapor edildiği gibi, polimer yüzeylerinin, fibronektinin özel kullanım en iyi hücre kültürlerinin elde etmek için gerekli olsa da, zorunlu değildir. Farklı yapışma proteini tabakalar da büyümesini hücre hattı ile uygun olarak, kullanılabilir; 21, örneğin nöronal hücreler genellikle, bir poli-L-lisin tabaka üzerinde kültürlenmiştir. Son olarak, aydınlatma protokolleri değiştirdi ve sp adapte edilebilirecific ihtiyaçları, dalga boyu, nokta boyutu, güç uyarma yoğunluğu, zaman uyaran süresi ve sıklığı, ışık insidans yönü bakımından (substrat veya elektrolit banyosu). Yukarıda kısaca belirtildiği gibi, ancak, protokol parametrelerinin tanımı dikkate duruma göre çok değişebilir polimer optik soğurma aralığı ve olası bozulma efektleri almalıdır.
Bazı ışığa duyarlı polimerlerin sınırlı zamansal ve elektrokimyasal kararlılığı aslında tekniğin başlıca kısıtlamaları temsil eder. Buna ek olarak, bir daha arıtılmadan ticari polimerlerin kullanımı, farklı saflık derecesi, malzemenin farklı partiler arasında yer sonuçların sınırlı tekrarlanabilirlik bazı durumlarda neden olabilir.
Biz de CSPP protokollerde fototransdüksiyon etkisi üssünde kesin mekanizmalar daha da izah ve karakterize edilmesi gereken dikkat edin. Termal, elektrik ve kimyasal phmuhtemelen farklı biyolojik modeller içindeki farklı uzantılara de dahil enomena bulunmaktadır. Tam bir anlayış tamamen teknik yararlanmaya anahtar olacaktır. In vivo uygulamaları durumunda, özellikle de pek kontrol edilebildiğinden dolayı, özellikle de ısı ile aracılı fenomenlerin meydana gelmesi, tekniğin bir sınırlama olarak gözden geçirilmesi ve yerel aşırı ısınma etkilere neden olabilir. Isı iletken yolların düzgün mühendisliği ile hücre dışı bir ortamda ısı dağılımı kontrol etmeye yönelik cihazın bir özel uygulama, tekniğin bütün kullanılması için, yakın gelecekte gerekli ortaya çıkarabilir.
Literatürde, hücreleri ve dokularının sıcaklığı aracılı uyarılması için optik darbeler farklı veri teknikleri, in-vitro ve in-vivo olarak her iki bulunabilir. Bu çalışmalarda, su ile IR lazer ışınları emilimi genellikle iletim mekanizması olarak kullanılır. 23-25 Kızılötesi ile ilgili olarakSinir Uyarım, CSPP mekanizması, özellikle in vitro deneyler için, farklı avantajları vardır. Bu stimülasyon, standart bir floresan mikroskop uyarım yolu ile temin edilebilir, böylece CSPP, görünür aralığında ve orta şiddette ışığa dayanır. Tam tersine, su emme, hazırlama yakınında micromanipulated optik fiberlerin gibi dış kaynaklardan ile örnek teslim edilmesi gerekir (çoğunlukla yaklaşık 1.45 um ve 1.93 um) IR, dalga boylarını gerektiren standart bir optik tren yana Mikroskop bu dalga boyunda kullanılamaz. CSPP durumunda, lazer tarama sistemleri gibi uzaysal ışık modülatörlerinin elde edilen ışık desenleri, doğrudan çok Mikroskop optik tren akuple edilebilir. Bu şekilde, yarı iletken bir organik göre substratların photostimulation mümkün hem de yüksek zamansal a olarak, birbirinden bağımsız görüş alanında birçok hücrelerinin uyarılmasını elde etmek için yapabilir nd uzamsal çözünürlük.
Optik uyarılması için bir başka çok değerli bir alternatif hücrelerinde genetik fotoaktıfleştırılebılır sondaların hedeflenebilir ifadesine dayalı, genetik yöntemler tarafından sunulur. Optogenetics hem heyecanlandıracak ve elektriksel aktivitesini inhibe ve genetik ilgi belirli beyin bölgelerinin belirli alt-popülasyonları hedeflenebilir olabilir mW / mm 2 birkaç onlarca aralığında tipik aydınlatma şiddetleri ile günümüzde görülmemiş zamansal ve mekânsal çözünürlük sunuyor. Ancak yine de çözülmesi gereken bazı sorunlar sunuyor. Özellikle, güvenlik gen ekspresyonu için virüslerin kullanımı ile ilgili endişeler, özellikle insanlarda ve sabit ve kontrollü uzun süreli heterolog protein ekspresyonu kazanılan hala önemli zorlukları temsil eder. CSPP tekniği gen transferi ihtiyacını ve in vivo uygulamalar için ilgili tüm ilgili güvenlik kaygıları, aşmak için izin verir.
jove_content "> Sonuçta, CSPP yöntemi, invazif olmayan olduğu iken, kolayca mevcut herhangi bir elektrofizyolojik iş istasyonuna bağlanabilir ve karmaşık lazer kaynakları veya genetik transfeksiyon gerektirmez. endojen photostimulation tekniklere göre çeşitli avantajlar sağlar yüksek uzaysal ve zamansal seçicilik sürdürmek. Bu nedenlerden dolayı, CSPP umut vaat in vitro araştırmalarda nörobilim tamamlayıcı bir araç haline, ve in vivo uygulamalarda yeni perspektifler açmak için kullanılır. Ancak, malzeme bilimi, fizik ve mühendislik büyük bir çaba topluluklar, rafine optimize etmek ve tamamen teknik yararlanmak için gerekli olan önümüzdeki yıllarda, içinde bekleniyor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
