Abstract
변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.
Introduction
말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화.
변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 - 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 한 것을 도시하고있다. ~ 나머지 75 %는 작은 비율이 피부 세포 (12, 13)의 내부 주 동안 살아 변환하고 남아있을 수 근위 DLN (~ 15 %)과 피부 (~ 50 %) 10, 11, 사이에 분배한다. 또한, 후속 연구는 피내 접종 후 효과적인 보호 면역의 설립은 주로 기생충 특정 CD8 + T 세포가 활성화되어 피부 DLN에서 발생, 만 소폭 비장이나 간 dLNs 14, 15에 있음을 설명했다.
동안대부분의 연구는 보호 면역 반응의 확립에 연루 이펙터 세포의 특성에 집중 한 덜은 선천성 면역계와의 상호 작용, 특히 피부에 주입 약독 기생충의 운명에 대해 공지되어있다. 특히, CD8 + T 세포 기생충 항원 흡수, 처리 및 표시에 관련된 항원 제시 세포의 특성화 PE 항원 취득 피부 DLN 구획 모두에서 발생할 수 있다는 것을 아는 것은 매우 중요하다. 이전 생체 내에 이미징 연구는 포자 소체와 수지상 세포 사이의 초기 상호 작용이 DLN 10,17에서 관찰하는 동안 감염 모기에 물린 16 다음 피부에 밝은 형광리스-GFP 양성 세포의 초기 유입을 설명했다. 더 최근에는 모기에 의해 피부에 접종하여 포자 소체가 피부에 모두 돌기 규제 T 세포의 운동성을 증가시키는 것으로보고되어있다마우스, 항원 제시 세포의 감소 된 수는 18 DLN 관찰하면서.
우리는 더 정확하게 식별하고, 백혈구의 서브 세트에 피부에 모집 RAS (19)의 투여가 면역 피내 주사 다음 기생충과 상호 작용하는 것과 같이 잘 DLN 대응 정량화 목적. 이러한 맥락에서, 우리는 모두 조직에서 골수 세포 (CD45 + CD11b를 +)를 분리하고 세포 계측법 = 다중 매개 변수 흐름에 의해 관심의 개체군을 특징으로한다. 슈만 편모충 주요 피부 감염 (20)의 초기 단계에 설명 된 면역 반응과 일치, 분사를 포자 소체하는 기본 호스트 응답은 염증성 단핵 세포 (CD45 + CD11b를 다음 다형 핵 호중구 (CD45 + CD11b를 + Ly6G + Ly6C의 INT)의 연속 모집으로 구성 + Ly6G - differenti에 기초하여 식별 Ly6C +)Ly6G 및 Ly6C 표면 마커의 알 식입니다.
우리는 마우스 피부에서 골수 세포를 분리하고 DLN 감염된 모기의 침샘에서 추출 RAS의 용량을 면역의 피내 주사를 다음 여기 프로토콜을 설명합니다. 재현 피내 주사 및 조직 처리는 감염된 조직 내에서 세포 인구 침투의 표현형 변화를 정량화하는 중요한 단계이다. 아래에 설명 된 접근 방식은 신뢰성있는 분석은 말라리아 기생충의 피부 DLN 염증 반응을 평가하기 위해 각종 실험 시스템으로 확장 될 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 파스퇴르 연구소의위원회와 지역 동물 실험에 대한 윤리위원회 (윤리위원회 IDF-파리 1, 파리, 프랑스, 계약 번호 : 2012-0015)에 의해 승인하고, 해당 지침과 규정에 따라 수행.
1. 재료 및 시약
- 이전 21 설명 된대로 3~5일 출현과 후면 후 감염된 쥐에 먹이 여성 아노 펠 레스 stephensi 모기 (Sda500 변형)를 사용합니다.
- 사용 기생충 구성 적 열 충격 단백질 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현 변형체 berghei ANKA 클론. 이 기생충의 라이프 사이클에 걸쳐 22 밝은 형광을 산출한다.
- 사용 여성 C57BL / 6JRj 마우스 (7 주령).
참고 : 설명 프로토콜에 사용 된 모든 시약은 재료 / 장비의 수 T에 나열되어 있습니다.
- 전염성 혈액 식사 후 18~25일 사이에 수집하고 이전 21 설명 된 바와 같이 얼음에 15 ML 튜브로 모기를 초기 마취. 조심스럽게 튜브를 반전하여 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 얼음에 곤충을 유지하고 γ- 또는 X-조사의 12 krad 용량에 모기를 노출합니다.
- 조사 된 모기의 침샘에서 감쇠 포자 소체를 격리는 이전 21 설명했다. 포자 소체를 해제하도록 호감을 부드럽게 얼음에 배속 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 (15 μl의 주위에) 작은 볼륨에 감염된 침샘을 수집합니다.
참고들의 강력 발현에 의해 입증 비판적 소량의 고농도 기생충 현탁액의 주입, 미리 선택된 잘 감염된 모기의 높은 번호로부터 침샘의 충분한 수를 채취하는 것이 중요녹색 형광. - 덩어리 모기 파편을 제거하기 위해 낮은 밀착성 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 구성된 35 μm의 셀 스트레이너 캡을 통해 포자 소체 현탁액 필터.
- 이전 21 바와 같이 절연 포자 소체의 총 수를 계산하고 83000 포자 소체 / μL를 얻는 냉간 1X DPBS로 기생충 현탁액의 농도를 조절한다. 다음 단계를 계속하는 동안 얼음에 기생충을 저장합니다.
- 음성 대조군으로 사용하고 단계 2.2 및 2.3에 설명 된대로 샘플을 처리한다 감염되지 않은 모기의 침샘에 해당하는 번호를 수집합니다. 서스펜션의 침샘 추출물의 비슷한 농도를 얻기 위해 전술 한 바와 같이 샘플을 희석.
주 : 포자 소체 2 시간의 최대 얼음에 저장 될 수있다. 그러나 이상적으로 그들은 침샘을 분쇄 한 후 시간 이내에 주입된다.
진피 라에 포자 소체 3. 주입귀 YER
- 케타민의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 마우스가 의식 불명의 상태에 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하는 5-8 분을 기다립니다. 모두 후방 발에 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 평가합니다.
주 : 마취 투여 량 미만에서 20 분 동안 지속되므로, 다음과 같이 신속하게 수행되어야한다. - 이전에 실체 (그림 1A) 아래에 위치 명확한 테이프로 복부 측면을 고정하여 마우스의 귀 날개를 안정. 조심스럽게 혈관의 손상을 방지하기 위해 귀를 누릅니다.
- 재현 탁 기생충 (10)의 0.6 μL와 10 μL 주사기 / 35 게이지 비스듬한 바늘을 넣습니다.
- 와, 조심스럽게 표피 아래, 귀 (그림 1A)의 등쪽면에 바늘을 삽입하여 4 주입 사이트 (사이트 당 0.15 μL)의 포자 소체 서스펜션을 제공베벨까지, 모든 혈관을 피하기 위해주의하면서. 몇 초를 제거하기 전에 주입 물의 역류를 방지하기 위해 바늘이 진피에 남아있을 수 있습니다. 절차 (도 1b 및도 1c)의 단부에 각각 주사 부위 구진 특성을 관찰한다.
- 주입 후, 조심스럽게 테이프에서 귀를 제거합니다.
- 단계 3.2-3.4의 기생충에 따라 동일한 용량과 반대측 귀 주입한다.
- 단독 주입 및 진피 모기 재료의 증착에 의해 매개되는 염증 반응을 평가하기 위해 1X DPBS 0.6 μL 또는 비감염 모기에서 1X DPBS + 침샘 추출물 0.6 μL 중 2 부가 마우스 주입.
- 새장에 다시 배치하기 전에 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다.
주 : 피부 적절한 포자 소체 증착 형광 현미경 (도 2a 및도 2b로 모니터링 할 수있다previsously 23 설명 참조)는, 마우스가 준비되고있다.
4. 피부와 배수 림프절의 해부
- 표준 매체 (SM)를 준비 다음과 같이 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) + 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 400 U 보충 -1 - 라진 에탄 산 (HEPES) / ㎖ 콜라게나 제 50 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 (DNase의) .
- DLN 샘플 잘 당 + 70 μm의 셀 스트레이너 4.5 ml의 SM (플레이트 A) 및 피부 샘플 웰 당 4.5 ML의 SM (플레이트 B)와 얼음이 6도 평면 바닥 조직 배양 플레이트를 준비합니다.
- 포자 소체 접종 다음 원하는 시점에서 깊이 복강 주사 케타민 (125 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏)의 혼합물 종래 경추 탈구하여 마우스를 마취. 마우스가 임상 죽음의 흔적을 보여줍니다 확인하고 즉시 절개를 시작합니다.
참고 : 골수 세포 모집의 반응 속도는 INJ 후 서로 다른 시간에 검사 할 수ection (즉, 2 시간, 4 시간 이전 14 설명 된 바와 같이 24 시간). - 오염의 가능성을 줄이기 위해 귀 접종하고 70 % 에탄올로 대응 목 부위를 소독.
- 멸균 가위와 집게를 사용하여 무균 주변의 지방을 수집하지 않고 근위 귀의 DLN을 해부하다. jugulo-carotidian 고랑의 첫 번째 절개를 수행하고 운영 필드에서 머리카락을 제거합니다. 주변 조직에 비해 잿빛 나타나는 DLN을 노출이 집게로 절개 스트레치.
- 그것의 제거를 용이하게하기 위해 집게와 DLN의 상단에 조심스럽게 결합 조직을 꼬집어. 림프 조직 (그림 3a 및 3b) 밑에 집게를 배치하여 DLN의 압축을 풉니 다. 잘 포함하는 4.5 ml의 SM + 70 μm의 셀 스트레이너 (플레이트 A)에 DLN를 놓습니다.
- 멸균 날카로운 가위와 집게 (그림 4A)를 사용하여 전체 접종 귀를 수확. Separ곤란과 두 개의 집게 (- 4E 그림 4B)로 끝나는 컷 떨어져 간격으로 귀 지느러미와 복부 측면을 먹었다. 두 조직이 완전히 매체에 몰입 확인하고 잘 포함하는 4.5 ml의 SM (플레이트 B)로 배치합니다.
참고 실험의 신뢰도를 향상시키고 관심 셀의 수를 증가시키기 위하여, 풀 2 샘플 당 동일한 마우스 귀에서 2 dLNs 주입. - 귀 및 1X DPBS 또는 침샘 추출물 중 하나를 접종 마우스의 dLNs 병렬 수확 및 처리. 음의 단일 얼룩 보상 컨트롤 순진 마우스에서 수확이 추가 귀 림프절 샘플을 포함합니다.
림프절 5. 세포 분리
- 부드러운 교반하면서 15 분 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 림프절 (플레이트 A)를 품어. 콜라게나 제와 DNase의 ACTI을 중화 잘 당 10 mM의 최종 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가vities. 얼음에 다음 단계를 수행합니다.
- 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용 림프절 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다.
- 500 ㎕의 1X DPBS + 2 % 소 태아 혈청 (FBS) + 2mM의 EDTA 회 셀 스트레이너 헹군다. 15 ML 튜브에 잘의 전체 볼륨을 전송합니다.
- + 2 % FBS + 2mM의 EDTA 500 μl의 1X DPBS로 잘 두 번을 씻어 15 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다.
귀의 피부 6. 세포 분리
- 부드러운 교반하면서 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 귀 전단지 (플레이트 B)를 품어.
참고 : 배양 20 분 후, 조직 소화를 촉진하고 나머지 40 분 동안 인큐베이터에 다시 샘플을 넣어 작은 조각으로 가위로 귀 전단지를 잘라. 단일 세포 배양 시간의 끝에서 배지에서 관찰 될 수있다. - 10 mM의 최종 추가 물론 당 EDTA는 콜라게나 제와 DNase의 활동을 무력화합니다. 얼음에 다음 단계를 수행합니다.
- 새가 아니라 1 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 셀 스트레이너를 포함에 귀 조직 파편과 매체의 전체 볼륨을 전송합니다. 쉽게 귀 조직 단편을 수집 팁의 단부로부터 2 ~ 3 mm를 잘라.
- 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용하여 귀 조직 단편 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다.
- 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 두 번 셀 스트레이너를 씻어.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 50 ㎖ 튜브에 잘 전체 볼륨을 전송합니다.
- 잘 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS와 + 2 mM의 EDTA를 씻어 50 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다.
참고 : 다른 단계는 피부에서 총 세포를 분리하고 DLN 조직은 그림 5에 요약되어있다.
- 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 피부와 DLN 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 사용하여 펠렛을 재현 탁.
- 혈구를 사용하여 피부 DLN으로부터 분리 된 세포의 총 수를 계산하기 위해 각각의 샘플의 작은 양을 수집한다. 0.04 %에게 세포 생존을 결정하는 트리 판 블루를 추가합니다.
8. 비 차단 항원 특이 적 결합
- 라벨이없는 CD16 / CD32 된 Fc 블록 항체의 10 ㎍ / ML을 추가합니다. (더 이상 갈 수있다) 4 ° C에서 20 분을 품어.
- 차가운 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 2 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA 300 μl의 1X DPBS로 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 샘플을 유지한다.
9. 염색 피부와 림프절 골수성 세포
- 이전에 차단 스키를 품어n 및 DLN 라이브 / 죽은 추적기 (즉, 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 또는 DAPI), 항 CD45 및 안티 CD11b를 특정 항체와 세포입니다.
주 : 관심의 골수 세포 개체군 특히 진귀한 농축하기 위해, CD45 + 세포 및 림프구는 각각 피부로부터 정제 될 수 있거나 또는 자기 비드 촉진 셀 소팅에 의해 DLN 120408. DLN 분리 대부분의 셀 이후 + CD45, 항 CD45의 사용이 필수적이다 아니다. 다른 마커는 양 또는 음의 게이팅 전략으로 관심 골수 세포 개체군을 식별하기 위해 포함될 수있다. 이 프로토콜에서, DLN에 모집 골수 세포 CD8α + 세포를 제외하여 농축 하였다 (전체 T 세포 구획 항 CD3 특이 적 항체를 사용하여 타겟팅 될 수있다). - 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 450 XG에 500 μl의 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA, 원심 분리기 샘플 5 분을 추가하고 공중으로 폐기rnatant. 두 번 세척 단계를 반복합니다.
- 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 함께 샘플을 재현 탁. 35 μm의 세포 여과기를 통하여 FACS 튜브 내의 전체 볼륨을 전송. 100 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 가진 필터를 씻어.
- 유동 세포 계수기에서 염색 된 세포를 실행합니다. 게이트가 하나의 세포에게 살 (DAPI - FSC-W) 죽은 세포와 이중선을 제외 할. DLN (그림 6B)에 대한 CD11b를가 + 이벤트 - 피부 (도 6a)와 (CD45의 +) CD8α에 대한 플롯 CD45 + CD11b를가 + 이벤트.
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Representative Results
우리는 최근 P.의 면역 용량의 바늘 주사기 주입을 입증 마우스 피부는 피부와 DLN (19)의 염증성 단핵구 다음 다형 핵 호중구의 연속 채용을 유도에 berghei은 포자 소체. 프로토콜 절 위에 성공적으로 이어 진피 포자 소체의 다수의 다중 분사 다음 두 조직으로부터 살아있는 골수 세포를 분리하기 위해 사용 된 절차에 상세 설명 (도 1 및도 2). 계측법 멀티 파라 흐름에 의해 세포의 침윤을 분석하여도 5에 요약 된 바와 같이 처음 24 시간 이내에, DLN (도 3)와 피부 주사 부위 (도 4) 및 절연 처리 하였다. 전반적으로,이 기술은 평균 104 CD45 + CD11b를 +와 2.10 4 CD11b를가 + 살아있는 단일 세포를 분리하기 위해 우리를 허용각각 피부와 DLN합니다. 비 브리 단셀의 허용 가능성은 피부 40~70% 및 DLN위한 70~90%에서였다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 피부에서의 골수 세포의 빈도 (CD45 +는 CD11b +) 및 DLN (CD8α -는 CD11b +)이 강하게 비 감염된 쥐와 비교하여 RAS 피내 주사에 따라 증가한다.
그림 1 : 나는 마우스의 귀에 포자 소체의 주입을 ntradermal. 마취 마우스의 귀 날개의 포자 소체의 피내 주사를 보여주는 (A) 이미지. 귀의 복부 측면 분명 테이프는 이전 해부 현미경 배치로 안정화된다. 바늘은 조심스럽게 베벨 위로, 표피 아래, 귀 등의 측에 삽입됩니다. (B - C) 기생충 현탁액의 0.1 ~ 0.2 μL의 (C) 피내 주사 후 귀 날개의 등 쪽 이전 (B)과를 보여주는 그림. 특징적인 구진 (검은 색 화살표) 작업의 끝에서 주사 부위에서 관찰 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 2 : 마우스의 귀 진피의 포자 소체 예치의 이미지 마우스 피부 15 분 후 분사 (스케일 바 = 60 μm의에 (점선으로 표시) 주사 부위에서 마이그레이션 RAS 표시 (A) 형광 현미경, 10X를 확대). 포자 소체의 경로는 형광 신호의 최대 강도 투영에 의해 표현된다. 녹색과 빨간색 형광 재spectively 시작과 인수의 10 초 후 피부 기생충 위치를 보여줍니다. (B) RAS (녹색)의 높은 배율은 피부에 주입 (μm의 스케일 바 = 20; 25X 배율). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 데모 용 에반스 블루의 피내 주사 다음 근위 귀의 DLN의 절개를 보여주는 림프절 처리 (A) 사진을 배수. 마우스를 경추 탈구 후 목을 70 % 에탄올로 소독된다. 제 절개 예리한 가위 경정맥-경동맥 영역에서 이루어지고, 피부가 운영 필드로부터 제거된다. 절개는 GR을 표시 DLN을 노출이 집게로 늘어ayish 주변 조직에 비해. 결합 조직을 조심스럽게 DLN의 위에 포셉 협지 점진적 그로부터 분리된다. 마지막으로, DLN는 림프 조직 아래에 겸자를 삽입하여 추출 하였다. PBS의 드롭에서 추출 된 DLN을 보여주는 (B) 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 귀 피부 가공 연속적인 단계를 보여주는 사진은 접종 귀를 처리합니다. (A) 마우스를 경추 탈구 후, 이어 70 % 에탄올로 소독하고, 살균 예리한 가위 집게를 사용하여 제거 하였다. (B - D) 귀의 지느러미와 복부 측면을 가볍게 곤란 및 s로 구분됩니다절단 따로 따로 간격은 두 집게로 끝납니다. (E) 귀 전에 효소 치료의 지느러미와 복부 측면을 보여주는 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :.. 프로토콜 개요 피부와 DLN 조직에서 총 세포를 분리하는 주요 단계의 도식 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 귀 피부와 근위 DLN에서 격리 된 골수성 세포 인구을 보여주는 대표 FACS 플롯.게이팅 전략은 피부 (A) 및 DLN (B)의 골수 구획을 분석한다. CD45 + CD11b를 +와 CD8α - CD11b를 + 세포는 각각 피부와 DLN 총 라이브 단일 이벤트에 문이 있었다. 각 조건의 경우, 5 × 10 5 총 이벤트 (2 귀를 2 DLN 샘플 당 풀링) 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 - 인간 영장류 (25)에보고 된 바와 같이, LAP의 IV 투여는 전술 한 노선에 비해 더 강력한 보호 성 면역 반응을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 바늘 및 주사기를 사용하여 투여 이외 IV 경로는 여전히 인간 질량 접종 적합 남아 노력은 현재 자신의 보호 효능을 최적화하도록 이루어지고있다.
마우스에서 실시 최근 연구에서 입증특히, ID 경로의 경우에는 D, 즉 큰 부피로 희석 기생충의 단일 예방 접종에 비해 다중 주사 부위 (4 점) 상당히 증가 기생충 감염의 포자 소체 서스펜션 (1 μL의 범위)의 소량의 증착 (50 μL) 24. 우리의 실험 시스템 (C57BL / 6 마우스 - P. berghei)에서 완벽한 보호는 19 (0.6 μL, 4 주사 부위에 50,000 RAS)를 기생충의 고농도 서스펜션의 귀 진피에서 여러 주사 후 이루어졌다. 이러한 상황에서, 우리는보다 정확하게 우리 기생충 (19)에 응답하여 피부 DLN에서 채용이 주요 골수 세포의 서브 세트를 식별 할 수 RAS 투여를 면역화 로컬 숙주 면역 반응을 분석하기 위해 상기 프로토콜을 세웠다.
파라 메트릭 멀티 - 유동 세포 계측법 숙주 반응의 맥락에서 정확한 식별 및 면역 세포 변화의 정량화를 허용감염 19, 20이다. 생존 세포의 다수의 분리 재현성 표현형 분석을 수행하는 것이 중요하다. 이를 위해, 효소의 농도 및 조직 분해 기간은 최적화되어야한다. 장기 조직 소화가 감소 세포 생존과 세포 표면 항원의 발현 (29)의 변경을 초래할 수 있지만 실제로, 효소 또는 불충분 배양 시간의 낮은 농도는 세포의 낮은 수율과 불완전한 소화가 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 콜라게나 제 처리를 사용하여 잘 확립 된 프로토콜은 흔히 30 표현형 분석에 사용되는 중요한 표면 분자의 검출 감도의 한계에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
는 콜라게나 / DNase의 진피가 액세스 할 수 있기 때문에 셀 분리의 품질을 최적화하는 여러 파라미터 중에서, 귀 피부의 등 및 복부 부분의 분리가 필요하다. 또한, 소형으로 피부 닦지조각 따라서 소화 시간 단축을 가능하게하는 효소에 접근 가능한 표면적을 증가시킨다. 마지막으로, 기계적 해리의 사용은 피부 DLN 모두 세포 수에서의 수율을 높일 수 있습니다. 그러나, 과도한 해리 부정적인 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 추가 스트레스의 원인이 될 수 있습니다.
고정 관심 드문 긍정적 인 사건의 구별을 복잡하게 차선 염색에 이르게하기 때문에 우리는 살아있는 세포의 인수를 선호 (데이터는 도시하지 않음). 또한, 죽은 세포의 차별이 더 문제였다. 세포 정착이 요구되는 경우에, 우리는 LIVE / DEAD 정착 사균 얼룩의 사용을 제안했다.
정의 된 프로토콜을 사용하여, 반응하여 피부에 침투 DLN 우리 성공적 절연 골수 세포 주입 (도 6A 및 B)를 기생충. 우리는 일반적으로 비교 DLN (70-90%)에서 가능한 단일 세포의 높은 수준을 얻기피부 (40-70%). 이러한 차이는 추가의 피부 세포를 분리하는 기계적 해리 단계 (스킨 층 분리, 닦지 강한 숙성)와 함께 효율적으로 효소 분해에 필요한 긴 배양 시간에 의해 설명 될 수있다.
마지막으로, 포자 소체의 ID 주입하기 위해 호스트 응답을 분석 할 때 고려해야하는 중요한 매개 변수는 피부 (19, 20)의 니들 삽입 모기 침샘 추출물 증착 모두에 의해 유도 된 염증의 정도이다. 따라서 우리는 1X PBS 단독으로 또는 구체적 기생충에 의해 유발 된 면역 반응을 평가하기위한 비 - 감염된 모기 동일한 수의 침샘 추출물 중 부가적인 마우스를 주입하도록 제안한다. 요컨대, 우리 침샘 높은 기생 부하 감염된 모기를 해부하고, 피부에 침착 될 수 모기 재료의 양을 제한하는 기생충 현탁액 필터링 부탁.
나는N 요약, 설명 된 프로토콜을 통해 피부와 DLN에서 골수 세포의 분리는 신뢰할 분석법 변형체 감염 염증 반응 동안 동적 세포 변화를 평가하기 위해 상기 호스트의 피부에 전송되는 다른 병원체에 확장 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA - 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 "전염병을 신흥의 통합적인 생물학"에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
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