Abstract
Infecção da malária começa quando a fase de esporozoíto do Plasmodium é inoculada na pele de um mamífero hospedeiro através de uma picada de mosquito. O parasita altamente móveis não só atinge o fígado para invadir hepatócitos e se transformar em forma de eritrócitos-infeccioso. É também migra para a pele e para o nó de linfa de drenagem proximal do local de injecção, onde pode ser reconhecido e degradado por residente e / ou células mielóides recrutados. Imagens intravital informou o recrutamento precoce de leucócitos positivos brilhantemente fluorescente Lys-GFP na pele e as interações entre os esporozoítos e CD11c + células do linfonodo de drenagem. Nós apresentamos aqui um procedimento eficiente para recuperar, identificar e enumerar as subpopulações de células mielóides que são recrutados para a pele do rato e drenagem dos linfonodos após a injecção intradérmica de doses imunizantes de esporozoítos num modelo murino. Caracterização fenotípica utilizando fluxo multi-paramétrico fornece citometriaum ensaio fiável para avaliar alterações precoces celulares dinâmicas durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium.
Introduction
A malária é uma das mais mortais doenças infecciosas no mundo, matando mais de meio milhão de pessoas por ano. A infecção pelo Plasmodium, o agente causador da doença, começa por uma fase de pré-eritrocítico (PE). Durante esta fase, os esporozoitos injectados na pele hospedeiro por um mosquito fêmea Anofelíneos atingir o fígado através da corrente sanguínea e diferenciam hepatócitos no interior para as formas de parasitas que infectam as células vermelhas do sangue e causam os sintomas da doença.
Os estágios PE de Plasmodium representar um alvo privilegiado para a vacinação anti-malária. Na verdade, vacinas vivas atenuadas contra essas etapas, tais como radiação atenuada esporozoítos (RAS), parasitas geneticamente presos (GAP) ou quimioprofilaxia e esporozoítos (CPS) demonstraram a sua capacidade para proteger tanto de roedores e hospedeiros humanos 1-9. No modelo de roedores, a maioria dos estudos de vacinação são conduzidas utilizando imunização intravenosa, Que é o padrão ouro em termos de eficácia protetora. No entanto, a descrição de uma etapa da pele e a importância do linfonodo de drenagem associada à pele (DLN) na indução de protecção mudou nossa percepção da fase de PE e enfatizou a importância da via intradérmica da injeção. Imagiologia intravital de P. esporozoítos berghei injectados na pele de roedores tem mostrado que apenas ~ 25% do inoculo atinge o fígado através da corrente sanguínea. Os restantes 75% ~ distribui entre o DLN proximal (~ 15%) e a pele (~ 50%) 10,11, onde uma pequena parte pode transformar e permanecer vivo por semana no interior das células da pele 12,13. Além disso, estudos subsequentes descrito que o estabelecimento de imunidade protetora eficaz após a imunização intradérmica ocorre principalmente na pele ed-Din, onde as células T CD8 + específicas do parasita são ativadas, e apenas marginalmente no baço ou fígado-dLNs 14,15.
Enquantoa maioria dos estudos têm-se concentrado sobre a caracterização das células efectoras implicadas no estabelecimento da resposta imunitária protectora, muito menos se conhece sobre o destino de parasitas vivos atenuados injectados para dentro da pele, em especial as suas interacções com o sistema imune inato. Em particular, a caracterização das células apresentadoras de antigénios envolvidos na captação de antigénio parasita, processamento e apresentação a células T CD8 + é de importância crítica, sabendo que a aquisição antigénio PE pode ocorrer tanto na pele e compartimentos DLN. Estudos prévios de imagens intravital descrito um influxo precoce de células positivas brilhantemente fluorescentes Lys-GFP na pele após uma picada de mosquito infecciosa 16 enquanto primeiros interacções entre os esporozóitos e células dendríticas foram observados no DLN 10,17. Mais recentemente, foi relatado que os esporozoitos inoculados na pele por mosquitos aumenta a motilidade de ambas as células T reguladoras dendríticas e na pele deratinhos, enquanto que um número de diminuição de células apresentadoras de antigénio foi observada no DLN 18.
Nós teve como objetivo identificar e quantificar mais precisamente os subconjuntos de leucócitos recrutados na pele e DLN correspondentes, bem como aqueles interagindo com o parasita após a injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS 19. Neste contexto, foram isoladas células mielóides (CD45 + CD11b +) de ambos os tecidos e caracterizada subpopulações de interesse pelo multi = fluxo paramétrico citometria. Consistente com a resposta imune descrito no estádio precoce de parasita Leishmania major infecção da pele 20, a resposta do hospedeiro primário de esporozoíto de injecção consiste de um recrutamento sucessiva de neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguido por monócitos inflamatórios (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +), que são identificadas com base na diferenciaramexpressão al dos marcadores de superfície Ly6G e Ly6C.
Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mielóides a partir da pele do rato e DLN após injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS extraídos de glândulas salivares do mosquito infectados. injecções intradérmicas reprodutíveis e processamento de tecidos são passos fundamentais para quantificar alterações fenotípicas de infiltração população de células nos tecidos infectados. A abordagem detalhado abaixo proporciona um ensaio fiável para avaliar a resposta inflamatória da pele e para DLN parasita Plasmodium e pode ser alargado a vários sistemas experimentais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê do Instituto Pasteur e pelo Comitê local de Ética em Experimentação Animal (Comitê de Ética IDF-Paris 1, Paris, França; número do contrato: 2012-0015) e realizado de acordo com as diretrizes e regulamentos aplicáveis.
1. Materiais e Reagentes
- Use feminino mosquitos Anopheles stephensi (estirpe Sda500) que se alimentam de ratos infectados 3-5 dias após a emergência e traseira, como descrito anteriormente 21.
- Utilização parasitas Plasmodium berghei ANKA clone expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP) sob o controlo constitutivo do proteína de choque térmico 70 (HSP70) promotor. Isso produz fluorescência brilhante durante todo o ciclo de vida do parasita 22.
- Use feminino camundongos C57BL / 6JRj (7 semanas de idade).
Nota: Todos os reagentes usados no protocolo descrito estão listados na T capazes de materiais / equipamentos.
- Entre 18-25 dias após a refeição de sangue infecciosa, recolher e frio anestesiar mosquitos em um tubo de 15 ml em gelo, como descrito anteriormente 21. transferi-las cuidadosamente sobre uma placa de Petri por inversão do tubo. Manter os insetos no gelo e expor os mosquitos a uma dose de 12 krad de irradiação x γ- ou.
- Isolar atenuadas esporozoítos das glândulas salivares de mosquitos irradiados como previamente descrito 21. Recolhe glândulas salivares infectadas em um pequeno volume (cerca de 15 uL) de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) em gelo e suavemente esmagar-los a libertar os esporozoítos.
NOTA: A injecção de uma suspensão de parasita altamente concentrada num pequeno volume de ser crítica, é, portanto, essencial para colher um número suficiente de glândulas salivares de um elevado número de mosquitos bem infectadas pré-seleccionados, como evidenciado pela sua expressão robusta deverde-fluorescência. - Filtra-se a suspensão dos esporozóitos através de um tampão filtro de células 35 um adaptado para uma adesão de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo de baixo, a fim de eliminar os aglomerados e os restos do mosquito.
- Contar o número total de esporozóitos isolados como previamente descrito 21 e ajustar a concentração da suspensão de parasita com DPBS frio 1x obter esporozóitos 83.000 / uL. Armazenar os parasitas no gelo, continuando os próximos passos.
- Recolhe-se o número equivalente de glândulas salivares de mosquitos infectados que serão utilizadas como controlo negativo e processam a amostra, tal como descrito nas etapas 2.2 e 2.3. Dilui-se a amostra, tal como indicado acima, para obter a concentração semelhante de extractos de glândula salivar na suspensão.
NOTA: Os esporozoítos pode ser armazenado em gelo durante um máximo de 2 horas. No entanto, de preferência eles são injectados dentro de uma hora após o esmagamento, as glândulas salivares.
3. Injecção de esporozóitos no Dérmico Layer da Orelha
- Anestesiar os animais por injecção intraperitoneal de cetamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) mistura. Espere 5-8 min para o mouse para estar em um estado de inconsciência e aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secagem da córnea. Avaliar a profundidade da anestesia através da realização de um aperto do dedo do pé suave em ambos os pés traseiros.
NOTA: A dose de anestesia dura menos de 20 minutos, de modo que os próximos passos deve ser feito rapidamente. - Estabilizar o pavilhão auricular do mouse fixando o lado ventral com fita adesiva transparente previamente colocado sob um microscópio estereoscópico (Figura 1A). Pressione suavemente o ouvido para evitar danos da vasculatura.
- Coloque uma agulha chanfrada 10 ul seringa / 35 indicador com 0,6 l de parasitas novamente suspensas 10.
- Entregar a suspensão dos esporozóitos em 4 locais de injecção (0,15 mL por local) através da inserção cuidadosamente a agulha no lado dorsal da orelha (Figura 1A), por baixo da epiderme, com ao bisel para cima, tendo o cuidado de evitar quaisquer vasos sanguíneos. Permitir que a agulha permanece na derme para poucos segundos para evitar o refluxo do injectant antes de o remover. Observar uma pápula característico em cada local de injecção no final do procedimento (Figura 1B e 1C).
- Após a injecção, remover cuidadosamente o ouvido a partir da fita.
- Injectar a orelha contralateral com a mesma dose de parasitas, seguindo a 3,2-3,4 passos.
- Injectar duas ratinhos adicional, quer com 0,6 ul de 1x DPBS ou 0,6 ul de 1x DPBS + extracto de glândulas salivares de mosquitos infectados, a fim de avaliar a resposta inflamatória mediada pela injecção sozinho e a deposição de material de mosquito na derme.
- Monitorar a recuperação do rato da anestesia antes de colocá-lo de volta na gaiola.
NOTA: A deposição esporozoíto adequada na pele pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência (Figura 2A e 2B), Sendo o rato preparado como descrito previsously 23.
4. Pele e Dissection Drenagem Linfonodo
- Prepare meio padrão (SM) como se segue: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 25 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) suplementado com 400 U / ml de colagenase e 50 ug / ml de desoxiribonuclease (DNase) .
- Prepare duas 6 placas de cultura de tecidos bem fundo plano no gelo com 4,5 ml SM + 70 coador mm de células por poço para amostras DLN (Placa A) e 4,5 ml SM per bem para amostras de pele (Placa B).
- No ponto de tempo desejado após a inoculação do esporozoíto, anestesiar profundamente o rato através de injecção intraperitoneal de cetamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) mistura prévia deslocamento cervical. Verifique se o mouse demonstra sinais de morte clínica e começar a dissecção imediatamente.
NOTA: A cinética do recrutamento de células mielóides podem ser examinados em diferentes momentos após injexão (isto é, 2 horas, 4 horas e 24 horas como anteriormente descrito 14). - Desinfectar a orelha inoculado e a região pescoço correspondente com etanol a 70% para reduzir a possibilidade de contaminação.
- Com uma tesoura e uma pinça estéril, assepticamente dissecar o proximal DLN auricular sem recolher a gordura ao redor. Realizar uma primeira incisão no sulco jugulo-carotidian e remover os pêlos do campo operacional. Esticar a incisão com uma pinça 2 para expor o DLN que aparece acinzentada em comparação com o tecido circundante.
- Comprima os tecidos conjuntivos cuidadosamente na parte superior do DLN com uma pinça para facilitar a sua remoção. Extrai-se a DLN colocando uma pinça debaixo do tecido linfóide (Figura 3A e 3B). Coloque o DLN em um poço contendo filtro de células 4,5 ml SM + 70 mm (Placa A).
- Efectuar a totalidade da orelha inoculadas utilizando uma tesoura afiada e fórceps estéreis (Figura 4A). Separcomeu os aspectos dorsal e ventral da orelha por beliscar e espaçamento para além do corte termina com duas pinças (Figura 4B - 4E). Coloque-os em um poço contendo 4,5 ml SM (Placa B) certificando-se de ambos os tecidos são completamente imerso no meio.
NOTA: De modo a melhorar a fiabilidade do experimento e aumentar o número de células de interesse, piscina 2 injectado orelhas ou 2 dLNs a partir do mesmo ratinho por amostra. - Colheita e processo em paralelo as orelhas e dLNs de camundongos inoculados com qualquer 1x DPBS ou extratos de glândulas salivares. Incluem 2 amostras adicionais de ouvido e nódulos linfáticos colhidos de um rato ingênuo para controles de compensação coloração negativa e individuais.
5. cela de isolamento a partir de gânglios linfáticos
- Incubar os gânglios linfáticos (placa A) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 15 minutos, sob agitação suave. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético 10 mM final (EDTA) por poço para neutralizar colagenase e DNase actividades. Execute os próximos passos no gelo.
- Dissociar nódulos linfáticos usando a extremidade de topo de um êmbolo de seringa de 5 ml. Imprensa em movimentos circulares contra a peneira até que tudo o que resta é tecidos conjuntivos brancos.
- Lavar o filtro de células duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de soro fetal de bovino (FBS) + EDTA a 2 mM. Transferir todo o volume do poço em um tubo de 15 ml.
- Enxaguar o poço duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA e transferir o volume dentro do tubo de 15 ml. Mantenha os tubos em gelo.
6. cela de isolamento da pele da orelha
- Incubar os folhetos da orelha (Placa B) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 h sob agitação suave.
NOTA: Após 20 min de incubação, cortar os folhetos de ouvido com uma tesoura em pedaços pequenos para facilitar a digestão do tecido e colocar a amostra de volta na incubadora para os restantes 40 min. As células individuais podem ser observadas no meio no final do tempo de incubação. - Adicionar final 10 mM EDTA por cavidade para neutralizar as actividades de colagenase e DNAse. Execute os próximos passos no gelo.
- Transferir os fragmentos de tecido da orelha e todo o volume do meio em um novo poço contendo um filtro celular de 70 um utilizando uma pipeta de 1 ml. Corte de 2 a 3 mm da extremidade da ponta para recolher os fragmentos de tecido da orelha mais facilmente.
- Dissociar fragmentos de tecido do ouvido usando a extremidade de topo de um êmbolo de seringa de 5 ml. Imprensa em movimentos circulares contra a peneira até que tudo o que resta é tecidos conjuntivos brancos.
- Lavar os filtros de células duas vezes com 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA.
- Transferir todo o volume do poço para um tubo de 50 ml, através de um filtro celular de 70 uM.
- Enxaguar o poço com 500 ul de 1x SBF DPBS + 2% + EDTA a 2 mM e transferir o volume dentro do tubo de 50 ml. Mantenha o tubo em gelo.
NOTA: As diferentes etapas para isolar células totais a partir da pele e tecidos DLN estão resumidos na Figura 5.
- Centrifugar a pele e amostras DLN durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Suavemente ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA.
- Recolhe um pequeno volume de cada amostra para contar o número total de células isoladas a partir da pele e DLN utilizando um hemocitómetro. Adicionar 0,04% de azul de tripano para determinar a viabilidade celular.
8. Bloqueio de Non antígeno-específica Binding
- Adicionam-se 10 ug / ml de anticorpo não marcado de CD16 / CD32-Fc bloco. Incubar 20 min a 4 ° C (pode ir mais longe).
- Adicionar 2 ml de 1x SBF frio DPBS + 2% + EDTA a 2 mM. Centrifugar a amostra durante 5 minutos a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Suavemente ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA e manter as amostras em gelo.
9. manchar a pele e células Linfonodo Mielóides
- Incubar ski anteriormente bloqueadan e células com o Live / Dead rastreador (ou seja, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole ou DAPI), anticorpos específicos anti-CD45 e anti-CD11b DLN isolado.
NOTAS: A fim de enriquecer as subpopulações de células mielóides de interesse, especialmente os mais raros, CD45 + células e linfócitos podem ser, respectivamente, purificada a partir da pele ou empobrecido do DLN por esférulas magnéticas separação de células facilitador. Uma vez que a maior parte das células isoladas a partir da DLN são CD45 +, o uso de anti-CD45 não é obrigatória. Outros marcadores podem ser incluídos para identificar subpopulações de células mielóides de interesse pela estratégia positiva ou negativa-gating. Neste protocolo, as células mielóides recrutados na DLN foram enriquecidos pela exclusão de células CD8a + (o compartimento de células T inteira pode ser alvo de usar anti-CD3 anticorpo específico). - Incubar 30 min a 4 ° C no escuro. Adicionar 500 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA, centrifugar a amostra de 5 min a 450 xg, a 4 ° C e desprezar o Supernatant. Repita o passo de lavagem duas vezes.
- Ressuspender as amostras com 300 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA. Transferir todo o volume num tubo de FACS através de um filtro celular de 35 uM. Lavar o filtro com 100 ul de 1x DPBS + 2% de FBS + 2 mM de EDTA.
- Execute as células coradas em um citômetro de fluxo. Portão vivem células individuais (DAPI -, FSC-W) para excluir as células mortas e dobletes. Plot CD45 + CD11b + eventos para a pele (Figura 6A) e CD8a (CD45 +) - CD11b + eventos para o DLN (Figura 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recentemente, demonstramos que a injeção de agulha de seringa de imunizantes doses de P. berghei esporozoítos na pele do rato induz uma contratação sucessiva de neutrófilos seguidos pelos monócitos inflamatórias na pele e DLN 19. A Secção protocolo descrito acima detalha o procedimento utilizado para isolar com sucesso células mielóides ao vivo de ambos os tecidos após injecções múltiplas de grande número de esporozoítos na derme da orelha (Figuras 1 e 2). Dentro das primeiras 24 h, a DLN (Figura 3) e o local de injecção da pele (Figura 4) foram isolados e processados tal como resumido na Figura 5 para analisar o infiltrado celular por fluxo multi-paramétrico citometria. No geral, esta técnica nos permitiu isolar uma média 10 4 CD45 + CD11b + e + de células individuais ao vivo 2.10 4 CD11bpara a pele e DLN respectivamente. A viabilidade aceitável de células individuais não detritos variou de 40-70% para a pele e 70-90% para o DLN. Como mostrado na Figura 6, a frequência de células mielóides na pele (CD45 + CD11b +) e o DLN (CD8a - CD11b +) aumenta fortemente a seguir à injecção intradérmica de RAS em comparação com ratinhos não infectados.
Figura 1: I ntradermal A injeção de Esporozoítos no ouvido de Mouse. (A) Imagem que mostra a injeção intradérmica de esporozoítos no pavilhão auricular de um rato anestesiado. O lado ventral da orelha é estabilizado com fita adesiva transparente previamente colocado sob um microscópio de dissecação. A agulha é inserida cuidadosamente no lado dorsal da orelha, abaixo da epiderme, com o bisel para cima. (B - C) Fotográfica mostrando o lado dorsal do pavilhão auricular antes (B) e depois (injecção C) intradérmica de 0,1-0,2 uL de suspensão de parasita. A pápula característica (seta preta) é observável no local da injecção, no final da operação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 2: Geração de esporozóitos Depositado na derme da orelha de rato (A) A microscopia de fluorescência mostrando RAS migrar a partir do local de injecção (indicado pelas linhas tracejadas) na pele do ratinho 15 min pós-injecção (barra de escala = 60 um; 10X ampliação). O caminho de esporozoítos é representado pela projecção de intensidade máxima do sinal fluorescente. Verde e vermelho de fluorescência rerespectivamente mostram posição parasita na pele no início e no fim de 10 segundos de aquisição. (B) Maior ampliação da RAS (verde) injetado na pele (Barra de escala = 20 mm; 25X). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Drenagem Linfonodo Processing (A) de imagem que mostra a dissecção da proximal DLN auricular após a injecção intradérmica de azul de Evans para fins de demonstração.. Depois de deslocamento cervical do rato, o pescoço é desinfetada com álcool 70%. Uma primeira incisão é feita na área da jugular-carótida com uma tesoura afiada e a pele é removido do campo operatório. A incisão é esticada com pinças 2 para expor o DLN que aparece grAyish em comparação com o tecido circundante. Os tecidos conjuntivos são então cuidadosamente comprimido com uma pinça sobre a parte superior da DLN e progressivamente separada dela. Finalmente, o DLN é extraído por colocação de uma pinça debaixo do tecido linfóide. (B) imagem que mostra o DLN extraído em uma gota de PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Processamento de pele de orelha de imagens que mostram os passos sucessivos para processar a orelha inoculado. (A) após a luxação cervical do rato, o ouvido é desinfetada com álcool 70% e removidos usando uma tesoura afiada estéreis e fórceps. (B - D) O dorsal e ventral aspectos da orelha são levemente separados por beliscar e sandando para além do corte termina com duas pinças. (E) de imagem que mostra os aspectos dorsal e ventral da orelha tratamento enzimático antes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:.. Protocol Resumo Representação esquemática dos passos principais para isolar células totais da pele e tecidos DLN Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: População de células mielóides isolados da pele da orelha ea proximal DLN FACS parcelas representativas que mostram a.gating estratégia para analisar o compartimento mielóide na pele (A) e o DLN (B). CD45 + CD11b + e CD8a - células CD11b + foram fechado no total de eventos singlet ao vivo para a pele e DLN respectivamente. Para cada condição, 5 x 10 5 eventos totais foram adquiridas (2 orelhas e 2 DLN agrupados por amostra). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na perspectiva de vacinação em larga escala de seres humanos usando uma vacina de esporozoíto da malária conjunto, um dos principais desafios para superar é desenvolver vias e métodos de administração parasita optimizadas para assegurar uma imunização bem sucedida e protecção 24,25. Nos seres humanos, a avaliação da eficácia protectora mediada por parasitas vivos atenuados (LAP) foi realizada seguindo natural mosquito morde 2, bem como intradérmica, subcutânea e 25,26 IV imunizações 27. Como relatado em roedores e primatas 28 25 não-humanos, a administração IV de LAP induz respostas imunes de protecção mais fortes em comparação com as vias acima mencionadas. No entanto, as vias não-IV de administração utilizando agulha e seringa continua a ser mais adequado para a vacinação em massa humana e esforços estão sendo feitos para optimizar a sua eficácia protectora.
Estudos recentes realizados em ratos demonstraramd, especialmente no caso da via ID, que a deposição de um pequeno volume de suspensão dos esporozóitos (gama de 1 ul) em vários locais de injecção (4 pontos) aumentou significativamente a infectividade do parasita em relação a uma única inoculação de parasitas diluído em maiores volumes (50 ul) 24. Em nosso sistema experimental (C57BL / 6 mouse - P. berghei), a protecção completa foi alcançada após múltiplas injeções na derme da orelha de suspensão altamente concentrada de parasitas (50.000 RAS em 0,6 l, 4 locais de injecção) 19. Neste contexto, foi estabelecido o protocolo descrito acima para analisar mais precisamente a resposta imune do hospedeiro local para doses imunizantes de RAS que permitiu-nos identificar 2 principais subpopulações de células mielóides recrutados na pele e DLN em resposta ao parasita 19.
fluxo multi-paramétrico permite citometria de identificação precisa e quantificação de alterações das células imunitárias no contexto da resposta do hospedeiroa infecção 19,20. O isolamento de um grande número de células viáveis é, portanto, essencial para realizar a análise fenotípica reprodutível. Para este fim, a concentração de enzima e a duração da digestão do tecido deve ser optimizado. Com efeito, a baixa concentração de enzimas ou tempo de incubação insuficiente pode conduzir à digestão incompleta com baixo rendimento de células, enquanto a digestão do tecido prolongada pode resultar na diminuição da viabilidade celular e da alteração da superfície da célula expressão do antigénio 29. No entanto, os protocolos bem estabelecidos que utilizam o tratamento de colagenase têm sido mostrados para ter um impacto insignificante na detecção de moléculas de superfície relevante frequentemente utilizados para análises fenotípicas 30.
Entre os vários parâmetros que podem optimizar a qualidade de isolamento de células, a separação da dorsal e ventral secções da pele da orelha é essencial, uma vez que permite a colagenase / ADNase para aceder a derme. Além disso, a picagem da pele para pequenopeças aumenta a área de superfície acessível às enzimas, permitindo, por conseguinte, uma menor duração de digestão. Finalmente, o uso de dissociação mecânica ajuda a aumentar o rendimento no número de células, tanto para a pele e DLN. No entanto, a dissociação em excesso pode causar estresse adicional que poderia impactar negativamente a viabilidade celular.
Nós favorecida aquisição de células vivas desde que a fixação leva a coloração subóptima, complicando distinção de eventos positivos de interesse raras (dados não mostrados). Além disso, a discriminação de células mortas foi mais problemática. Nos casos em que é necessária a fixação de células, gostaríamos de sugerir o uso de manchas VIVO / MORTO solucionáveis mortos celulares.
Usando o protocolo definido, nós células mielóides isolados com sucesso que se infiltram na pele e DLN em resposta à injecção de parasita (Figura 6A e B). Nós normalmente obter níveis mais altos de células individuais viáveis do DLN (70-90%) em comparação com opele (40-70%). Esta diferença pode ser explicada pelo tempo de incubação mais longo necessário para a digestão enzimática eficiente em conjunto com passos adicionais de dissociação mecânica para isolar células da pele (a separação de camadas da pele, trituração e de maceração mais forte).
Finalmente, um parâmetro importante a ter em conta quando se analisa a resposta do hospedeiro à ID injeção de esporozoítos é o nível de inflamação induzida por ambos inserção da agulha e mosquito salivar deposição de extrato de glândula na pele 19,20. Assim, sugerimos a injectar ratinhos adicional quer com PBS 1x sozinho ou extractos da glândula salivar do mesmo número de mosquitos não infectadas para avaliar a resposta imunitária especificamente induzida pelo parasita. Ao todo, aconselhamos a dissecar mosquitos infectados com alta carga parasitária nas glândulas salivares e filtrar a suspensão parasita para limitar a quantidade de material de mosquito que pode ser depositada na pele.
Euresumo n, o isolamento de células mielóides da pele e DLN através do protocolo descrito proporciona um ensaio fiável para avaliar as alterações celulares dinâmicos durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium e pode ser alargado a outros agentes patogénicos transmissíveis para a pele do hospedeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge para a leitura crítica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge ajuda para tirar fotos e Pauline Formaglio para o ensino em imagem in vivo da motilidade esporozoítos na pele do rato. Nós também gostaríamos de agradecer Marek Szatanik e do Centro de Produção e Infecção do Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para a criação do mosquito. Este estudo foi apoiado pelo Fundo AXA Pesquisa e fundos do Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa de Doenças Infecciosas Emergentes" (conceder nenhuma. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
