Abstract
זיהום מלריה מתחיל כאשר בשלב sporozoite של Plasmodium הוא מחוסן לתוך העור של מארח יונק באמצעות עקיצת יתוש. הטפיל הניע מאוד לא רק מגיע הכבד לפלוש hepatocytes ולהפוך לצורה כדורית-זיהומיות. זה גם נודד לתוך העור כדי הלימפה הפרוקסימלי ניקוז באזור הזריקה, שם הוא יכול להיות מוכר מושפל על ידי תושב ו / או תאי מיאלואידית גייס. הדמית Intravital דיווחה על הגיוס המוקדם של לויקוציטים החיובי ליס-GFP ניאון בהיר בעור ואת יחסי הגומלין בין sporozoites ו CD11c + תאי הלימפה הניקוז. אנו מציגים כאן הליך יעיל להתאושש, לזהות למנות את תת תא מיאלואידית כי מגויסים על העור העכבר וניקוז בלוטת לימפה לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של sporozoites במודל בעכברים. זרימת אפיון פנוטיפי רבה פרמטרית באמצעות cytometry מספקתassay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים מוקדם במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium.
Introduction
מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות הקטלניות בעולם, הרג יותר מחצי מיליון בני אדם בשנה. זיהום על ידי Plasmodium, הסוכן סיבתי של המחלה, מתחיל שלב טרום האריתרוציטים (PE). במהלך שלב זה, sporozoites מוזרק לתוך העור מארח ידי יתוש נקבת Anopheline להגיע הכבד דרך מחזור הדם ולבדל hepatocytes בתוך לצורות הטפילות המדביקים תאי דם אדומים ולגרום הסימפטומים של המחלה.
שלבי PE של Plasmodium מהווים יעד חסוי לחיסון נגד מלריה. אכן, לחיות חיסונים מוחלשים נגד בשלבים אלה, כגון sporozoites נחלש קרינה (RAS), טפילים נעצר גנטית (GAP) או chemoprophylaxis ו sporozoites (CPS) הוכיחו את יכולתם להגן הן מכרסמים ומארחים האנושי 1-9. במודל המכרסם, רוב מחקרי חיסון נערכים ניצול חיסון תוך ורידים, המהווה את תקן הזהב במונחים של יעילות מגן. עם זאת, התיאור של שלב עור ואת החשיבות של הבלוטה לימפה הניקוז הקשורים עור (DLN) ב לעורר הגנה השתנה התפיסה שלנו של שלב PE והדגיש את החשיבות של המסלול תוך-עורית של הזרקה. הדמיה Intravital של פ sporozoites berghei מוזרק לתוך העור של מכרסמים הראו כי רק ~ 25% של הבידוד מגיע הכבד דרך מחזור הדם. הנותרים ~ 75% מפיצה בין הפרוקסימלי DLN (~ 15%) ואת העור (~ 50%) 10,11, שבו חלק קטן יכול להפוך ולהישאר בחיים במשך שבועות בתוך תאי העור 12,13. יתר על כן, מחקרים מאוחרים יותר תיאר כי הקמת הגנה חיסונית יעילה לאחר חיסון intradermal בעיקר מתרחש בעור-DLN, שבו טפיל ספציפי תאי CD8 + T מופעלים, ורק באופן שולי בטחול או בכבד-dLNs 14,15.
בזמןרוב המחקרים התמקדו באפיון תא המפעיל המעורב בהקמה בתגובת מגן חיסון, הרבה פחות ידוע על גורלם של טפילי מוחלשים חיים מוזרקים לתוך העור, במיוחד יחסי הגומלין שלהם עם מערכת החיסון המולדת. בפרט, אפיון של תאי מציגי אנטיגן מעורבים ספיג אנטיגן הטפיל, עיבוד והצגה לתאי CD8 + T הוא בעלת חשיבות מכרעת, בידיעה כי רכישת אנטיגן PE יכולה להתרחש הוא בעור ותאי DLN. מחקרי הדמיה intravital הקודם תיאר נהירה מוקדם של תאים חיוביים במאור פלורסנט ליס-GFP בעור בעקבות עקיצת יתוש זיהומיות 16 תוך אינטראקציות מוקדם בין sporozoites ותאים דנדריטיים נצפו DLN 10,17. לאחרונה, זה כבר דווח כי sporozoites המחוסן בעור על ידי יתושים מגביר את תנועתיות של שני תאי T הדנדריטים ורגולטוריים בעורעכברים, בעוד מספר ירידה של תאים מציגי אנטיגן נצפתה DLN 18.
החוקרים ביקשו לזהות ולכמת ליתר דיוק תת לויקוציטים גייס בעור המקביל DLN כמו גם אלה אינטראקציה עם הטפיל לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של RAS 19. בהקשר זה, אנחנו מבודדים תאי מיאלואידית (CD45 + CD11b +) משני הרקמות ומאופיינות תת-אוכלוסיות של ריבית על ידי זרימה רבה = פרמטרית cytometry. עולה בקנה אחד עם התגובה החיסונית מתוארת בשלב המוקדם של דלקת עור גדולה שושנת יריחו 20, תגובת המארח העיקרית sporozoite הזרקת מורכב גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) ואחריו מונוציטים דלקתיים (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) אשר מזוהים על בסיס differentiביטוי אל של סמני משטח Ly6G ו Ly6C.
אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאי מיאלואידית מעור עכבר DLN לאחר הזרקת intradermal של מחסנת מינונים של RAS שחולצו מן בלוטות רוק יתוש נגועות. זריקות תוך-עורית לשחזור ועיבוד רקמה הם שלבים קריטיים לכמת שינויים פנוטיפי של הסתננות אוכלוסיית תאים בתוך רקמות נגועות. הגישה כמפורט להלן מספק assay אמין להעריך את העור לתגובה דלקתית DLN כדי טפיל Plasmodium ויכול להתארך עד מערכות ניסיוניות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדה של מכון פסטר על ידי ועדת האתיקה המקומית על ניסויים בבעלי חיים (ועדה אתית צה"ל-פריז 1, פריז, צרפת; מספר הסכם: 2012-0015) וביצע בהתאם להנחיות והתקנות החלים.
1. חומרים ריאגנטים
- השתמש אנופלס נקבה יתושים stephensi (זן Sda500) הניזונים עכברים נגועים 3-5 ימים לאחר הופעתה ומאחור כפי שתואר לעיל 21.
- השתמש טפילים Plasmodium berghei אנקה שיבוט המבטאים את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הגן תחת שליטה של חלבון הלם חום המכונן 70 (HSP70) האמרגן. זה מניב קרינה בהירה לאורך כל מחזור החיים הטפילים 22.
- השתמש נקבה C57BL / עכברים 6JRj (7 שבועות בן).
הערה: כל החומרים הכימיים המשמשים הפרוטוקול המתואר מפורטים T המסוגל של חומרים / ציוד.
- בין 18-25 ימים לאחר ארוחת דם זיהומיות, לאסוף וקור-להרדים יתושים לתוך צינור 15 מיליליטר על קרח כפי שתואר קודם לכן 21. בזהירות להעביר אותם על צלחת פטרי על ידי צינור היפוך. לשמור על חרקים על הקרח ולחשוף את היתושים מנה 12 krad של הקרנה x γ- או.
- לבודד sporozoites מוחלש מבלוטות רוק יתוש מוקרנות כפי שתואר לעיל 21. אסוף בלוטות רוק נגועות בנפח קטן (סביב 15 μl) של בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) על קרח בעדינות למחוץ אותם לשחרר sporozoites.
הערה: ההזרקה של השעיה טפילה מרוכזת מאוד בנפח קטן להיות קריטי, לכן זה חיוני כדי לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק ממספר רב של יתושים שנבחרו מראש גם נגועים, כפי שמעידים הביטוי החזק שלהםקרינה ירוקה. - סנן את ההשעיה sporozoite באמצעות כובע מסננת תא 35 מיקרומטר המותאמים צינור הידבקות 1.5 נמוך מ"ל microcentrifuge כדי לחסל גושים ופסולת יתוש.
- לספור את המספר הכולל של sporozoites מבודד כפי שתואר לעיל 21 ולהתאים את הריכוז של השעיה טפיל עם DPBS 1x קר להשיג 83,000 sporozoites / μl. אחסן את הטפילים על קרח תוך המשך בשלבים הבאים.
- אסוף את המספר השווה של בלוטות רוק מפני יתושים נגועים כי תשמשנה שליטה שלילית ולעבד המדגם כמתואר בשלבי 2.2 ו -2.3. לדלל את המדגם כמצוין לעיל כדי להשיג ריכוז דומה של תמציות בלוטת רוק ההשעיה.
הערה: ניתן לאחסן Sporozoites על הקרח לכל היותר 2 שעות. עם זאת, באופן אידיאלי הם מוזרקים תוך שעה לאחר ריסוק בלוטות הרוק.
3. הזרקה של Sporozoites לתוך La Dermalyer של האוזן
- להרדים בעלי חיים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג) תערובת. חכה 5-8 דקות עבור בעכבר כדי להיות במצב של חוסר הכרה וליישם משחת עיניים אל העיניים כדי למנוע התייבשות קרנית. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ בוהן עדין על רגליים אחוריות הוא.
הערה: המינון של הרדמה נמשך פחות מ -20 דקות, כך על פי השלבים הבאים חייבים להיעשות במהירות. - יצבו את אפרכסת האוזן האוזן של העכבר על ידי תיקון בצד הגחון עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת (איור 1 א) סטראו. לחץ בעדינות את האוזן כדי למנוע נזק של כלי הדם.
- טען מחט ומהוקצע 10 מזרק μl / 35 מד עם 0.6 μl של טפילים resuspended 10.
- לספק את ההשעיה sporozoite ב 4 המוזרקים (0.15 μl לכל אתר) על ידי החדרת מחט על הגב בצד של האוזן (איור 1 א), מתחת לאפידרמיס בקפידה, עםאת ההטיה, מקפיד להימנע מכל כלי דם. אפשר מחט להישאר בדרמיס עבור כמה שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant לפני הסרתו. שימו קשריר מאפיין בכל הזריקה בסוף ההליך (איור 1B ו 1C).
- לאחר ההזרקה, להסיר את האוזן בזהירות מהקלטת.
- להזריק את האוזן הנגדית באותו המינון של טפילים על ידי ביצוע שלבי 3.2-3.4.
- להזריק 2 עכברים נוספים עם או 0.6 μl של 1x DPBS או 0.6 μl של תמצית בלוטת הרוק 1x DPBS + מפני יתושים נגוע על מנת להעריך את התגובה הדלקתית מתווכת על ידי הזרקת לבד ואת בתצהיר של חומר נגד יתושים בדרמיס.
- צג התאוששות עכבר מן ההרדמה לפני ההצבה אותו בחזרה לתוך הכלוב.
הערה: בתצהיר sporozoite הנאה בעור ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א ו -2), מכין את העכבר כמתואר previsously 23.
עור 4. וניקוז הלימפה צומת Dissection
- הכן בינוני סטנדרטי (SM) כדלקמן: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) + 25 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) בתוספת 400 U / collagenase מ"ל ו -50 מיקרוגרם / מ"ל deoxyribonuclease (DNase) .
- הכינו שתי צלחות תרבית הרקמה 6 גם שטוח התחתונה על קרח עם 4.5 מ"ל SM + 70 מיקרומטר תא מסננת לכל טוב עבור דגימות DLN (צלחת) ו -4.5 מ"ל SM לכל טוב עבור דגימות עור (פלייט B).
- בנקודת הזמן הרצוי הבאה חיסון sporozoite, עמוק להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (125 מ"ג / ק"ג) / xylazine (12.5 מ"ג / ק"ג) נקע בצוואר הרחם לפני התערובת. ודא העכבר מדגים סימני מוות קליני ולהתחיל לנתיחה מיד.
הערה: קינטיקה של גיוס תא מיאלואידית יכול להיבחן במועדים שונים לאחר injשיקוף (כלומר 2 hr, 4 hr ו -24 שעות כפי שתוארו לעיל 14). - לחטא את האוזן המחוסנת ובאזור הצוואר המקביל עם אתנול 70% כדי לצמצם את האפשרות של זיהום.
- בעזרת מספריים מלקחיים סטרילית, בסביבה נקייה מחיידקים לנתח את DLN אזני הפרוקסימלי ללא איסוף השומן שמסביב. לבצע חתך ראשון מענית jugulo-carotidian ולהסיר את השערות משדה ההפעלה. למתוח את החתך עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה אפרפר לעומת הרקמה הסובבת.
- לצבוט את רקמות החיבור בקפידה על החלק העליון של DLN עם מלקחיים כדי להקל הסרתו. חלץ את DLN ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה (איור 3 א ו 3 ב). מניחים את DLN בתוך (צלחת) מסננת תא היטב המכיל 4.5 מ"ל SM + 70 מיקרומטר.
- קציר את האוזן המחוסנת כולו באמצעות מספריים חדים סטרילית מלקחיים (איור 4 א). separאכל את ההיבטים הגב ועל הגחון של האוזן ידי צובט וריווח מלבד הקיצוץ מסתיים עם שני מלקחיים (איור 4 ב - 4E). מניח אותם (B פלייט) 4.5 היטב המכיל מיליליטר SM מוודא הרקמות הם שקועות לחלוטין בטווח הבינוני.
הערה: על מנת לשפר את מהימנות הניסוי ולהגדיל את מספר התאים של עניין, ברכה 2 מוזרק אוזניים או 2 dLNs מאותו העכבר לדגימה. - קציר ולעבד במקביל האוזניים dLNs של עכברים מחוסנים עם או 1x DPBS או תמציות של בלוטות רוק. כלול 2 דגימות אוזן והלימפה נוספות צומת קוצרות עכבר נאיבי עבור פקדי פיצוי מכתים שליליים יחיד.
בידוד תא 5. מן בלוטות הלימפה
- דגירת בלוטות הלימפה (צלחת) ב 37 ° C + 5% CO 2 במשך 15 דקות תחת תסיסה עדינה. הוסף 10 מ"מ הסופי חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לכל טוב לנטרל collagenase ואת acti DNasevities. בצע את הצעדים הבאים על קרח.
- לנתק בלוטות הלימפה באמצעות הקצה העליון של הבוכנה מזרק 5 מ"ל. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן.
- יש לשטוף את מסננת תא פעמיים עם 500 μl 1x DPBS + 2% עוברית בסרום שור (FBS) + 2 מ"מ EDTA. העבר כל נפח של הבאר בתוך שפופרת 15 מ"ל.
- שוטפים את פעמיים היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 מ"מ EDTA ולהעביר את נפח לתוך הצינור 15 מ"ל. שמור צינורות על הקרח.
בידוד תא 6. מעור של האוזן
- דגירת עלוני האוזן (פלייט B) ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור שעה 1 תחת תסיסה עדינה.
הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, לחתוך את כרוזי אוזן עם מספריים לחתיכות קטנות כדי להקל על עיכול רקמות ולשים את הדוגמת לראש בחממה במשך 40 הדקות הנותרות. תאים בודדים ניתן לצפות בטווח הבינוני בסוף זמן הדגירה. - הוסף 10 מ"מ סופי EDTA לכל טוב לנטרל פעילויות collagenase ו DNase. בצע את הצעדים הבאים על קרח.
- מעביר את שברי רקמות אוזן ואת כל הנפח של מדיום חדש המכיל גם מסנן תא 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 1ml. חותכים 2 עד 3 מ"מ מהקצה של קצה כדי לאסוף את שברי רקמות האוזן בקלות רבה יותר.
- לנתק שברי רקמת אוזן באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק 5 מיליליטר. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן.
- שוטפים את מסננות תא פעמיים עם 500 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- מעבירים את כל נפח של הבאר לתוך צינור מ"ל 50 דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- יש לשטוף היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולהעביר את נפח לתוך שפופרת 50 מ"ל. שמור את הצינור על הקרח.
הערה: פעולות שונות על מנת לבודד תאים בסך הכל מן העור והרקמות DLN מסוכמים באיור 5.
- צנטריפוגה העור דגימות DLN במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- אסוף נפח קטן של מדגם זה לספור את המספר הכולל של תאים מבודדים מן העור DLN באמצעות hemocytometer. להוסיף 0.04% trypan כחול כדי לקבוע את כדאיות התא.
8. חסימה ללא Antigen ספציפית מחייב
- הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של CD16 נטולות-תווית / CD32 Fc-בלוק נוגדן. דגירה 20 דקות ב 4 ° C (יכול ללכת יותר).
- הוסף 2 מ"ל של קר 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולשמור על דגימות קרח.
9. עור מכתים תאי מיאלואידית הלימפה
- דגירת סקי חסם בעברn ו- DLN מבודדים תאים עם גשש Live / Dead (כלומר 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole או DAPI), אנטי CD45 ואנטי CD11b נוגדנים ספציפיים.
הערות: על מנת להעשיר את תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של עניין, במיוחד אלו נדירים, CD45 + תאים לימפוציטים יכולים להיות מטוהרים בהתאמה מהעור או מדולדלת מן DLN ידי מיון תא מגנטי חרוז עזר '. מאחר שרוב התאים המבודדים מן DLN הם CD45 +, השימוש בתרופות אנטי-CD45 הוא לא חובה. ניתן לכלול סמנים אחרים לזהות תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של הריבית על ידי אסטרטגיה חיובית או שלילית-gating. בפרוטוקול זה, התאים מיאלואידית גייס את DLN הועשרו על ידי למעט תאי CD8α + (תא תא T כולו יכול להיות ממוקד באמצעות נוגדן ספציפי אנטי CD3). - דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך. הוספת 500 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 מ"מ EDTA, צנטריפוגה דקות מדגם 5 ב 450 XG ב 4 ° C ו להתעלמות Supernatant. חזור על השלב לשטוף פעמיים.
- Resuspend דגימות עם 300 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 mM EDTA. מעביר את כל הנפח בתוך שפופרת FACS דרך מסננת תא 35 מיקרומטר. יש לשטוף את המסנן עם 100 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- הפעל את התאים מוכתמים בתוך cytometer זרימה. שער לחיות תאים בודדים (DAPI -, FSC-W) כדי לכלול תאים ו כפילויות מתים. מגרש CD45 + CD11b + אירועים העור (איור 6 א) ו- (+ CD45) CD8α - CD11b + אירועים עבור (6B איור) DLN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו לאחרונה הראינו כי הזרקת מחט מזרק של מינונים מחסנים של פ berghei sporozoites בעור העכבר גורם גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear ואחריו מונוציטים דלקתיים בעור DLN 19. באזור הפרוטוקול שתואר לעיל מפרט את ההליך המשמש לבודד תאי מיאלואידית חיו בהצלחה משני ברקמות באות זריקות מרובות של מספר רב של sporozoites בדרמיס האוזן (איורים 1 ו -2). בתוך 24 השעות הראשונות, DLN (איור 3) ואת זריקת עור (איור 4) היו מבודדים ומעובד כפי שמסוכם איור 5 לנתח את חדירת הסלולר על ידי זרימה רבה פרמטריים cytometry. בסך הכל, טכניקה זו אפשרה לנו לבודד בממוצע 10 4 CD45 + CD11b + ו- 2.10 4 CD11b + תאים בודדים חיעבור העור DLN בהתאמה. הכדאיות המקובלת של תאי בודדים שאינם פסולת נעה בין 40-70% עבור העור 70-90% עבור DLN. כפי שניתן לראות בתרשים 6, תדירות של תאים מיאלואידית בעור (CD45 + CD11b +) ואת DLN (CD8α - CD11b +) המגביר משמעותית לאחר ההזרקה intradermal של RAS לעומת עכברים שלא נדבקו.
איור 1: אני ntradermal הזרקת Sporozoites לתוך האוזן של עכבר. תמונה (A) מראה זריקה תוך-עורית של sporozoites של אפרכסת האוזן האוזן של העכבר בהרדמה. צד הגחון של האוזן הוא התייצב עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת מיקרוסקופ לנתח. המחט מוחדרת בזהירות בצד הגבי של האוזן, מתחת לאפידרמיס, עם למעלה שפוע. (B - Cתמונות) מראה את הגב בצד של אפרכסת האוזן האוזן לפני (B) ואחרי (ג) הזרקה תוך-עורית של 0.1-0.2 μl של השעיה טפיל. קשריר מאפיין (חץ שחור) ניתן לצפות באזור הזריקה בסוף המבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 2: הדמיה של Sporozoites שהופקדו האוזן הדרמיס של עכבר (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה RAS נודדות מאתר ההזרקה (מסומן על ידי קווים מקווקווים) בעור עכבר 15 דקות לאחר ההזרקה (בר סולם = 60 מיקרומטר; 10X הַגדָלָה). הנתיב של sporozoites מיוצג על ידי הקרנת העוצמה המקסימלית של האות ניאון. מחדש קרינה ירוקה ואדוםspectively יראה את מיקומך הטפיל בעור בתחילה ואחרי 10 שניות של רכישה. (ב) הגדלה גבוהה של RAS (ירוק) מוזרק בעור (בר סולם = 20 מיקרומטר; 25x הגדלה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניקוז עיבוד הלימפה (א) תמונה המציגה דיסקציה של DLN אזני הפרוקסימלי לאחר ההזרקה intradermal של אוונס כחול למטרות הדגמה.. לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, הצוואר הוא לחטא עם אתנול 70%. החתך ראשון הוא עשה באזור צוואר-התרדמה במספרי חדי העור הוסר משדה ההפעלה. החתך נמתח עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה גרעייש לעומת הרקמה הסובבת. רקמות החיבור ואז הם צבטו בזהירות עם מלקחיים על החלק העליון של DLN בהדרגה להינתק ממנה. לבסוף, DLN מופק על ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה. (ב) תמונה מראה את DLN חילוץ ירידה של PBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. עיבוד עור אוזן תמונות מראות את השלבים הרצופים לעבד את האוזן המחוסנת. (א) לאחר נקע בצוואר הרחם של העכבר, האוזן היא לחטא עם 70% אתנול ו להסיר באמצעות מספרי מלקחיים חדים סטרילי. (B - D) הגבו והיבטי גחון של האוזן מופרדים בקלילות על ידי צובט ו- sצעדה בנפרד לחתוך מסתיימת עם שני מלקחיים. (ה) תמונה המציגה את ההיבטים הגב ועל הגחון של טיפול אנזימטי לפני האוזן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:.. סיכום פרוטוקול ייצוג סכמטי של השלבים העיקריים לבודדות תאים הכוללים מן העור ורקמות DLN אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: אוכלוסיית תאים מיאלואידית מבודדת מעור האוזן ואת DLN הפרוקסימלי מגרש FACS נציג מראה את.האסטרטגיה gating לנתח בתא מיאלואידית בעור (א) ואת DLN (B). CD45 + CD11b + ו- CD8α - CD11b + תאים היו מגודרים על אירועי גופייה הכוללים חיים עבור העור DLN בהתאמה. עבור כל תנאי, 5 x 10 5 סך כל האירועים נרכשו (2 האוזניים ו -2 DLN ונקווה לדגימה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרספקטיבה של החיסון בקנה מידה גדול של בני אדם באמצעות חיסון למלריה sporozoite שלם, אחד האתגרים העיקריים להתגבר היא לפתח נתיבים אופטימיזציה ושיטות ממשל טפיל על מנת להבטיח חיסון מוצלח והגנה 24,25. אצל בני אדם, הערכת יעילות מגנה בתיווך הטפיל מוחלשים חיים (LAP) שבוצעה בעקבות יתושים טבעיים נושך 2, כמו גם תוך-עורית, תת עורית 25,26 ו- IV חיסונים 27. כפי שדווח במכרסמים 28 והלא-אנושי הפרימטים 25, הרביעי מנהלה של LAP גורמת מערכת חיסונית מגן חזק לעומת המסלולים הנ"ל. אף על פי כן, מסלולים שאינם IV של ממשל באמצעות מחט מזרק עדיין מתאימים יותר חיסון המוני אדם מאמץ כרגע נעשים כדי לייעל יעילות המגן שלהם.
מחקרים שנערכו לאחרונה בעכברים להפגיןד, במיוחד במקרה של התוואי מזהה, כי בתצהיר של נפח קטן של השעית sporozoite (טווח של 1 μl) ב מוזרקים מרובים (4 נקודות) infectivity הטפיל גדל באופן משמעותי לעומת חיסון יחיד של טפילים מדוללים ובהיקפים גדולים (50 μl) 24. במערכת הניסוי שלנו (עכבר C57BL / 6 - פ berghei), הגנה מלאה הושגה לאחר זריקות מרובות בדרמיס האוזן של השעיה ריכוז גבוה של טפילים (50,000 RAS ב 0.6 μl, 4 המוזרקים) 19. בהקשר זה, הקמנו את הפרוטוקול המתואר לעיל כדי לנתח באופן מדויק יותר את התגובה המקומית החיסון של הפונדקאי כדי לחסן מינונים של RAS שאפשרו לנו לזהות 2 תת תא מיאלואידית גדול גייסו בעור DLN בתגובה הטפילה 19.
זרימה רבה-פרמטרית cytometry מאפשרת זיהוי וכימות מדויקים של שינויי תא חיסון בהקשר של תגובה המארחתלזיהום 19,20. בידוד של מספר רב של תאי קיימא לכן זה קריטי לבצע ניתוח פנוטיפי לשחזור. לשם כך, ריכוז האנזים ואת משך עיכול רקמות חייב להיות מותאם. ואכן, ריכוז נמוך של אנזימים או זמן דגירה לא מספיק עלול להוביל עיכול לא שלם עם תשואה נמוכה של תאי בעוד לעיכול רקמת ממושך עלול לגרום כדאיויות תא ירידה ושינוי ביטוי אנטיגן פני תא 29. אף על פי כן, פרוטוקולים ומבוססים באמצעות טיפול collagenase הוכחו יש השפעה שולית על detectability של מולקולות פני שטח רלוונטיות שימוש תכוף עבור פנוטיפי מנתח 30.
בין מספר הפרמטרים שיכולים לייעל את איכות בידוד תא, הפרדת הגבי וחתכי גחון של עור האוזן חיונית, שכן הוא מאפשר collagenase / DNAse לגשת הדרמיס. בנוסף, וקוצצים את העור לתוך קטןחתיכות מגדילות את שטח הפנים נגיש האנזימים, ובכך מאפשרות פחות זמן עיכול. לבסוף, השימוש ניתוק מכני מסייע להגדיל את התשואה בתא מס הן לעור DLN. עם זאת, דיסוציאציה מוגזמת עלולה לגרום ללחץ נוסף שיכול להשפיע על כדאיות התא שלילי.
העדפנו רכישת תאי חיים מאז קיבעון מוביל מכתים לא טוב, שסבך הבחנה של אירועים חיוביים נדירים של עניין (מידע לא מוצג). יתר על כן, את האפליה של תאים מתים הייתה יותר בעייתית. במקרים בהם קיבוע התא נדרש, היינו מציעים את השימוש כתמים תאים מתים חי / מת אפשר לתקן.
באמצעות הפרוטוקול המוגדר, אנחנו תאים מיאלואידית מבודדים בהצלחה שחדר לתוך עור DLN בתגובה טפיל הזרקה (איור 6 א 'וב'). אנחנו בדרך כלל להשיג רמות גבוהות יותר של תאים בודדים קיימא מן DLN (70-90%) לעומתעור (40-70%). הבדל זה יכול להיות מוסבר על ידי זמן דגירה עוד צורך עיכול אנזימטי יעיל יחד עם צעדים נוספים של ניתוק מכאני לבודד תאי עור (פרדת שכבת עור, וקוצצים ואיחוד חזק).
לבסוף, פרמטר חשוב לקחת בחשבון בעת ניתוח התגובה לארח הזרקת sporozoites מזהה היא הרמה של דלקת הנגרמת על ידי שתי החדרת מחט בתצהיר תמצית יתוש בלוטות רוק בעור 19,20. לפיכך, אנו ממליצים להזריק עכברים נוספים עם או 1x PBS לבד או תמציות של בלוטות רוק מאותו מספר היתושים שאינם נגועים להעריך את התגובה החיסונית הנגרמת על-ידי יצרן הטפיל. בסך הכל, אנו ממליצים לנתח יתושים נגועים עם עומס טפיל גבוה בבלוטות הרוק ולנפות את ההשעיה הטפילה להגביל את כמות חומר יתוש שיכול להיות מופקדת על העור.
אניn לסיכום, הבידוד של תאי מיאלואידית מהעור DLN באמצעות הפרוטוקול המתואר מספק assay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium וניתן להאריך לפתוגנים אחרים המועברים לתוך העור של המארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים פטרישיה Baldacci, ונסה Lagal ו סבין Thiberge לקריאה ביקורתית, אירינה Dobrescu ו סבין Thiberge לעזרה מצלם ופאולין Formaglio להוראה בתחום ההדמיה vivo של תנועתיות sporozoite בעור העכבר. כמו כן, אנו רוצים להודות מארק Szatanik ומרכז ייצור הזיהום של אנופלס (פסטר CEPIA-Institut) לגידול יתושים. מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר AXA וקרנות מן Laboratoire ד אקסלנס "לביולוגיה אינטגרטיבית של מתעוררים מחלות זיהומיות" (מענק לא. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
