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Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados ​​en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.

Abstract

El diseño y desarrollo de una nanopartícula de oro-aptámero (AuNP) ensayo colorimétrico para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Los ensayos de color basadas objetivo AUNP selectiva se han desarrollado en el laboratorio de prueba de concepto controladas. Sin embargo, estos sistemas no han sido ejercida a un punto de fallo para determinar su uso práctico más allá de la configuración de laboratorio. Este trabajo describe un enfoque genérico para diseñar, desarrollar y solucionar problemas de un ensayo colorimétrico aptámero-AuNP para las pequeñas moléculas y analitos utilizando el ensayo para los ajustes en-el-campo. El ensayo es una ventaja, ya aptámeros adsorbidos pasivar las superficies de las nanopartículas y proporcionan un medio para reducir y eliminar las respuestas positivas falsas a analitos no objetivo. La transición de este sistema para usos prácticos necesario definir no sólo el período de validez del ensayo aptámero-AuNP, pero el establecimiento de métodos y procedimientos para la ampliación de la capaci almacenamiento a largo plazodades. Además, una de las preocupaciones reconocidas con lectura colorimétrica es la carga que para los analistas identificar con precisión los cambios a menudo sutiles en el color. Para disminuir la responsabilidad de los analistas en el campo, un protocolo de análisis de color fue diseñado para realizar las tareas de identificación de color sin la necesidad de llevar a cabo esta tarea en el equipo de calidad de laboratorio. Se describe el método para crear y probar el protocolo de análisis de datos. Sin embargo, para entender e influir en el diseño de los ensayos de aptámeros adsorbidos, las interacciones asociadas con el aptámero, objetivo y AuNPs requieren más estudios. El conocimiento adquirido podría conducir a la adaptación de los aptámeros para una funcionalidad mejorada.

Introduction

Colorimetría es una de las técnicas más antiguos utilizados en química analítica. Para esta técnica, una determinación cualitativa o cuantitativa del analito se realiza basándose en la producción de un compuesto coloreado 1. Por lo general, los ensayos de color utilizan reactivos que experimentan un cambio de color en presencia de la especie de analito, lo que se traduce en un cambio de color observable o detectable en el espectro de luz visible. Colorimetría se ha utilizado en la detección de blancos que van de átomos, iones y moléculas pequeñas a moléculas biológicas complejas tales como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos y proteínas 2-4. Para las últimas dos décadas, los nanomateriales han revolucionado el campo de los ensayos de detección, en particular con los ensayos basados ​​en color 5-6. La combinación de las propiedades químicas y físicas únicas de los nanomateriales con un elemento de reconocimiento selectivo de destino, tales como los anticuerpos, aptámeros de oligonucleótidos o aptámeros de péptidos, ha llevado al resurgimiento in el diseño y desarrollo de ensayos de detección colorimétricos 7.

Las nanopartículas metálicas tienen un demostrado la propiedad de cambio de color dependiente del tamaño, que ha sido explotado en el diseño de numerosos ensayos colorimétricos. Las nanopartículas de oro (AuNPs) son de particular interés debido a un cambio de color de rojo a azul característico, cuando se induce la solución dispersada de partículas de agregar 8, típicamente a través de la adición precisa de sal. La capacidad de controlar la transición de los dispersos (rojo) a los estados (azul) agregados ha llevado a la creación de sensores colorimétricos para iónico, pequeña molecular, péptido, proteína, y objetivos celulares 2-4,9. Muchos de estos sensores emplean aptámeros como el motivo de reconocimiento de diana.

Los aptámeros son moléculas de ADN o ácido ribonucleico (ARN) seleccionado de un grupo aleatorio de 10 12 -10 15 secuencias diferentes 10-11. El proceso de selección de destino identifica reelementos de la cognición con afinidades de unión en el régimen de baja nanomolar, y la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el proceso más comúnmente conocida 12-13. Ventajas de aptámeros base de oligonucleótidos para aplicaciones de detección incluyen la facilidad de síntesis, modificación química controlable, y la estabilidad química 14-15.

Un enfoque para la creación de un ensayo colorimétrico combina los nanomateriales con elementos de reconocimiento, consiste en la combinación de estas dos especies a través de la adsorción física de moléculas de ADN-aptámero a superficies AUNP. A través de unión a la diana-aptámero, el aptámero experimenta un cambio estructural 16 a 18, que altera la interacción del aptámero con la superficie AuNP, lo que conduce a una respuesta de color de rojo a azul inducible 19 con la adición de sal. Esta característica sorprendente de AuNPs proporciona un mecanismo de respuesta colorimétrica observable para dispositivos basados ​​en aptámeros que se pueden utilizar a Defirmar ensayos colorimétricos para diferentes analitos.

Los ensayos de color diseñados utilizando no covalentes, aptámeros de ADN físicamente adsorbidos sobre superficies AUNP tienen el estigma de ser una plataforma de sensores débil debido a problemas con la solidez, una propensión a la insuficiencia fuera de los entornos controlados de laboratorio, y la falta de información disponible para el uso en la práctica ajustes. Sin embargo, el ensayo colorimétrico basado aptámero-AuNP era de interés debido a la simplicidad de operación y respuesta de color observable. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para el diseño, desarrollo, operación, reducción de la superficie de respuesta relacionada con falso positivo, y el almacenamiento a largo plazo de ADN-AUNP ensayos colorimétricos basados ​​utilizando cocaína como representante del analito. Por otra parte, hemos propuesto este adsorbido aptámero enfoque de ensayo (Figura 1) de representar una ventaja debido a la simplicidad y facilidad de uso que resultó en menos pasos que el enfoque convencional para estos aptámero-AuNP culoays. Para este ensayo, el aptámero se añadió primero a las AuNPs, que se les permitió a adsorberse a la superficie por un período prolongado de tiempo. Una ventaja adicional de este enfoque fue la reducción de la respuesta a moléculas de analito no objetivo relacionados con las interacciones de superficie AUNP. Sin embargo, la reducción en la respuesta falso positivo era a expensas de la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto es necesario un equilibrio entre la protección de la superficie y la accesibilidad analito para mantener la función del análisis. Por otra parte, uno de los principales defectos de analizar los ensayos de color a través de medios distintos de la instrumentación es que los resultados son a menudo subjetiva y abierta a la interpretación del analista a analista, sobre todo cuando se trata de diferenciar diferencias sutiles en el color. Por el contrario, hay una serie de problemas con la fabricación de instrumentación de laboratorio basado utilizable fuera del laboratorio, tales como la disponibilidad de potencia, funcionalidad y portabilidad, etc. En este trabajo, un protocolo de análisis de color fue desarrollado para more portabilidad y para eliminar algunas de las conjeturas comúnmente asociada con la interpretación de ensayo basado en el color 20-21. En comparación con los enfoques anteriores, este esfuerzo se esforzó para empujar estos ensayos a sus límites para aplicaciones más allá de los ambientes de laboratorio.

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Protocol

1. Síntesis través de la reducción de Citrato de nanopartículas de oro (AuNP) y Caracterización

  1. Limpiar un matraz Erlenmeyer (500 ml) y una gran barra de agitación con 5 ml de ácido nítrico concentrado y 15 ml de ácido clorhídrico concentrado en una campana de seguridad química.
    1. Mojar toda la superficie del matraz con el lavado con ácido, enjuagar el matraz con agua libre de nucleasa, y dejar que el matraz se seque.
  2. Añadir 100 ml de cloruro de oro 1 mM (III); usar una hoja de papel de aluminio para cubrir la parte superior del ácido limpiado matraz Erlenmeyer y calor con agitación continua en una placa caliente hasta que hierva.
  3. Añadir 10 ml de citrato de sodio 38,8 mM. El color cambia de claro / gris, de color rojo oscuro azul / negro, y finalmente oscuro durante varios minutos. Continuar agitando con el calor fuera de 10 min.
  4. Dejar que la suspensión AuNP se enfríe a temperatura ambiente y añadir 110 l de pirocarbonato de dietilo (DEPC) con agitación continua.
  5. Cubrir todo el matraz conpapel de aluminio y deje que el tratamiento con DEPC a incubar durante la noche. Almacenar todos los AuNPs en la oscuridad, en recipientes de almacenamiento ámbar o cubierto con papel de aluminio.
  6. Autoclave la suspensión AuNP, enfriar a temperatura ambiente y se filtra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras de poro. Almacenar el, autoclave solución madre AuNP filtrada en la oscuridad a 4 ° C.
    NOTA: El tratamiento con DEPC, la esterilización mediante autoclave, y el almacenamiento a 4 ° C mejorará el tiempo de conservación del ensayo de aptámero-AuNP. Almacenamiento de esta manera permitirá que para el ensayo a permanecer en funcionamiento durante más de 2 meses.
  7. Calcular la concentración AuNP mediante la obtención de absorción ultravioleta-visible a 520 nm, y utilizar el coeficiente de extinción (Ɛ) 2,4 x 10 8 l mol -1 cm -1 con la Ley de Beer mediante el cálculo de la concentración (c). La concentración se determinó que era de 10 nm con un tamaño de 15 nm determinado por dispersión de luz dinámica.
    NOTA: Las concentraciones varían from lote a lote. Diluir las poblaciones AUNP con agua libre de nucleasa como sea necesario para mantener la suspensión de 10 nM AuNP deseado.

2.-DNA aptámero, Buffer, Solución, Y PREPARACIÓN

  1. Comprar o sintetizar secuencias de aptámeros utilizando la química estándar de la fosforamidita 22 de unión a la cocaína lo siguiente:
    MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT TCA CCT ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
    MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
  2. Purificar los aptámeros mediante desalado estándar 23. Reconstituir oligonucleótidos en agua libre de nucleasa a cualquiera de 100 micras o soluciones madre 1 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varios meses.
  3. Compra o preparar stocks de pH estéril 1 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 7,4, 100 mM de cloruro de magnesio (MgCl 2), y cloruro de sodio 1 M (NaCl).
  4. Preparar 50 ml de tampón de wi agua libre de nucleasath concentraciones de HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,4 y almacenar a temperatura ambiente durante meses.
  5. Incubar el ADN con la solución madre AuNP (10 nM) durante 3-4 horas a temperatura ambiente y protegido de la luz. Variar el volumen de AuNPs como se desee para proporcionar suficiente muestra para las pruebas a realizar (2,5-7,5 ml).
    1. En este caso, utilizar las densidades de carga de 90, 120, 150, y 180 moléculas de ADN / AuNP en este trabajo. Variar el volumen y la concentración de ADN en consecuencia. Sintonizar la cobertura de ADN para reducir la superficie relacionada respuestas de color AUNP no deseadas de analitos no objetivo.
      NOTA: El aumento de la cobertura de ADN reducirá la sensibilidad del ensayo. Las densidades de carga se calculan a partir de conocer la concentración de la población de AuNP, y calcular el número total de AuNPs presentes en el volumen deseado para su uso en experimentos. Si se desean las densidades reales de cobertura, existen protocolos para obtener esos valores 7. La cobertura de ADN se determinó mediante el uso de un 50 kDa mcolumna de corte giro peso MOLECULAR para separar el ADN AuNP unida de la ADN libre. Las AuNPs son demasiado grandes para pasar a través de la columna de centrifugación, mientras que el ADN libre pasará a través fácilmente. El siguiente paso es cuantificar el ADN libre recolectados a través de medidas de absorbancia o un solo colorante fluorescente de ADN de cadena.
  6. Añadir un volumen igual de HEPES 20 mM, 2 mM MgCl 2, pH 7,4 tampón y colocar la muestra a 4 ° C en la oscuridad durante la noche. El ensayo de aptámero-AuNP estaba en una HEPES 10 mM, 1 mM MgCl 2, pH 7,4 (tampón de ensayo).

3. La sal de titulación y preparación de las pruebas

  1. Determinar la concentración inicial de sal necesaria para inducir la respuesta de color de ensayo mediante titulación de sal con el blanco de ensayo. Añadir 20 l de metanol (en blanco) a 180 ml de alícuotas de ensayo de aptámero-AuNP en una placa de 96 pocillos. Valorar las muestras con el aumento de los volúmenes de existencias de solución de NaCl (1 M o 2 M) y determinar el punto de equivalencia (Figura 2 NOTA: El ensayo se puede escalar a volúmenes más pequeños, manteniendo la relación de metanol en blanco (o analito disuelto) para ensayo de aptámero-AuNP la misma.
    1. Aquí, determinar el volumen de NaCl necesaria para causar el cambio de color más mínimo por la observación visual. La concentración de partida para el ensayo fue de 75 mM y 130 mM para MN4 y MN6, respectivamente, a un / AuNP densidad cobertura 60 molécula de ADN.
      NOTA: Para una determinación cuantitativa de la concentración inicial de sal, el punto medio de la curva de valoración sirve como un buen punto de partida. Además, las concentraciones utilizadas varían en función de la aptámero, las densidades de cobertura de ADN, desde el rendimiento del día a día, y el lote a lote.
  2. Optimización de la respuesta del ensayo, se añaden 20 l de moléculas de analito diluidas en metanol a 180 ml de alícuotas de ensayo de aptámero-AuNP en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente. Inmediatamente añadir la concentración de NaCl determinado en la etapa anterior para iniciar la respuesta de color del ensayo.
    NOTE: Utilizar una pipeta multicanal para realizar múltiples experimentos de forma simultánea.
  3. Obtengan el mayor cambio de color posible aumentando o disminuyendo la concentración de NaCl, y la comparación de la respuesta objetivo a la respuesta en blanco. Usar la concentración de NaCl que proporciona la mayor diferencia de la respuesta.
  4. Observar o medir la respuesta del ensayo seg 150 después de la adición de NaCl. Analizar la absorbancia a 650 nm y 530 nm utilizando un espectrómetro u obtener una foto de cámara digital de la respuesta del ensayo (véase la sección 4 para el protocolo de análisis de la foto).
    NOTA: Se utilizó un lector de microplacas para la obtención de las mediciones para este trabajo.
  5. Representar gráficamente los resultados como la relación de la absorbancia obtenida a 650 nm y 530 nm (E 650 / E 530) como una función de la concentración de analito. Normalizar la respuesta del ensayo a la señal en blanco como se hizo en este trabajo.

4. Fotográfico y Digital Image Protocolo de Análisis Análisis del color

  1. Prepare las muestras de ensayo como se describe (secciones 3.2-3.3). Coloque la placa de 96 pocillos en un transiluminador.
    NOTA: Una transiluminador estándar de laboratorio suele ser demasiado brillante para obtener imágenes digitales se pueden utilizar para este análisis. Estos transiluminadores causan regularmente espaciadas "líneas oscuras" para aparecer en la imagen digital debido a la intensidad de la fuente luminosa. Hacer un transiluminador de un diodo emisor de luz (LED) de la caja ligera con base y un trozo de plástico opaco funciona bien.
  2. Obtener fotos de la placa de 96 pocillos a 150 seg después de la adición de NaCl, importar las imágenes en el software de análisis de imagen, y calcular los valores de rojo, verde y azul promedio (RGB), utilizando una técnica de promediado incrementales, tal como se muestra en la ecuación 1 24:
    (1) Ecuación 1
  3. Convertir los valores RGB de (sRGB) espacio de color RGB estándar para el espacio de color diagrama de cromaticidad (CIExyY), utilizando las siguientes ecuaciones 24:
    (2) Ecuación 2
    (3) Ecuación 3
    (4) Ecuación 4
  4. Convertir los valores RGB exponenciales a valores RGB lineales usando la ecuación 2. La matriz especificado en la ecuación 3 se utiliza para calcular la X, Y y Z de los valores de espacio de color CIE 24.
  5. Calcular los valores de x e y de cromaticidad usando la ecuación 4 que representa el color promedio de los pixeles en las zonas seleccionadas para el análisis 24.
  6. Realizar el análisis de cada bien y representar gráficamente los valores de cromaticidad para generar una curva de calibración (Figura 4). Obtener el error estándar al analizar el color de las diferentes áreas de la misma también.

5. Congelación de aptámeros-AuNP Ensayo para el almacenamiento a largo plazo

  1. Preparar los componentes del ensayo aptamer AuNP como se describe en las secciones 2.4 y 2.5. Hacer soluciones separadas que contienen 1 g / ml de trehalosa y 1 g / ml de sacarosa en agua libre de nucleasa para hacer la solución Cryogen.
    NOTA: Las altas concentraciones de trehalosa y sacarosa se utiliza para reducir el factor de dilución cuando se prepara el ensayo para la congelación. Calentar las soluciones de azúcar en una placa caliente en un vaso de precipitados de agua para disolver completamente los azúcares antes de su uso.
  2. Hacer una solución que contiene 19,2 mg / ml de trehalosa y 4,8 mg / ml de sacarosa con el ensayo 60 MN4-DNA / AuNP en un volumen final de 200 l en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Las concentraciones finales de la solución de criógeno variarán con la cobertura de ADN.
    Nota: Las muestras que han de congelarse no debe superar los 300 l. Los volúmenes más grandes no pueden congelarse adecuadamente.
  3. Flash congelar las muestras usando un congelador C -146 ° o en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras congeladas hasta su uso. El almacenamiento puede ser en un -80 ° C o -20 ° C una vez que parpadeará congelación es completa.
  4. Para este trabajo, dejar las muestras en el congelador a -146 ° másnoche y luego se transfieren a un congelador C -20 ° para el almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: la congelación de Flash puede hacer que el aptámero-AuNPs a agregarse. Prueba de la integridad del proceso de congelación mediante la supervisión del perfil de absorbancia y comparándolo con una muestra no congelada. Si se observa la agregación, aumentar la cantidad de solución de criógeno para compensar este problema.
  5. Descongelar las muestras a temperatura ambiente y utilizar sólo suficientes muestras como sea necesario para la experimentación. Obtener espectros de absorbancia de las muestras descongeladas y compare con los espectros de línea de base de una muestra tratada solución no congelada criogénico. Medir la absorbancia de 400 nm a 700 nm.
  6. Realizar la valoración de sal (sección 3.1), probar el ensayo (sección 3.2), y trazar los resultados (secciones 3.3 y 3.4) como se ha descrito anteriormente.

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Representative Results

El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar e investigar la estabilidad y robustez del aptámero AUNP ensayos colorimétricos basados ​​para su uso en el campo. Como se ha destacado en una publicación anterior, dos estrategias distintas para crear el ensayo fueron investigados 7. Los ensayos se denominan el aptámero de ensayo libre y el ensayo de aptámeros adsorbido. El aptámero de ensayo adsorbida fue más atractivo para los fines de un ensayo de detección fieldable (Figura 1).

Figura 1
. Figura 1. Representación esquemática del ensayo aptámero adsorbida El aptámero se mezcló con AuNPs y incubó durante la noche; moléculas de analito se disolvió en metanol se añadieron a la Ensayo aptámero absorbida, seguido inmediatamente por la adición de cloruro de sodio (NaCl) para inducir la agregación AuNP cuando se añadió el objetivo.ef = objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esto se debió a la reducción en las tasas de falsos positivos a analitos no diana, relativa simplicidad y facilidad de uso del ensayo de aptámeros adsorbido. Para preparar el ensayo de aptámero adsorbida, el ADN-aptámero se mezcló con AuNPs y se incubó durante la noche en el tampón de ensayo. Esto permitió que el aptámero para adsorber fácilmente en la superficie AuNP, que reduce la susceptibilidad del ensayo para respuestas positivas falsas a moléculas de analito no diana tales como el enmascaramiento o agentes de corte. Sin embargo, sólo la estructura preformada del aptámero MN4 cocaína era activo en la presencia de cocaína (objetivo) en este diseño de ensayo. El ensayo se emplea mediante la adición de soluciones de analito seguido de la adición inmediata de la concentración apropiada de NaCl. Se utilizaron soluciones salinas para iniciar la observable y meacambio de color surable del ensayo. El ensayo se ejecuta dentro de 2-3 min. después de la adición de la solución de analito.

Una acción crítica en la ejecución de estos ensayos colorimétricos basados ​​en el ADN físicamente adsorbidas es la respuesta de color inducido, a través de la adición de la concentración apropiada de sal. La adición de sales son conocidos por desestabilizar suspensiones AUNP resultantes en la agregación de las partículas mediante el enmascaramiento de las cargas negativas de la capa de citrato que estabilizan la AuNPs, y luego disminuye las interacciones electrostáticas entre partículas. El resultado es el cambio de color observable de rojo a azul. El mismo efecto se observa con ADN tratado con AuNPs. En el caso de DNA aptámeros, analista de determinar la concentración de sal necesaria para causar un mínimo de desestabilización AuNP observable (coloración azul). Con la adición de objetivo, la estabilización de los AuNPs por el ADN-aptámero se reduce significativamente dando como resultado un OBSErvable, dosis diana cambio de color respuesta medible. Este cambio de color sólo puede ser percibida con la adición de la cantidad predeterminada apropiada de sal.

Igualmente importante es el proceso en el que se determinó la concentración apropiada de sal. Esto se logró mediante la realización de una curva de titulación mediante la adición de concentraciones crecientes de solución de cloruro sódico a una serie de piezas en bruto de ensayo (Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Curva de titulación inducida por la sal. Estabilizadas con citrato (rojo), MN4 cocaína unión de aptámeros (verde), y la unión de aptámeros (púrpura) tratados muestras AUNP MN6 cocaína se titularon con cloruro de sodio (NaCl). Las concentraciones iniciales de sal obtenidos visualmente se indican con flechas de color correspondiente para cada curva. Las barras de error se definen por la desviación estándar entriplicados mediciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, la concentración inicial de sal usada se determinó mediante inspección visual, y se tomó como la concentración de sal que causó la coloración azul más mínimo observable con el blanco de ensayo. Sin embargo, para un enfoque más cuantitativo, investigadores nuevos en esta área de investigación puede utilizar el punto medio del punto de equivalencia de titulación como una concentración de sal de partida. Más allá de este punto la respuesta de color comienza a aumentar rápidamente. Además, la concentración de sal utilizado en la ejecución del ensayo se ajustó para maximizar la diferencia de color entre las respuestas de ensayo en blanco y la cocaína. Esto se logró mediante el aumento y la disminución de la concentración de sal a partir de la cantidad determinada por titulación. El procedimiento de titulación de sal se realizó diariamente aen cuenta la variabilidad día a día con el ensayo. La variabilidad lote en la concentración de sal necesaria para el ensayo no era más que 20%. La Figura 2 tiene tres muestras AUNP distintas, citrato estabilizado (sin ADN), MN4 (DNA-aptámero estabilizado), y MN6 (DNA-aptámero estabilizado). La cobertura de ADN para las muestras MN4 y MN6 eran de 60 moléculas de ADN / AuNP, y cada curva de titulación tiene un punto de titulación equivalencia diferente y el punto medio basado en el nivel de estabilidad proporcionada por el tratamiento de superficie. Citrato proporcionó poca estabilidad, MN4 (doble cadena como estructura) proporcionado una mayor estabilidad y MN6 (de cadena sencilla como la estructura) proporciona la mayor estabilidad de las AuNPs. Las concentraciones iniciales de sal utilizados en este trabajo fueron determinadas de estar ~ 50 mM, ~ 90 mM y 130 mM ~ visualmente. La tendencia está de acuerdo con la comprensión convencional de la estructura del ADN y su efecto estabilizador sobre AuNPs 24-25. Al realizar esta prueba visual, el blanco de ensayo mostró una ligera colora azul ción con las concentraciones de sal según se identifican en la Figura 2 con las flechas, que están cerca de los puntos medios como se ha discutido. Las concentraciones de sal antes de puntos tesis proporcionan poco o ningún cambio de color observable, y más allá de estos puntos el color aumenta rápidamente. Para este trabajo, se determinó visualmente la concentración inicial de sal y luego sintoniza la medición utilizando comparaciones lector de microplacas de muestras en blanco y cocaína ensayo.

Con el enfoque de aptámeros de ensayo libre, las respuestas positivas falsas eran un problema. Interacciones superficiales de moléculas de las sustancias analizadas son una fuente para este problema, tal como se describe en una publicación anterior 7. Para evitar las respuestas de color no intencionales debido a inespecíficos interacciones superficiales AuNP, las densidades de cobertura de ADN del aptámero de unión a diana se controló (figura 3).

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Figura 3. aptámero adsorbida respuesta del ensayo con densidad variable cobertura de ADN. Respuesta de agregación a la cocaína (rojo, blanco), EME (verde, control), y procaína (azul), una molécula de superficie activa AuNP, para el 90, 120, 150, y se visualizan 180 densidades de cobertura de ADN / AUNP. Todas las muestras analizadas se disolvieron en metanol a 1 mg / ml. Las barras de error se definen por la desviación estándar de las mediciones por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En general, la tasa de respuesta de falso positivo de moléculas de analito no objetivo debido a las interacciones AUNP se redujo con el aumento de las densidades de cobertura de ADN. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo se redujo como consecuencia de una mayor cobertura de ADN. En este trabajo, las densidades de ADN de 60, 90, 120, 150, 180 y 300 AuNP ADN fueron Investiga /ted. Las densidades de 60 y 300 se describen con detalle en trabajos anteriores 7. La figura 3 representa las densidades de ADN adicionales estudiados. Procaína fue uno de los analitos que no son objeto de superficie activa más altamente encuestados. Para cada una de las coberturas de ADN individuales, la respuesta ensayo se maximiza mediante el ajuste de la concentración de sal como se describe. En general a medida que aumenta la cobertura de ADN, la diferencia de respuesta entre el control (EME) y la respuesta de la cocaína disminuye. Del mismo modo, la respuesta de ensayo en presencia de procaína disminuye a niveles de fondo con el aumento de coberturas. La superficie 180 DNA / densidad AuNP eliminado relacionado respuesta positiva falsa de procaína, al tiempo que conserva una respuesta objetivo de alto. Esta evaluación se describe un procedimiento para el ajuste de estos ensayos de color para la reducción de respuestas positivas falsas relacionadas con la superficie, preservando al mismo tiempo de respuesta del objetivo tanto como sea posible. sensibilidades mejoradas se pueden lograr a través de la reducción de la cobertura de ADN. Sin embargo, la falsa posicióntivas respuestas podrían llegar a ser un problema dependiendo de la aplicación.

ensayos colorimétricos se utilizan comúnmente para pruebas rápidas y sencillas a menudo presuntivos cualitativos y cuantitativos incluso. Problemas comunes con las determinaciones colorimétricas son la naturaleza subjetiva del discernimiento de color, en particular con sutiles diferencias de color y borderline. Las llamadas de juicio que deben efectuarse por el analista puede dar lugar a una interpretación errónea de los datos. Las mediciones en equipos de laboratorio reducir la incertidumbre y la indecisión asociado con la evaluación de los resultados del ensayo. Sin embargo, en este trabajo, la intención era proporcionar un ensayo listos campo que proporciona resultados inmediatos para el analista. Como tal, una técnica de análisis de imágenes foto se estableció que proporcionó un resultado de color más decisivo (Figura 4).

Figura 4
Figura 4. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con el aumento de las concentraciones de cocaína, el color de ensayo dio lugar a un color azul creciente. Las fotografías digitales de las curvas de calibración se obtuvieron utilizando dos teléfonos inteligentes diferentes, y se importan a un ordenador portátil estándar para el análisis utilizando el software ImageJ. Los valores de cromaticidad se utilizaron para trazar la cALIBRACIÓN curvas como se muestra en la Figura 4. El análisis de imagen proporciona una respuesta lineal al aumentar la concentración de cocaína con ambos conjuntos de imágenes de teléfonos inteligentes como lo indican los valores de R 2. Este método fue la transición a una aplicación de Smart-dispositivo para ayudar al analista en el campo. Una evaluación detallada de la aplicación se llevó a cabo en una publicación anterior 7. La aplicación elimina gran parte de la incertidumbre y la indecisión asociado con resultados de cambio de color sutiles de las concentraciones más bajas de cocaína.

El almacenamiento a largo plazo de los análisis de ADN físicamente adsorbidos de este tipo no se han estudiado con gran detalle y uno de los objetivos de este trabajo fue encontrar las condiciones para extender la vida útil de ensayo. El tratamiento de los componentes del ensayo de almacenamiento a 4 ° C se detalla en una publicación anterior 6. Para este trabajo, la liofilización de los componentes del ensayo se consideró preparados para su uso a largo plazo y el almacenamiento of el ensayo. La liofilización de los componentes del ensayo tiene la ventaja de mantener y almacenar las muestras a temperatura ambiente, lo que eliminaría la necesidad de un refrigerador o congelador. El primer paso en el proceso de liofilización es congelar primero la muestra. Para comprobar las muestras AUNP sobreviven al proceso de congelación, lleve a cabo una comparación de los espectros de absorbancia del ensayo antes de la congelación a la de la muestra descongelada. Las exploraciones deben coincidir exactamente. Si las muestras no sobreviven al proceso de congelación, el espectro de la muestra descongelada se habrá incrementado absorbancia en la región por encima de 525 nm. Esto indica que los AuNPs agregados durante la congelación y la muestra descongelada se vea comprometida. La viabilidad del ensayo descongelado fue probado con la cocaína y la EME (Figura 5).

Figura 5
Figura 5. Ensayo de aptámeros adsorbido estudio de respuesta a la vida útil. Quantificación de la respuesta del ensayo a EME (verde, control), y la cocaína (rojo, blanco) realiza con congelada y luego descongelada absorbidos muestras aptámero de ensayo durante un período de cuatro semanas. Las barras de error se definen por la desviación estándar de las mediciones por triplicado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las muestras de ensayo en blanco descongelado se mantuvieron en el mismo valor durante el período de estudio como muestras que se hicieron y se usó inmediatamente (sin almacenamiento). Las respuestas de las muestras de cocaína y EME fueron consistentes con las respuestas típicas observadas con muestras hechas y usadas inmediatamente (sin almacenamiento). Las muestras congeladas fueron controlados durante el período de 4 semanas sin ningún cambio en el rendimiento del ensayo en comparación con las muestras almacenadas a 4 ° C durante el mismo período de tiempo o 7 para las muestras de ensayo realizarse y utilizarse immediately. Respuestas de cocaína fueron relativamente constantes durante el período de 4 semanas, que también se observó para los 4 ° C 7 muestras. La disminución de la señal de EME de semana 1 semana a 2 se observa a menudo con la temperatura ambiente y de almacenamiento de 4 ° C también. Un fenómeno que atribuye a la maduración del ensayo durante la primera semana. Este enfoque aumenta las opciones disponibles para el almacenamiento a largo plazo de los ensayos colorimétricos adsorbidos de ADN, y proporcionó una puerta de acceso a las opciones de almacenamiento a largo plazo adicionales, a saber, la liofilización.

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Discussion

Durante la última década, ensayos colorimétricos basados ​​en nanopartículas se han desarrollado para la detección de blancos incluyen pequeñas moléculas, ADN, proteínas y células de 2-4. Los ensayos que utilizan DNA aptámeros con nanopartículas han ido ganando interés. Típicamente, estos ensayos colorimétricos se llevan a cabo mezclando el ADN de aptámero con moléculas de analito seguido de la adición a AuNPs 9-10. Sin embargo, estos ensayos se han utilizado en las manifestaciones de prueba de concepto con la configuración de laboratorio controladas y limitadas, con controles seleccionados. Los recientes avances de la transición de esta tecnología en el campo se han hecho 7. En este enfoque, el ADN-aptámero se adsorbió a AuNP superficies antes de la adición de las moléculas de analito a ensayar (Figura 1). El desarrollo de ensayos colorimétricos basados ​​en nanopartículas o bien aptámero-oro requiere la optimización en las diversas etapas del proceso de fabricación / análisis. De este modo, los nuevos en el discoipline debe ser consciente de los matices asociados a la refinación y la solución de estos ensayos para tener éxito.

Los ensayos de nanopartículas de oro aptámero-adsorbidos requieren optimización cuidadosa para cada par de aptámeros / diana. Sin embargo, siguiendo los pasos que se explican aquí ofrece un protocolo consistente para llevar a cabo la optimización de estos ensayos colorimétricos. La determinación y ajuste de la concentración de sal que da como resultado el máximo cambio de color observable o medible entre el objetivo y el ensayo en blanco es uno de los pasos de optimización más críticos (Figuras 2 y 3). Para algunos pares de aptámero / objetivo, hemos observado que el uso de altas concentraciones de sal cerca del punto final de la curva de titulación se han traducido en un cambio de color azul-rojo-a 18. Esto indica una estabilización de los AuNPs por el aptámero después de la adición de la diana y la sal.

Otros factores que pueden influir en los PE de ensayorformance incluir componentes del tampón y la concentración, la cantidad de cobertura de ADN-aptámero, disolventes usados, la temperatura, la secuencia de aptámero y la estructura, el tiempo de incubación objetivo-ensayo (tiempo cuando se añade objetivo para el ensayo, antes de la adición de sal), y el tiempo de desarrollo de color ( tiempo necesario para que se desarrolle el color, después de la adición de sal). Un HEPES 10 mM, MgCl2 1 mM pH 7,4, que era el tampón de ensayo de elección en muchos de los pares de destino / aptámeros utilizados en nuestro trabajo. Sin embargo, este tampón puede no ser ideal para todos los aptámeros. Para obtener el plegamiento apropiado del aptámero, los componentes de tampón de ensayo pueden necesitar ser medida, y se mantiene lo más cerca posible a la composición utilizada en el buffer de selección de aptámeros. Cuando se utiliza un tampón con AuNPs, los componentes del tampón y concentraciones deben tenerse en cuenta, en particular con sustancias iónicas. Las altas concentraciones de compuestos iónicos podrían causar agregación prematura de las AuNPs. La cobertura de ADN / AuNP se demostró en la Figura 3. Como el DNAde cobertura se incrementa de ADN 90-180 / AuNP, la respuesta analito diana disminuyeron causando la sensibilidad del ensayo reducida. Por lo tanto, se necesita un equilibrio que depende de cada aptámero, debido a su plegamiento y el grado de las interacciones con la superficie AuNP particular.

Además, los disolventes necesarios para disolver moléculas de analito pueden dar lugar a la agregación no deseada de los AuNPs. Agua, tampón de ensayo, y el metanol se han utilizado sin problema. Si se utiliza sin dilución, acetonitrilo y dimetilsulfóxido (DMSO) se adsorbe a la superficie AuNP causando agregación no deseada. El acetonitrilo era problemático incluso a diluciones de menos de 1% (volumen final). Los disolventes deben ser probados con AuNPs antes de su uso con el ensayo colorimétrico. La temperatura a la que se lleva a cabo el ensayo puede tener un impacto en si se observa una respuesta con el ensayo. Esto tiene más que ver con la estructura de aptámeros y la temperatura de fusión, o la estabilidad de la estructura de aptámero a una temperatura dada, quecon las nanopartículas. En nuestro trabajo, hemos determinado que hay un delicado equilibrio entre tener el aptámero en una estructura preformada con el ADN en una forma plegada, y tampoco por completo en una sola estructura de cadena. Este es el caso de la forma de ensayo adsorbida aptámero de estos ensayos colorimétricos (Figura 1). Al considerar la estructura, la secuencia de aptámero también debe contemplarse porque gran parte de la estructura aptamer es el resultado de las secuencias de oligonucleótidos individuales. Sin embargo, se necesita más investigación sobre este aspecto.

En general, el enfoque se utiliza en el desarrollo de un ensayo colorimétrico basado aptámero-AuNP es el mismo para todos los pares de aptámero / diana. En primer lugar, obtener un aptámero para una diana de interés. Esto se puede lograr a través de la búsqueda de la literatura o la selección de un aptámero para una molécula de interés. En esta etapa, no hay forma de saber si el aptámero es un buen candidato para la creación de una colorimétricoensayo. Esto sólo se puede determinar a través de la experimentación. A continuación, se incuba el aptámero con AuNPs durante la noche para fabricar el ensayo aptámero adsorbida (Figura 1). El enfoque estándar es comenzar a probar con 60 aptámeros / AUNP; sin embargo, múltiples coberturas están preparados para la siguiente etapa de la prueba. Cuando los ensayos están listas para la prueba, realizar las investigaciones curva de valoración como se describe (Figura 2). El punto medio de la curva de valoración sirve como una concentración fiable a partir de la sal que se utilizará para el objetivo, blanco de ensayo, y las pruebas de control. La concentración de sal se puso a punto para proporcionar una máxima diferencia de color entre las muestras en blanco de destino y de ensayo. Para probar la respuesta es real y es causado por la unión de aptámeros-objetivo y no objetivo, debido a las interacciones de disolvente / no específicos, realizar el ensayo con los controles. Al mismo tiempo, los tiempos de desarrollo de color de ensayo se investigan a intervalos de 5 min. Seguido de los tiempos de incubación meta-ensayo a los 5 min intervals, se utilizan inicialmente 15+ veces min de incubación hasta que se optimiza este paso. Dependiendo de los resultados, una mayor optimización de la concentración de sal, la cobertura de aptámero, tiempo de incubación y el tiempo de desarrollo del color puede ser necesario (Figura 3). Este enfoque se describe un protocolo para el diseño y desarrollo de ensayos colorimétricos aptámero-AUNP para un par de blancos / aptámero. Investigaciones adicionales sobre la secuencia de aptámero y los efectos estructurales en la mejora de ensayos colorimétricos aptámeros adsorbidos son de gran interés. Hay una necesidad de entender las interacciones asociadas con el aptámero, Target y AuNPs. Este conocimiento podría conducir a la adaptación de los aptámeros para una mejor funcionalidad e incluso predecir el cual aptámeros estarán activos en el formato de ensayo adsorbido aptámero.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

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References

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