Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de um ensaio colorimétrico de nanopartículas de ouro-aptâmero para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. Além disso, uma aplicação colorimétrico-dispositivo inteligente (APP) foi validado e armazenamento a longo prazo do ensaio foi estabelecido para utilização no campo.

Abstract

Examinou-se a concepção e desenvolvimento de uma nanopartícula aptâmero-ouro (AUNP) ensaio colorimétrico para a detecção de moléculas pequenas para aplicações in-the-campo. ensaios de cor com base alvo seletivo AUNP foram desenvolvidos em laboratório de prova de conceito controladas. No entanto, estes sistemas não têm sido exercida a um ponto de falha para determinar a sua utilização prática para além de configurações de laboratório. Este trabalho descreve uma abordagem genérica para projetar, desenvolver e solucionar problemas de um ensaio colorimétrico aptâmero-AUNP para pequenos analitos moléculas e utilizando o ensaio para as configurações in-the-campo. O ensaio é vantajosa porque aptâmeros adsorvidas passivar as superfícies de nanopartículas e fornecer um meio para reduzir e eliminar respostas falsas positivas para analitos não-alvo. A transição para este sistema usos práticos necessário definir não só o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP, mas que fixa os métodos e procedimentos que se estende para o capabil armazenamento a longo prazodades. Além disso, uma das preocupações reconhecidos com leitura colorimétrica é a sobrecarga dos analistas para identificar com precisão as mudanças muitas vezes sutis na cor. Para diminuir a responsabilidade sobre analistas no campo, um protocolo de análise de cor foi projetado para desempenhar as funções de identificação de cores sem a necessidade de executar esta tarefa em equipamentos de laboratório grau. O método para criar e testar o protocolo de análise de dados é descrita. No entanto, para compreender e influenciar a concepção de ensaios de aptâmeros adsorvidas, as interacções associadas com o aptâmero, alvo, e AuNPs requerem um estudo mais aprofundado. O conhecimento adquirido pode levar a alfaiataria aptâmeros para melhorar a funcionalidade.

Introduction

Colorimetria é uma das técnicas mais antigas utilizados em química analítica. Para esta técnica, uma determinação qualitativa ou quantitativa do analito é feita com base na produção de um composto colorido 1. Tipicamente, os ensaios de cor utilizam reagentes que experimentam uma mudança de cor na presença de espécies de analito, o que resulta numa mudança de cor observável ou detectável no espectro de luz visível. Colorimetria foi usado na detecção de alvos que variam a partir de átomos, iões e moléculas pequenas a moléculas biológicas complexas tais como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos, proteínas e 2-4. Para as duas últimas décadas, os nanomateriais revolucionaram o campo de ensaios de detecção, em particular com ensaios baseados cor 5-6. Combinando as propriedades químicas e físicas únicas dos nanomateriais com um elemento de reconhecimento selectivo alvo, tais como anticorpos, aptâmeros oligonucleótido ou aptâmeros de péptidos, tem levado ao ressurgimento in o design e desenvolvimento de ensaios de detecção colorimétricos 7.

nanoparticulas metálicas possuem uma propriedade de mudança de cor dependente do tamanho demonstrado, que tem sido explorado na concepção de numerosos ensaios colorimétricos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são de particular interesse devido a uma mudança de cor vermelho-para-azul distinta, quando a solução dispersa de partículas é induzida a agregar 8, tipicamente através da adição precisa de sal. A capacidade para controlar a transição da disperso (vermelho) ao (azul) estados agregados levou à criação de sensores colorimétricos para iónico, pequena molecular, péptido, proteína, e alvos celulares 2-4,9. Muitos destes sensores empregar aptâmeros como o motivo de reconhecimento do alvo.

Os aptâmeros são ADN ou moléculas de ácido ribonucleico (ARN) seleccionado a partir de um conjunto aleatório de 10 12 -10 15 sequências diferentes 10-11. O processo de seleção identifica alvo reelementos de cognição com afinidades de ligação no regime de baixa nanomolar, ea evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o processo mais comumente conhecido 12-13. Vantagens de aptâmeros com base de oligonucleótidos para aplicações de detecção incluem a facilidade de síntese, modificação química controlável, e a estabilidade química 14-15.

Uma abordagem para a criação de um ensaio colorimétrico combina nanomateriais com elementos de reconhecimento, consiste em combinar estas duas espécies através da adsorção física de moléculas de ADN-aptâmero para superfícies AUNP. Através de ligação ao alvo-aptâmero, o aptâmero experimenta uma mudança estrutural 16-18 que altera a interacção do aptâmero com a superfície de AUNP, o que leva a uma resposta de vermelho para azul indutível cor 19 com a adição de sal. Esta característica surpreendente de AuNPs fornece um mecanismo de resposta colorimétrica observáveis ​​para os dispositivos baseados em aptâmeros que podem ser utilizados para deassinar ensaios colorimétricos para diferentes analitos.

ensaios de cor projetada usando não covalentes, aptâmeros de ADN fisicamente adsorvido em superfícies AUNP tem o estigma de ser uma plataforma de sensor fraco devido a problemas com a robustez, uma propensão para o fracasso fora do ambiente controladas de laboratório, bem como a falta de informação disponível para uso em prática configurações. No entanto, o ensaio colorimétrico baseado aptâmero-AUNP era de interesse por causa da simplicidade de funcionamento e resposta de cor observável. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a concepção, desenvolvimento, operação, redução da superfície relacionada resposta falso positivo, e armazenamento de longo prazo de DNA-AUNP ensaios colorimétricos baseados usando a cocaína como substância a analisar representativa. Além disso, propusemos este adsorvida aptâmero abordagem de ensaio (Figura 1) como sendo vantajosa devido à simplicidade e facilidade de uso que resultou em menos etapas do que a abordagem convencional para estes aptâmero-AUNP assays. Para este ensaio, o aptâmero foi adicionado em primeiro lugar para as AuNPs, que foram deixadas para adsorver à superfície por um período de tempo prolongado. Uma vantagem adicional desta abordagem foi a redução de resposta a moléculas de analito não alvo relacionados com interacções de superfície AUNP. No entanto, a redução da resposta falso positivo foi em detrimento da sensibilidade do ensaio. Portanto um equilíbrio entre a proteção da superfície e acessibilidade analito é necessário para manter a função adequado do ensaio. Além disso, um grande defeito de analisar ensaios de cores através de outros meios que não com a instrumentação é que os resultados são muitas vezes subjetivo e aberto à interpretação do analista-to-analista, particularmente quando se tenta diferenciar diferenças sutis de cor. Por outro lado, há uma série de problemas com tornando instrumentação laboratorial utilizável fora do laboratório, tais como disponibilidade de energia, praticidade com portabilidade, etc. Neste trabalho, um protocolo de análise de cor foi desenvolvido para more portabilidade e para eliminar algumas das conjecturas comumente associado com a interpretação ensaio baseado cor 20-21. Em comparação com abordagens anteriores, esse esforço se esforçado para empurrar estes ensaios para os seus limites para aplicações além de configurações de laboratório.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Síntese via Citrato de Redução de Nanopartículas de Ouro (AUNP) e Caracterização

  1. Limpar um balão de Erlenmeyer (500 ml) e grande barra de agitação com 5 ml de ácido nítrico concentrado e 15 ml de ácido clorídrico concentrado na capa de segurança química.
    1. Molhar toda a superfície do balão com a lavagem com ácido, lavar o recipiente com água livre de nuclease, e permitir que o balão para secar.
  2. Adiciona-se 100 ml de cloreto de ouro 1 mM (III); usar uma folha de papel de alumínio para cobrir a parte superior do ácido limpo Erlenmeyer e calor, com agitação contínua numa placa quente até a ebulição.
  3. Adicionar 10 ml de citrato de sódio 38,8 mM. A cor muda de claro / cinza, vermelho para azul / preto, e, finalmente, escuro escuro durante vários minutos. Continuar a agitação com o calor fora durante 10 min.
  4. Permitir que a suspensão AUNP arrefecer até à temperatura ambiente e adicionar 110 ul de dietilpirocarbonato (DEPC) com agitação contínua.
  5. Cobrir todo o balão comfolha de alumínio e permitir que o tratamento com DEPC a incubar durante a noite. Armazenar todos os AuNPs no escuro, em recipientes de armazenamento de âmbar ou coberto com folha de alumínio.
  6. Autoclave a suspensão AUNP, arrefecer à temperatura ambiente e filtrar através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um poro. Armazenar a solução estoque filtrados autoclavado AUNP no escuro a 4 ° C.
    NOTA: O tratamento com DEPC, esterilização por meio de autoclave, e armazenagem a 4 ° C irá melhorar o prazo de validade do ensaio aptâmero-AUNP. Armazenamento desta maneira vai permitir que para o ensaio de permanecer funcionais durante mais de 2 meses.
  7. Calcula-se a concentração por AUNP obtenção de absorção ultravioleta-visível a 520 nm, e utilizar o coeficiente de extinção (ɛ) 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 com a Lei de Beer, calculando a concentração (C). A concentração foi determinada como sendo 10 nM com um tamanho de 15 nm, determinado por dispersão de luz dinâmica.
    NOTA: As concentrações variam from de lote-para-lote. Diluir os stocks AUNP com água livre de nuclease como necessário para manter a 10 nM AUNP suspensão desejado.

2. DNA-aptâmero, Tampão, Solução, e Ensaio Preparação

  1. Comprar ou sintetizar o seguinte cocaína ligação sequências de aptâmeros usando química fosforamidite padrão 22:
    MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
    MN6 19: 5'- GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
  2. Purificar os aptâmeros usando dessalinização padrão 23. Reconstituir oligonucleótidos em água isenta de nuclease em ambos os 100 pM ou soluções de estoque 1 mM. Alíquotas e armazenar a -20 ° C durante vários meses.
  3. Aquisição ou preparar stocks de 1 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), pH estéril 7,4, cloreto de magnésio 100 mM (MgCl 2), e 1 M de cloreto de sódio (NaCl).
  4. Prepare 50 ml de tampão em wi água livre de nucleaseth concentrações de 20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, pH 7,4 e armazenar a temperatura ambiente durante meses.
  5. Incubar o ADN com a solução estoque AUNP (10 nM) durante 3-4 horas à temperatura ambiente e de proteger contra a luz. Variar o volume de AuNPs conforme desejado para fornecer amostra suficiente para os testes a serem realizados (2,5-7,5 ml).
    1. Aqui, utilizar densidades de carga de 90, 120, 150, e 180 moléculas de ADN / AUNP neste trabalho. Variar o volume e as concentrações de DNA de acordo. Sintonize a cobertura DNA para reduzir AUNP respostas cor relacionada superfície não intencionais de analitos não-alvo.
      NOTA: O aumento da cobertura de ADN vai reduzir a sensibilidade do ensaio. As densidades de carga são calculados a partir sabendo a concentração do estoque AUNP, e o cálculo do número total de AuNPs presentes no volume desejado para o uso em experimentos. Se as densidades reais de cobertura são desejáveis, existem protocolos para obter esses valores 7. A cobertura de ADN foi determinada utilizando um 50 kDa mpeso olecular coluna de corte de rotação para separar o DNA AUNP vinculados a partir do DNA livre. Os AuNPs são demasiado grandes para passar através da coluna de centrifugação, enquanto que o ADN livre irá passar através facilmente. O próximo passo é quantificar o DNA livre coletados por meio de medidas de absorbância ou um único corante de ADN fluorescente ociosos.
  6. Adicionar um volume igual de 20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, pH 7,4 e colocar a amostra a 4 ° C no escuro durante a noite. O ensaio foi aptâmero-AUNP em um tampão HEPES 10 mM, MgCl 2 1 mM, pH 7,4 (tampão de ensaio).

3. Sal Titulação e Setup Assay

  1. Determinar a concentração de sal inicial necessário para induzir a resposta de cor de ensaio por titulação sal com o ensaio em branco. Adicionar 20 ul de metanol (em branco) em 180 mL alíquotas de ensaio aptâmero-AUNP em uma placa de 96 poços. Titular as amostras com volumes crescentes de estoque solução de NaCl (1 M ou 2 M) e determinar o ponto de equivalência (Figura 2 NOTA: O ensaio pode ser dimensionada para volumes mais pequenos, mantendo a proporção de metanol em branco (ou dissolvido analito) para ensaio de aptâmero-AUNP o mesmo.
    1. Aqui, determinar o volume de NaCl necessária para causar a menor mudança de cor por observação visual. A concentração de partida para o ensaio foi de 75 mM e 130 mM durante MN4 e MN6, respectivamente, a uma molécula de ADN de 60 / AUNP densidade cobertura.
      NOTA: Para uma determinação quantitativa da concentração de sal inicial, o ponto médio da curva de titulação serve como um bom ponto de partida. Além disso, as concentrações utilizadas vão variar de acordo com o aptâmero, densidades de cobertura de ADN, a partir de o desempenho do dia-a-dia, e de lote-para-lote.
  2. Optimizar a resposta do ensaio, adicionar 20 ul de moléculas de analito diluído em metanol a 180 mL alíquotas de ensaio aptâmero-AUNP em uma placa de 96 poços à temperatura ambiente. Adicionar imediatamente a concentração de NaCl determinado na etapa anterior para iniciar a resposta de cor de ensaio.
    NÃOTE: Utilizar uma pipeta multicanal para realizar experiências múltiplas simultaneamente.
  3. Obter o maior possível mudança de cor, aumentando ou diminuindo a concentração de NaCl, e comparando a resposta do alvo para a resposta em branco. Utilizar a concentração de NaCl que fornece a maior diferença de resposta.
  4. Observar ou medir a resposta do ensaio 150 seg seguinte NaCl disso. Analisar a absorvância a 650 nm e 530 nm usando um espectrômetro ou obter uma foto de câmera digital da resposta do ensaio (ver secção 4 para o protocolo de análise foto).
    NOTA: um leitor de microplacas foi usada na obtenção das medições para este trabalho.
  5. Traçar os resultados como a relação de absorvância obtidos a 650 nm e 530 nm (E 650 / E 530) como uma função da concentração de analito. Normalizar a resposta do ensaio com o sinal em branco como foi feito neste trabalho.

4. Foto e Imagem Digital análise de cor Análise de Protocolo

  1. preparPT As amostras de ensaio como descrito (seções 3,2-3,3). Colocar a placa de 96 poços num transiluminador.
    NOTA: Uma transiluminador laboratorial padrão é tipicamente muito brilhante para obter imagens digitais utilizáveis ​​para esta análise. Estes transiluminadores provocam regularmente espaçados "linhas escuras" a aparecer na imagem digital, devido à intensidade da fonte de luz. Fazendo uma transilluminator a partir de uma caixa de luz baseado diodo emissor de luz (LED) e um pedaço de plástico opaco funciona bem.
  2. Obter fotografias da placa de 96 poços a 150 seg após adição de NaCl, importar as imagens para dentro do software de análise de imagem, e calcula os valores médios de vermelho, verde e azul (RGB), usando uma técnica de média incremental, como se mostra na equação 1 24:
    (1) equação 1
  3. Converter os valores RGB do RGB (sRGB) espaço de cor padrão para o espaço de cor diagrama de cromaticidade (CIExyY), utilizando as seguintes equações 24:
    (2) equação 2
    (3) equação 3
    (4) equação 4
  4. Converter os valores RGB exponencial para valores RGB lineares usando equação 2. A matriz especificado na equação 3 é usado para calcular a X, Y e Z valores do espaço de cor CIE 24.
  5. Calcular os valores de X e Y cromáticas usando a equação 4 representa a cor média dos pixels na área selecionada para análise 24.
  6. Realizar a análise em cada poço e representar graficamente os valores de cromaticidade para gerar uma curva de calibração (Figura 4). Se obter o erro padrão por análise da cor de diferentes áreas do mesmo poço.

5. Congelamento Aptamer-AUNP Ensaio para armazenamento a longo prazo

  1. Prepare os componentes do ensaio de aptâmeros-AUNP conforme descrito nas seções 2.4 e 2.5. Adicione soluções separadas contendo 1 g / ml de trealose e 1 g / ml de sacarose, em água isenta de nuclease para tornar a solução Cryogen.
    NOTA: As concentrações elevadas de trealose e sacarose foram usadas para reduzir o factor de diluição, quando a preparação do ensaio de congelação. Aquecer as soluções de açúcar sobre uma placa quente num copo de água para dissolver completamente os açúcares antes da utilização.
  2. Adicione uma solução que contém 19,2 mg / ml de trealose e 4,8 mg / mL de sacarose, com o ensaio de 60 MN4-ADN / AUNP a um volume final de 200 ul em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. concentrações de solução cryogen finais irão variar com cobertura de DNA.
    NOTA: As amostras devem ser congelados não deve exceder 300 ml. Volumes maiores podem não congelar corretamente.
  3. Flash congelar as amostras usando um C congelador -146 ° ou em azoto líquido. Armazenar as amostras congeladas até à sua utilização. O armazenamento pode ser numa -80 ° C ou -20 ° C, uma vez piscar congelação está completa.
  4. Para este trabalho, deixe as amostras em C congelador -146 ° maisnoite e, em seguida, transferidos para um congelador de -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
    Nota: O Flash congelamento pode causar o aptâmero-AuNPs para agregar. Testar a integridade do processo de congelação por monitorização do perfil de absorvância e comparando-o com uma amostra descongelada. Se for observada a agregação, aumentar a quantidade de solução de criogénio para compensar este problema.
  5. Descongelar as amostras à temperatura ambiente e utilizar amostras suficientes apenas na medida do necessário para a experimentação. Obter espectros de absorvância de amostras descongeladas e comparar espectros de linha de base para a de uma solução de criogénio amostra tratada descongelada. Medir a absorvância de 400 nm a 700 nm.
  6. Realizar a titulação de sal (secção 3.1), teste o ensaio (ponto 3.2), e traçar os resultados (pontos 3.3 e 3.4), como descrito anteriormente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e investigar a estabilidade e robustez do apt�ero com base ensaios colorimétricos AUNP para uso no campo. Como destaque na publicação anterior, duas estratégias distintas para criar o ensaio foram investigados 7. Os ensaios foram denominado o Aptamer Ensaio Livre eo adsorvida Aptamer de Ensaio. O ensaio foi adsorvida Aptâmero mais atraente para os efeitos de um ensaio de detecção fieldable (Figura 1).

figura 1
. Figura 1. Representação esquemática do adsorvida Aptâmero Ensaio O aptâmero foi misturado com AuNPs e incubadas durante a noite; moléculas de analito dissolvido em metanol foram adicionados para o aptâmero Ensaio absorvido, imediatamente seguido da adição de cloreto de sódio (NaCl) para induzir a agregação AUNP quando o alvo foi adicionado.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Isto deveu-se à redução das taxas de falsos positivos para analitos não-alvo, relativa simplicidade e facilidade de uso do adsorvida Aptamer de Ensaio. Para preparar o adsorvida Aptâmero ensaio, a ADN-aptâmero foi misturado com AuNPs e incubadas durante a noite no tampão de ensaio. Isto permitiu que o aptâmero para adsorver prontamente sobre a superfície a AUNP, o que reduziu a sensibilidade do ensaio para respostas falsas positivas para moléculas de analito não-alvo tais como agentes de mascaramento ou corte. No entanto, apenas a estrutura pré-formada do aptâmero MN4 cocaína foi activa na presença de cocaína (alvo) no seu cartão de ensaio. O ensaio foi aplicado através da adição de soluções de analito seguida pela adição imediata de uma concentração adequada de NaCl. soluções salinas foram usadas para iniciar o observável e MEAsurable mudança de cor do ensaio. O ensaio foi executado dentro de 2-3 min. após a adição da solução de analito.

Uma acção crítica na execução desses ensaios colorimétricos à base de ADN fisicamente adsorvida é a resposta de cor induzida, através da adição de uma concentração adequada de sal. A adição de sais são conhecidos para desestabilizar AUNP suspensões resultantes da agregação das partículas, mascarando as cargas negativas da camada de citrato que estabilizar as AuNPs, e, em seguida, diminui as interacções electrostáticas interpartículas. O resultado é a mudança de cor observável vermelho-para-azul. O mesmo efeito é observado com o ADN tratado AuNPs. No caso de ADN-aptâmeros, analista determinar a concentração de sal necessária para causar o mínimo desestabilização AUNP observável (coloração azul). Com a adição de alvo, a estabilização das AuNPs pelo ADN-aptâmero é significativamente reduzida, resultando em um OBSErvable, mudança de cor de resposta dose alvo mensurável. Esta mudança de cor única pode ser percebida com a adição da quantidade pré-determinada adequada de sal.

Igualmente importante é o processo em que foi determinada a concentração apropriada de sal. Isto foi conseguido por realização de uma curva de titulação através da adição de concentrações crescentes de uma solução de cloreto de sódio a uma série de espaços em branco de ensaio (Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Curva de titulação induzida pelo sal. Citrato-estabilizado (vermelho), MN4 cocaína ligação aptâmero (verde), e aptâmeros amostras (roxo) ligação MN6 cocaína tratados AUNP foram tituladas com cloreto de sódio (NaCl). As concentrações dos sais iniciais obtidos visualmente foram indicadas com setas de cor correspondente para cada curva. As barras de erro são definidos pelo desvio padrão emtriplicado medidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, a concentração de sal inicial utilizado foi determinada por inspecção visual, e foi considerado como sendo a concentração de sal que causou a menor coloração azul observável com o ensaio em branco. No entanto, para uma abordagem mais quantitativa, os pesquisadores novo para esta área de pesquisa pode usar o ponto médio do ponto de titulação de equivalência como uma concentração de sal de partida. Para além deste ponto a resposta de cor começa a aumentar rapidamente. Além disso, a concentração de sal utilizada na execução do ensaio foi ajustado para maximizar a diferença de cor entre as respostas em branco e cocaína ensaio. Isto foi conseguido através do aumento e diminuição da concentração de sal a partir do valor determinado por titulação. O procedimento de sal de titulação foi realizada diariamente paraem conta a variabilidade do dia-a-dia com o ensaio. A variabilidade de lote na concentração de sal necessária para o ensaio foi de não mais do que 20%. Figura 2 tem três amostras AUNP distintas, estabilizado com citrato (sem ADN), MN4 (ADN-aptâmero estabilizado), e MN6 (ADN-aptâmero estabilizados). A cobertura de ADN para as amostras foram MN4 e MN6 60 moléculas de ADN / AUNP, e cada curva de titulação tem um ponto de equivalência da titulação diferente e ponto médio com base no nível de estabilidade proporcionada pelo tratamento de superfície. Citrato fornecida pouca estabilidade, MN4 (de cadeia dupla como a estrutura) forneceu mais estabilidade e MN6 (cadeia simples como a estrutura), desde o mais estabilidade aos AuNPs. As concentrações de sal iniciais utilizados neste trabalho foram determinados como sendo ~ 50 mM, ~ 90 mM, e ~ 130 mM visualmente. A tendência concorda com o entendimento convencional da estrutura do DNA e seu efeito estabilizador sobre AuNPs 24-25. Ao executar este teste visual, o espaço em branco ensaio mostrou uma ligeira colora azul ção com as concentrações de sal, tal como identificados na Figura 2 com setas, que são perto dos pontos médios como discutido. As concentrações de sal antes de pontos teses proporcionar mudança de cor pouca ou nenhuma observável, e além destes pontos a cor aumenta rapidamente. Para este trabalho, a concentração de sal inicial foi determinado visualmente e depois aperfeiçoá-lo usando comparações de medição leitor de microplacas de amostras em branco e cocaína ensaio.

Com a aproximação gratuito Aptamer Ensaio, as respostas falsas positivas foram um problema. Interações de superfície de moléculas de analito são uma fonte para esta questão, conforme descrito na publicação anterior 7. Para evitar que as respostas de cor não intencional devido a interacções não específicas da superfície AUNP, as densidades de cobertura de ADN do aptâmero de ligação ao alvo foi controlada (Figura 3).

jpg "/>
Figura 3. adsorvida aptâmero resposta do ensaio com densidade variável cobertura de ADN. Resposta de agregação à cocaína (vermelho, meta), EME (verde, controlo), e procaína (azul), uma molécula com actividade de superfície AUNP, para o 90, 120, 150, 180 e densidades de cobertura de ADN / AUNP foram exibidos. Todas as amostras analisadas foram dissolvidas em metanol a 1 mg / ml. As barras de erro são definidos pelo desvio padrão das medições em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em geral, a taxa de resposta positiva falsa de moléculas de analito não alvo devido a interacções AUNP foi reduzida com o aumento da densidade de cobertura de ADN. No entanto, a sensibilidade do ensaio foi reduzido em consequência da cobertura de DNA aumentada. Neste trabalho, as densidades de ADN de 60, 90, 120, 150, 180, e 300 de ADN / AUNP foram Investigated. Densidades de 60 e 300 foram amplamente descritos em trabalhos anteriores 7. A Figura 3 representa densidades de DNA adicionais estudados. Procaína foi um dos analitos não-alvo mais altamente tensoativos pesquisados. Para cada uma das coberturas de DNA individuais, a resposta do ensaio foi maximizada através do ajuste da concentração de sal, tal como descrito. Em geral, como a cobertura de ADN aumenta, a diferença de resposta entre o controlo (EME) e resposta de cocaína diminui. De modo semelhante, a resposta do ensaio na presença de procaína diminui para níveis de fundo com coberturas crescentes. A superfície 180 de ADN / densidade AUNP eliminado relacionada falsa resposta positiva para procaína, mantendo uma alta resposta alvo. Esta avaliação descreve um processo para a sintonização destes ensaios de cores para reduzir as respostas falsas positivas relacionadas de superfície, preservando ao mesmo tempo resposta alvo, tanto quanto possível. Improved sensibilidades pode ser alcançada através da redução da cobertura de ADN. No entanto, falsa posirespostas tivos pode se tornar um problema, dependendo da aplicação.

ensaios colorimétricos são comumente usados ​​para testes rápidos, simples, muitas vezes presumíveis qualitativos e quantitativos mesmo. Problemas comuns com determinações colorimétricos são a natureza subjetiva do discernimento cor, particularmente com diferenças sutis de cor e borderline. Os julgamentos que devem ser feitas pelo analista pode resultar em má interpretação dos dados. Medições em equipamentos de laboratório reduzir a incerteza e indecisão associados com a avaliação dos resultados do ensaio. No entanto, neste trabalho, a intenção era fornecer uma pronta ensaio de campo, que proporcionou resultados imediatos ao analista. Como tal, uma técnica de análise de imagem foto foi estabelecido que proporcionou um resultado de cor mais decisiva (Figura 4).

Figura 4
Figura 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Com concentrações crescentes de cocaína, a cor de ensaio resultou em um aumento da cor azul. fotos digitais de curvas de calibração foram obtidos utilizando dois smartphones diferentes, e importados para um computador laptop padrão para a análise utilizando o software ImageJ. Os valores de cromaticidade foram usadas para traçar o ccurvas alibration como mostrado na Figura 4. A análise de imagem fornecida uma resposta linear ao aumento da concentração de cocaína com ambos os conjuntos de imagens smartphones como indicado pelos valores de R 2. Este método foi transferida para um aplicativo Smart-dispositivo para auxiliar o analista no campo. Uma avaliação detalhada da aplicação foi realizada em uma publicação anterior 7. O aplicativo eliminou muito da incerteza e indecisão associado com resultados sutis mudanças de cor das menores concentrações de cocaína.

armazenamento de longo prazo de testes de ADN fisicamente adsorvida deste tipo não foram estudadas em grande detalhe e um dos objetivos deste trabalho foi encontrar condições para estender o prazo de validade do ensaio. O tratamento dos componentes de ensaio, para armazenamento a 4 ° C foi descrito em pormenor numa publicação anterior 6. Para este trabalho, a liofilização dos componentes de ensaio preparadas foi considerado para uso a longo prazo de armazenamento e óf o ensaio. Liofilizar os componentes de ensaio tem a vantagem de manter e armazenar as amostras à temperatura ambiente, o que eliminaria a necessidade de um frigorífico ou congelador. O passo principal no processo de liofilização é a primeira a congelar a amostra. Para verificar as amostras AUNP sobreviver ao processo de congelamento, efectuar uma comparação dos espectros de absorvância do ensaio antes da congelação à da amostra descongelada. Os exames devem coincidir exatamente. Se as amostras não sobrevivem ao processo de congelação, o espectro da amostra descongelada terá aumentado absorvância na região acima de 525 nm. Isto indica que os AuNPs agregados durante a congelação e a amostra descongelada é comprometida. A viabilidade do ensaio descongelado foi testado com cocaína e EME (Figura 5).

Figura 5
Figura 5. adsorvida estudo de resposta prazo de validade Aptamer de Ensaio. Quantificação a resposta do ensaio em EME (verde, controlo), e cocaína (vermelho, alvo) realizada com congeladas e depois descongeladas amostras Aptâmero ensaio adsorvidos durante um período de quatro semanas. As barras de erro são definidos pelo desvio padrão das medições em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As amostras em branco do ensaio descongelado permaneceu no mesmo valor ao longo do período de estudo como amostras que foram feitas e usadas imediatamente (sem armazenamento). As respostas das amostras de cocaína e EME foram consistentes com respostas típico observado com amostras feitas e utilizadas imediatamente (sem armazenamento). As amostras congeladas foram monitorizados durante o período de 4 semanas, sem qualquer alteração para o desempenho do ensaio, em comparação com as amostras armazenadas a 4 ° C durante o mesmo período de tempo 7 ou para amostras de ensaio feitas e utilizadas immediately. Respostas cocaína foram relativamente constantes durante o período de 4 semanas, o que também foi observada para as amostras a 4 ° C 7. A diminuição do sinal de EME de semana a semana 1 2 é frequentemente observada com a temperatura ambiente e de armazenamento de 4 ° C, bem. Um fenómeno que atribuída a maturação do ensaio durante a primeira semana. Esta abordagem aumentada as opções disponíveis para o armazenamento a longo prazo dos ensaios colorimétricos adsorvidos de ADN, e fornecida uma porta de entrada para as opções de armazenamento de longo prazo, isto é, a liofilização adicionais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ao longo da última década, os ensaios colorimétricos à base de nanopartículas têm sido desenvolvidos para a detecção de alvos incluem pequenas moléculas, ADN, proteínas, células e 2-4. Os ensaios que utilizam ADN aptâmeros com nanopartículas têm vindo a ganhar interesse. Tipicamente, estes ensaios colorimétricos são realizadas por mistura do ADN-aptâmero com moléculas de analito seguida pela adição de AuNPs 9-10. No entanto, estes ensaios têm sido utilizados em demonstrações de prova de conceito com configurações controladas de laboratório e com limitados, controles selecionados. Os recentes avanços para a transição desta tecnologia no campo foram feitas 7. Nesta abordagem, a ADN-aptâmero foi adsorvido para AUNP superfícies, antes da adição das moléculas de analito a ser testado (Figura 1). O desenvolvimento de ensaios colorimétricos à base de nanopartículas quer aptâmero-ouro requer optimização em vários estágios do processo de fabrico / análise. Assim, aqueles que são novos para o discoipline deve estar ciente das nuances associadas à refinação e solucionar esses ensaios para ser bem sucedido.

Os ensaios adsorvidas nanopartículas aptâmero-ouro requerem otimização cuidadosa para cada par aptâmero / target. No entanto, seguindo os passos explicados aqui oferece um protocolo consistente para executar otimização destes ensaios colorimétricos. A determinação e ajustamento das concentrações de sais que resulta na mudança de cor máxima observável ou mensurável entre a placa de destino e de ensaio é um dos passos mais críticos de optimização (Figuras 2 e 3). Para alguns pares de aptâmero / alvo, observou-se que a utilização de concentrações elevadas de sal perto do ponto final da curva de titulação ter resultado numa mudança de cor azul-a-vermelho 18. Isto indica uma estabilização das AuNPs pelo aptâmero após a adição do alvo e sal.

Outros fatores que podem influenciar as pe ensaiorformance incluem componentes do tampão e concentrações, a quantidade de cobertura de ADN-aptâmero, solventes usados, a temperatura, sequência aptâmero e estrutura, tempo de ensaio-alvo de incubação (tempo quando o alvo é adicionado ao ensaio, antes da adição de sal), e o tempo de desenvolvimento de cor ( tempo necessário para o desenvolvimento da coloração, após a adição de sal). Um tampão HEPES 10 mM, MgCl2 1 mM pH 7,4 foi o tampão de ensaio de escolha em muitos dos pares alvo / aptâmeros utilizados no nosso trabalho. No entanto, esta reserva pode não ser ideal para todos os aptâmeros. Para obter a dobragem correcta do aptâmero, os componentes do tampão de ensaio podem ter de ser adaptados, e mantida tão próxima quanto possível da composição utilizada no tampão de selecção aptâmero. Quando se utiliza um tampão com AuNPs, os componentes do tampão e concentrações devem ser considerados, em particular com substâncias iónicas. Concentrações elevadas de compostos iónicos poderia provocar a agregação das AuNPs prematura. Cobertura de ADN / AUNP foi demonstrado na Figura 3. Tal como o DNAcobertura aumenta a partir de ADN de 90-180 / AUNP, a resposta analito alvo causando diminuição reduzida a sensibilidade do ensaio. Portanto, um trade-off é necessário que depende de cada aptâmero, devido à sua dobragem particular e grau de interação com a superfície do AUNP.

Além disso, os solventes necessários para dissolver moléculas de analito podem resultar em agregação não desejada das AuNPs. Água, tampão de ensaio, e metanol foram todos utilizados sem problema. Quando usado sem diluição, acetonitrilo e dimetilsulfóxido (DMSO) adsorver à superfície do AUNP causando agregação não intencional. O acetonitrilo foi problemática, mesmo a diluições de menos de 1% (volume final). Os solventes devem ser testados com AuNPs antes da utilização com o ensaio colorimétrico. A temperatura à qual o ensaio é realizado pode ter um impacto sobre se uma resposta é observada com o ensaio. Isto tem mais a ver com a estrutura aptâmero e a temperatura de fusão, ou a estabilidade da estrutura aptâmero a uma dada temperatura, quecom as nanopartículas. No nosso trabalho, concluímos que há um equilíbrio delicado entre ter o aptâmero numa estrutura pré-formada com o ADN de uma forma dobrada, e também não completamente em uma única estrutura de cadeia. Este é o caso para o ensaio de forma adsorvida aptâmero destes ensaios colorimétricos (Figura 1). Ao considerar a estrutura, a sequência de aptâmero também deve ser contemplada porque a maior parte da estrutura de aptâmero é o resultado de as sequências de oligonucleótidos individuais. No entanto, é necessária uma investigação mais aprofundada sobre este aspecto.

Em geral, a abordagem que usamos no desenvolvimento de um ensaio colorimétrico baseado aptâmero-AUNP é o mesmo para todos os pares de aptâmero / alvo. Em primeiro lugar, obter um aptâmero para um alvo de interesse. Isto pode ser alcançado através de pesquisa da literatura ou a selecção de um aptâmero para a molécula de interesse. Nesta fase, não há nenhuma maneira de saber se o aptâmero é um bom candidato para a criação de um colorimétricoensaio. Isso só pode ser determinada através da experimentação. Em seguida, o aptâmero é incubada durante a noite com AuNPs para fabricar o ensaio de aptâmero adsorvido (Figura 1). A abordagem padrão é começar a testar com 60 aptâmeros / AUNP; No entanto, várias coberturas são preparados para a próxima fase de testes. Quando os ensaios estão prontos para o teste, realizar as investigações curva de titulação como descrito (Figura 2). O ponto médio da curva de titulação serve como uma concentração de confiança a partir de sal para ser utilizado para o alvo, ensaio em branco, e os testes de controlo. A concentração de sal é aperfeiçoá-lo para proporcionar uma diferença máxima de cor entre as amostras em branco alvo e ensaio. Para testar a resposta é real e causado pela ligação aptâmero-alvo e não devido ao alvo interacções não específicas / solventes, realizar o ensaio com os controles. Simultaneamente, o tempo de desenvolvimento de cor de ensaio são investigados em intervalos de 5 min. Seguido por períodos de incubação do ensaio-alvo em 5 min intervals, inicialmente 15+ vezes min de incubação são usados ​​até que este passo é otimizado. Dependendo dos resultados, uma maior optimização da concentração de sal, a cobertura aptâmero, tempo de incubação e tempo de desenvolvimento da cor pode ser necessário (Figura 3). Esta abordagem descreve um protocolo para a concepção e desenvolvimento de ensaios colorimétricos aptâmero-AUNP por um par target / aptâmero. Outras investigações sobre a sequência de aptâmero e efeitos estruturais na melhoria dos ensaios colorimétricos aptâmeros adsorvida são de grande interesse. Há uma necessidade de compreender as interacções associadas com o aptâmero, alvo, e AuNPs. Este conhecimento pode levar a alfaiataria aptâmeros para uma melhor funcionalidade e até mesmo prever que aptâmeros estará ativo no formato de ensaio adsorvida aptâmero.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
  2. Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
  3. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  4. Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
  5. Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
  6. Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
  7. Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  8. Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
  9. Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
  10. Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
  11. Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
  12. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  13. Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
  14. Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
  15. Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
  16. Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
  17. Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
  18. Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
  19. Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  20. Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  22. Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
  23. Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  24. Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
  25. Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).

Tags

Bioquímica Edição 112 ensaio colorimétrico nanopartículas de ouro aptâmero app colorimétrico ácidos nucléicos nanotecnologia bio-sensores sensores ópticos
Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, J. E., Chávez, J. L.,… More

Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter