Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54077
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

Protocol

تمت الموافقة التجارب على الحيوانات من قبل مركز الحيوانية الطب الحيوي التجريب في جامعة جيونج سانج الوطنية.

1. الاستعدادات لإجراء الحيوان

  1. إعداد الكبار minipigs الإناث لجمع غير الغازية من اللجان الدائمة من نخاع العظام والسائل الزليلي. إجراء الفحص السريري للminipigs مسبق يوم واحد للتخدير وجمع العينات.
    1. توفير حيوانات طبيعية سريريا لالفحوصات الطبية، والتي تشمل درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس، ومعدل ضربات القلب، ومراقبة الخنازير السلوك والدموية الحالات، وذلك باستخدام كاملة اختبارات تعداد الدم.
      ملاحظة: فترات معلمة لminipigs صحية سريريا هي 11-29 / دقيقة لمعدل التنفس، 68-98 / دقيقة لمعدل ضربات القلب، و 37 - 38 درجة مئوية لمدة درجة حرارة الجسم.
  2. إزالة جميع الفراش الصالحة للأكل من القفص أثناء فترة الصيام قبل الجراحة من 6 - PRIO 12 ساعةr لإدارة التخدير لminipigs الشباب والكبار، 3 ساعات الصيام ينبغي مراعاتها لحديثي الولادة. توفير المياه الصالحة للشرب حتى وقت التخدير.

2. إعداد الحيوانات للتخدير

  1. مداواة وminipigs قبل إدارة التخدير مع آسيبرومازين (0.1 ملغ / كلغ)، medetomidine (0.03 ملغ / كلغ)، والأتروبين (0.04 ملجم / كجم).
    1. حقن جميع الأدوية عن طريق الحقن العضلي (IM) باستخدام 21 G إبرة بطول لا يقل عن 30 مم للminipigs الكبار. إجراء الحقن بالعضل 1-3 سم خلف الأذن في العضلات الرقبية الجانبية أو في عضلة الفخذ.
      ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات من دون أن تستثير الخوف أو التوتر في الحيوانات أو التي تتطلب معالجة الخام لحقن بأمان تخدير.
  2. وضع minipigs في موقف الظهرية راقد.
  3. بعد خمس عشرة دقيقة إدارة تخدير، والشروع في التخدير باستخدام 1.5٪ الأيزوفلورين المشرفistered عن طريق الاستنشاق.
    1. مواصلة استنشاق الأيزوفلورين (1.5٪) من خلال أنبوب القصبة الهوائية، تليها زيادة في تركيز 2.5٪، مع الأكسجين (1.5 لتر / دقيقة)، والغاز الناقل.
  4. مراقبة مستمرة من معدل ضربات القلب، درجة حرارة الجسم، وعن طريق الجلد تشبع الأكسجين في الدم (مكتب التخطيط الاستراتيجي 2) من minipigs أثناء التخدير. استخدام بطانية المياه المنتشرة عند درجة حرارة من 38-39 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. تطبيق مرهم بأمراض في العيون لحماية العينين من الجفاف أثناء التخدير.
  5. اتبع تصنيف Guedel لتقييم عمق التخدير 13.

3. الاستعدادات لعزل الخلايا وزراعة

  1. لزراعة اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام والسائل الزليلي، وإعداد 500 مل من المتوسط ​​المتقدمة Dulbecco لتعديل النسر (ADMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ Glutamax، 10 نانوغرام / مل من نمو الخلايا الليفية الأساسية الأمر الواقعص (bFGF)، و 1.0٪ البنسلين ستربتومايسين (10000 وحدة دولية و 10،000 ميكروغرام / مل على التوالي، القلم بكتيريا).
    1. احتضان ADMEM في 38.5 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2 في حاضنة CO 2.
  2. إعداد 500 مل من Dulbecco والمالحة العازلة الفوسفات (DPBS) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لعزل الخلايا والغسيل.

4. جمع نخاع العظم من Minipigs

  1. حدد مساحة ما يقرب من 15 × 15 سم في الحجم على قمة الحرقفي (الشكل 1)، وإزالة الشعر من هذه المنطقة باستخدام شفرات الحلاقة سلامة تعقيمها أو كليبرز الكهربائية. مرة واحدة يتم وضع minipig، بالتناوب فرك الموقع إجراء ثلاث مرات مع وكلاء التعقيم التالية: البوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول. بعد منطقة جافة تماما، وتطبيق الستائر العقيمة.
  2. قبل معطف الحقنة 10 مل مع 100 U / مل من الهيبارين قبل الشطف مع 3-4 مل من الهيبارين قبل ejecتينغ وكيل مكافحة التخثر.
    ملاحظة: إجراء هذه الخطوة لتجنب تجلط الدم في حقنة خلال التطلع نخاع العظام.
  3. استخراج ما لا يقل عن 5 مل من نخاع العظام من عظام عرف الحرقفة من minipig تحت التخدير، وذلك باستخدام مستخرج نخاع العظم (3.0 × 100 ملم) تعلق بإحكام إلى الهيبارين قبل المغلفة 10 حقنة مل.

5. عزل الخلايا المستخرجة من نخاع العظام ووفي زراعة المختبر

  1. عزل الخلايا من نخاع العظام المستخرجة.
    1. تمييع نخاع العظام المستخرجة مع حجم مساو من DPBS في أنبوب مخروطي 15 مل في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 3 مل من وسائل الاعلام الكثافة الطرد المركزي (Ficoll-Paque) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    3. تمييع طبقة 4 مل من نخاع العظام مع DPBS، التي يتم وضعها على وسائل الإعلام الطرد المركزي كثافة دون خلط، وأجهزة الطرد المركزي أنه في 400 × ز لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. حصاد طبقة من خلايا وحيدة النواة(الشركات المتعددة الجنسيات) من معطف الشهباء بين طبقتين تحتوي على البلازما (الطبقة العليا) ووسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (الطبقة السفلى)، ونقل الشركات المتعددة الجنسيات إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    5. تمييع الشركات المتعددة الجنسيات نقل مع 7-8 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي لهم في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف وغسل الخلايا مرتين مع DPBS.
    6. تعليق بيليه خلية في 2 مل من ADMEM وتحويلها إلى طبق نسيج الثقافة 35 مم. احتضان الطبق الثقافة في 38.5 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2.
  2. في زراعة المختبر من خلايا معزولة من نخاع العظام.
    1. بعد 48 ساعة، ونضح المتوسطة مع الخلايا التي لم تعلق على طبق، واستبدال 2 مل من ADMEM واحتضان ذلك في 38.5 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2. تغيير المتوسط ​​كل يوم الثالث.
    2. في 70-80٪ confluency، وغسل الخلايا مع DPBS، فصل عليها مع 1 مل من 0.25٪التربسين / EDTA، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق حتى فصل الخلايا.
    3. حصاد الخلايا باستخدام 10 مل من ADMEM، نقلها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
    4. تعليق الخلايا التي تحصد في 1 مل من ADMEM جديدة ونعدهم باستخدام عدادة الكريات.
    5. وضع الخلايا في 5-7،5 × 10 5 / 25T قارورة تحتوي على 4 مل من ADMEM واحتضان لهم في 38.5 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2. تغيير المتوسط ​​كل يوم الثالث على التوالي.

6. جمع الزلالية السائل من Minipigs

  1. على غرار إجراءات تطلع نخاع العظام، وتحديد المنطقة المناسبة من حوالي 15 × 10 سم (طول / عرض) على مفصل الفخذ، وإزالة الشعر باستخدام شفرات الحلاقة سلامة تعقيمها أو كليبرز الكهربائية، متابعة من قبل إجراءات التعقيم (الخطوة 4.1).
  2. إدراج حقنة 3 مل مع 23 Gالحقن في المفصل بعد معالم الجس (الرضفة وقمة الساق).
    1. تطبيق طيف الامتصاص إلى الحقن لتطلع السائل الزليلي في المفصل. حجم تقريبي من السائل الزليلي جمعت من المشترك هو 0،5-1 مل، ولكن هذا يختلف وفقا لحجم minipig أو المفصل. مطاردة من خلال DPBS في تجويف الزليلي وإذا كان حجم جمع السائل الزليلي صغير جدا.
    2. الانسحاب فورا حقنة لتجنب تلوث بالدماء.

7. عزل الخلايا من جمعها الزلالية السائل وفي المختبر زراعة

  1. عزل خلايا من السائل الزليلي يستنشق.
    1. تمييع السائل الزليلي يستنشق مع حجم مساو من DPBS في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل في درجة حرارة الغرفة.
    2. لإزالة الأنقاض، تصفية السائل الزليلي المخفف باستخدام 40 ميكرون خلية النايلون مصفاة.
    3. إضافة 10 مل من DPBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على الزليلي تصفيتهاالسائل وأجهزة الطرد المركزي أنه في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف وغسل الخلايا مرتين مع DPBS.
    4. تعليق بيليه خلية في 2 مل من ADMEM، وضع الخلايا في و2 - طبق زراعة الأنسجة 3 × 5 10 خلايا / 35 ملم مع 2 مل من ADMEM، واحتضان لهم في 38.5 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2 .
  2. كرر الخطوة 5.2 لزراعة في المختبر من اللجان الدائمة المستمدة من السائل الزليلي معزولة.

العناية 8. بعد الداخلي للMinipigs

  1. إذا لزم الأمر، أغلق الجلد في موقع الحقن مستخرج نخاع العظام مع خياطة واحدة باستخدام دباسة الجلد، وبعد جمع نخاع العظام.
  2. بعد الانتهاء من إجراء وإدارة الحقن العضلي من إينروفلوكساسين (5 ملغ / كلغ) وميلوكسيكام (0.2 ملغم / كغم) إلى minipigs مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام.
  3. بعد الانتهاء من إجراءات، وتطهير نخاع العظام والزليلي الموقع جمع السائلمع 0.1٪ البوفيدون اليود مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام. مراقبة بعناية يوميا لمراقبة علامات المضاعفات (مثل تورم، والقيح، أو احمرار).

9. Phenotyping الخلية باستخدام التدفق الخلوي

  1. عندما اللجان الدائمة هي 70-80٪ متكدسة في الممرات 3-5، وغسل الخلايا مع DPBS وتعاملهم مع 1 مل من 0.25٪ (ت / ت) التربسين / EDTA. ثم، احتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
  2. حصاد الخلايا باستخدام 10 مل من DPBS، نقلها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وأجهزة الطرد المركزي لهم في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الحل طاف.
  3. لإصلاح الخلايا، تعليق بيليه خلية في 10 مل من محلول الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة يوم واحد قبل التحليل.
    1. بعد يوم واحد من تحديد، وغسل الخلايا مع DPBS مرتين باستخدام الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في كل مرة. تجاهل الحل طاف.
    2. تعليق بيليه خلية في 4 ملمن DPBS، التي تستكمل مع 1٪ (ث / ت) زلال المصل البقري (BSA)، واحتضان وبيليه لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية لمنع التفاعلات غير محددة بوساطة لكرة القدم.
    3. توزيع 500 مكل من تعليق خلية في أنابيب 1.5 مل.
    4. عن الأجسام المضادة غير مترافق (CD29 وفيمنتين)، وغسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق. تجاهل الحل طاف.
    5. تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
    6. غسل الخلايا مرتين مع 1٪ ألبومين المصل البقري عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في كل مرة. تجاهل الحل طاف.
    7. تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر من 1: 100 التخفيف من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated الضد الثانوية واحتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في 4 درجات مئوية.
  4. لالأجسام المضادة FITC مترافق (نمط إسوي، CD34، CD44 CD45 و)، وغسل الخلايا عن طريق centrifugation في 300 × ز لمدة 3 دقائق. تجاهل الحل طاف.
    1. تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر من 1: 100 الأجسام المضادة FITC مترافق واحتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في 4 درجات مئوية.
    2. لكل الظروف تلطيخ، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في كل مرة. تجاهل الحل طاف.
    3. تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من DPBS، نقلها إلى 5 مل أنبوب جولة القاع، وتحليل النتائج باستخدام تدفق عداد الكريات 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام وفي السائل الزليلي من Minipigs

تم عزل اللجان الدائمة بنجاح من نخاع العظام والمفاصل الزليلي المفصلي من minipigs وتوسعت في المختبر (الشكل 2). طموح حقنة من السائل الزليلي هو بسيط، وأنه من الممكن الحصول على خلايا ملتصقة كافية في المختبر خلال زراعة الخلايا الأولية. مورفولوجية اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السائل مماثلة لتلك التي من اللجان الدائمة المستمدة من النخاع العظمي، وكلا اللجان الدائمة لها شكل مغزل أرومي ليفي وتكون ملتصقة متجانس. وقد لوحظ أن لديها تعبيرا إيجابيا عن الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ، بعد ان ثقافة فرعية الثالثة كاملة.

تقييم النمط الظاهري خلية من اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام وفي السائل الزليليمن Minipigs

وقد أجريت فحوصات للعلامات سطح الخلية لإنشاء النمط الظاهري من اللجان الدائمة النخاع العظمي والزليلي-السوائل المشتقة من minipigs. وأعرب كلا النوعين من اللجان الدائمة كميات كبيرة من علامات سطح الخلية إيجابية، مثل CD29، CD44، وفيمنتين (≥96 - 99٪ من خلايا إيجابية)، في حين كانت العبارات من CD34 و CD45 السلبية ومنخفضة (≤2٪ من خلايا إيجابية) (الشكل 3). وتأتي هذه النتائج مطابقة لتلك التي تم الحصول عليها من اللجان الدائمة مميزة، بما في ذلك الخلايا المعزولة من السائل الزليلي، وكانت هناك اختلافات كبيرة في علامات سطح الخلية بين هذه اللجان الدائمة. وقد أكدت خلايا معزولة عن نخاع العظام والسائل الزليلي كما اللجان الدائمة في دراستنا السابقة (8). وأعرب كل من كوسا- العظام واللجان الدائمة المستمدة من السائل الزليلي العوامل النسخي الخلايا الجذعية (Oct3 / 4، NANOG، وSox2)؛ علاوة على ذلك، في المختبر التمايز القدرة حكما تم تأكيد ليس فقط في النسب الوسيطة (خلية عظمية، الخلايا الشحمية، وغضروفية)، ولكن أيضا الخلايا العصبية عن طريق تلطيخ cytochemical والمكتشفة من خلية محددة التعبير الجيني 8.

شكل 1
الشكل 1. الموقع من عرف الحرقفة من minipig. ويمثل السهم الأحمر الموقع على قمة الحرقفي تستخدم لجمع نخاع العظام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
كشفت الشكل 2. اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام والسائل الزليلي من minipigs. (أ) التشكل متجانس من الثقافات الأولية من اللجان الدائمة شكل أرومي ليفي. (ب) تلطيخ مع خليط منكشف 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات ونيترو نتروبلو الأزرق (BCIP / NBT) النشاط AP في اللجان الدائمة في مرور شريط 3. الحجم: 100 ميكرون الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
وقد تم تحديد الشكل 3. تحليل علامات سطح الخلية من اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام والسائل الزليلي من minipigs في مرور 3. تم تحديد علامات سطح الخلية من اللجان الدائمة باستخدام تحليل التدفق الخلوي، واللجان الدائمة بأنها إيجابية للCD29، CD44 وفيمنتين والسلبية لCD34 و CD45. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واستخدمت Minipigs لإنشاء اللجان الدائمة بمعزل عن نخاع العظام والسائل الزليلي. للقضاء على الظروف الفسيولوجية المختلفة، مثل العمر والجنس والمرض، وقد تم اختيار minipigs من المانحين خلفية إسوي إلى تقييم دقيق لتوصيف يعتمد مصدر الخلية. ومن المعروف أن الخنازير ليكون تشريحيا، من الناحية الفسيولوجية، وما شابه ذلك وراثيا للإنسان، وعلى وجه الخصوص، minipigs يمكن أن تنتج أجهزة يقابل حجم؛ وبالتالي، يمكن استخدامها كنوع بديل من الجهات المانحة لزرع الأعضاء 14،15. وفيما يتعلق الملكية المناعية اقترح مؤخرا من اللجان الدائمة، indoleamine 2، 3 دي أكسيجيناز (إيدو) وأكسيد النيتريك سينسيز (NOS) استخدمت مع اللجان الدائمة للتوسط المناعة، وهو أنواع محددة، على الرغم من أن اللجان الدائمة من الخنازير والبشر لديهم نفس IDO 9 . وهكذا، وهذا نموذج خنزير كمانح اللجان الدائمة قد يوفر معلومات هامة من الاستجابات المناعية للاللجان الدائمة للعلاج الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن الأبحاث في الجذعية الخنازيرالخلايا تلعب دورا هاما في فهم البيولوجي للعمليات في المختبر، ومختلف التطبيقات قبل السريرية في البشر 16،17. نخاع العظام والسائل الزليلي يمكن أن يكون حصادها من minipigs غير جراحية. الإجراء بأكمله، من التخدير لعينة جمع وخفض مستوى التوتر الأجهزة النظامية أو المحلية؛ وبالتالي، minipigs يمكن استخدام كمتلقين لزرع ذاتي. في هذه التجربة، تم عزل اللجان الدائمة من نخاع العظام والسائل الزليلي من minipigs، بناء على تأكيد من اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السائل مع قدرات المناعة المستمدة من نموذج RA الماوس في دراسة سابقة 8

جمع نخاع العظم من Minipigs

في الخنازير، وخلايا السلف الكبار المشتقة من نخاع العظام هي متعددة القدرات وقد يسببها اتساع الأوعية الدموية وتجديد cardiomyocyte. ويرتبط سن متبرع مع زيادة محتوى الدهون و انخفض انتشار والتفريق بين نخاع العظام. وبالتالي، ونخاع العظام ليست هي أفضل مصدر للاللجان الدائمة في الحيوانات المسنين. العرف الحرقفي في minipigs هي الموقع المفضل لعزل MSC المستمدة من النخاع العظمي، لأنه واسع وهو موقع الإجراء منخفضة المخاطر لتلف العصب الوركي. في حالة minipigs العمر أو الوزن الزائد، قد يكون التخصيب الدهون عضلات سميكة موجودة على قمة الحرقفي. وفي ظل هذه الظروف، شق طعن على الجلد أمر ضروري ويجب إدخال إبرة الخزعة نخاع العظم بشكل صحيح، والذي يمكن أن يكون من الصعب تطبيقها في قمة الحرقفي. الفشل في العثور على الصحيح موقع الخزعة قد يؤدي إلى تطلعات نخاع العظام فشلت بسبب الإبرة يصبح سدت العظام أو قد لا تكون قادرة على الوصول إلى نخاع العظم داخل الحرقفي. لذلك، يجب فحص خزعة الإبرة بشكل صحيح، ومطلوب معرفة سمك الأنسجة الرخوة وقشرة العظم من العرف الحرقفي قبل البدء في مجموعات العينة.

"jove_content"> طموح من الزلالية السائل من مفاصل Minipigs

وجود السائل الزليلي في تجويف مفصل زلالي، ويتم زيادة حجم السائل الزليلي عادة في المفاصل الملتهبة. تؤخذ اللجان الدائمة المستمدة الزلالية-السائل من المواقع المرشحة المفضلة للتجديد الغضروف، سواء في المجراة في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أنها لانتزاع الخصائص المناعية في الاتحاد الإقليمي 8. السائل الزليلي ليست فقط مصدرا سهل المنال ولكن لديها أيضا خصائص الوسيطة قيمة. القيود المفروضة على استخدام السائل الزليلي كمصدر للاللجان الدائمة هي أحجام مختلفة وجدت في المفاصل استنادا إلى أحجام مختلفة والحالات المرضية من المفاصل وصعوبة في استخدام حقنة 3 مل الانقاذ السائل الزليلي من المفاصل. ولذلك، ينبغي أن يكون حجم الحقنة 5-10 مل مع ضغط عال. وبالإضافة إلى ذلك، تدفق السائل الزليلي مع 1-2 مل من DPBS من حقنةهو الأفضل. باستخدام هذه الطريقة، يمكن الحصول على عدد كبير من الخلايا، حتى من المساحات الصغيرة في المفاصل.

الأوصاف من اللجان الدائمة العظام-كوسا- والمستمدة الزلالية-السائل من Minipigs

في البشر، والأشكال التضاريسية من اللجان الدائمة مشتقة الزليلي الغشاء الزليلي-fluid- ومن مرضى هشاشة العظام هي مماثلة لكنها أضيق من التشكل من اللجان الدائمة المستمدة من النخاع العظمي-12. ومع ذلك، في المختبر في الثقافات، وقد لاحظ الأشكال التضاريسية من كل من اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السوائل واللجان الدائمة المستمدة من النخاع العظمي لتكون مشابهة في هذه التجربة. في دراسة سابقة الباحثين، كانت القدرة على الانتشار من اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السوائل عالية، مقارنة بما كان عليه من العظام المستمدة من نخاع اللجان الدائمة 8.

وأنشئت اللجان الدائمة من مصادر الأنسجة المختلفة في الجهات المانحة البالغين؛ لذلك، غير جراحية الحصول على الأنسجة المستمدة من مصدر اللجان الدائمة هي قيمة للخلية الجذعية ذاتي عشرerapy. المصدر الخلية يعتمد على خصائص وقدرات مرض أو غرض العلاج بالخلايا الجذعية. في الخنازير، وخلايا السلف الكبار المشتقة من نخاع العظام هي متعددة القدرات وقد يسببها اتساع الأوعية الدموية وcardiomyocyte تجديد 18،19. وكانت اللجان الدائمة معزولة بشكل رئيسي من نخاع العظم، ولكن أيضا من السمحاق، والعضلات والهيكل العظمي، الزليلي، الحبل السري، وأنسجة الأسنان، على الرغم من الحصول على خلايا من هذه الأنسجة ليست سهلة، ويمكن أن تتطلب عمليات جراحية إضافية للمرضى. ومع ذلك، فإن حجم السائل الزليلي يزيد عادة في المفاصل التهاب المفاصل أو مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي، وتستخدم خزعات من هذه الزيادة في سوائل المفاصل لتشخيص وعلاج المرضى. عدد اللجان الدائمة يزيد أيضا في السائل الزليلي من المرضى الذين يعانون من الغضروف تدهورت وهشاشة العظام 20.

في هذه الدراسة تم تقييم الظواهر خلية من خلايا العظام كوسا- واللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السائل، وهوقدم د كل من اللجان الدائمة مستويات مماثلة من التعبير عن علامات سطح الخلية. لذلك، فإن الخلايا المعزولة من السائل الزليلي وكما أكدت اللجان الدائمة لها الظواهر مماثلة إلى اللجان الدائمة المستمدة من النخاع العظمي في minipigs. تقييم الأبحاث السابقة الباحثين علامات سطح الخلايا الأخرى، مثل CD90 والطبقة متوافق نسيجيا ومعقدة الرئيسية الثانية (MHC II)، وأكد القدرة على التمايز متعددة النسب في خلية عظمية، الخلايا الشحمية، غضروفية، والخلايا العصبية من الزليلي-السائل اللجان الدائمة -derived من minipigs 8. في البشر، والوضع المستضد السطحي خلية من اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السائل مماثلة لتلك التي من اللجان الدائمة المستمدة من النخاع العظمي، الزليلي membrane- 2،21 و. ومع ذلك، لم يتم الكشف عن CD34 والتعبير CD45 في اللجان الدائمة المستمدة من السائل الزليلي في المرضى الذين يعانون اضطراب مفصل الصدغي. وهكذا، فإن المكروية في المفصل قد تؤثر على النمط الظاهري خلية من اللجان الدائمة المستمدة من السائل الزليلي. في هذه التجربة، تم الحصول على الخلايا من أماه العظامRROW والسائل الزليلي من minipigs باستخدام أساليب غير الغازية. وقد أكد كلا النوعين من في المختبر الخلايا المستزرعة كما اللجان الدائمة، وكان لديهم الظواهر خلية مماثلة وخصائص الوسيطة متوافقة المشتركة. ومع ذلك، أظهرت اللجان الدائمة المستمدة الزليلي-السائل إمكانية أكبر لذاتي العلاج بالخلايا الجذعية ليست فقط الغضاريف والعظام تجديد ولكن أيضا لكبت المناعة هشاشة العظام والتهاب المفاصل الروماتويدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) Gibco 12491-023 MSC culture medium
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190-144 Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Component of MSCs medium
Glutamax Gibco 35050-061 Component of MSCs medium
Penicillin/streptomycin Gibco 10378-016 Component of MSCs medium
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Simga F0291 Component of MSCs medium
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A6003 Component of MSCs medium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell dissociation reagent 
β-mercaptoethanol Sigma M7522 Component of MSCs medium
Isotype antibody BD Pharmingen BD 550616 Isotype Control
CD29 antibody BD Pharmingen BD 552369 Integrin beta-1 MSCs marker
CD44 antibody BD Pharmingen BD 553133 Cell surface glycoprotein MSCs marker
CD45 antibody BD Pharmingen BD 340664 Hematopoietic stem cells marker
CD34 antibody BD Pharmingen BD 555821 Hematopoietic stem cells marker
CD90 antibody BD Pharmingen BD 555595 Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker
MHC Class II antibody Santa Cruz SC-32247 Antigen presenting cells marker
Vimentin antibody Sigma Sigma-S6389 Type III intermediate filament MSCs marker
Alkaline phosphatase Promega S3841 Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT)
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Density gradient centrifugation
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µm nylon cell strainer
15-ml polystyrene conical tube BD Falcon 351095 Sample collection and cell isolation
35 mm dishes Nunc 153066 Cell culture dish
Bone marrow extractor GmbH Medizintechnologie, Germany 1145-1W010 TrokaBone, 3.0 x 100 mm
Hematocritchamber Marinfeld 640130 Cell counting chamber
Atropine Jeil Pharmaceutical Co, South Korea Atropine sulfate Hydrate
Acepromazine Samu Median, South Korea Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug
Medetomidine Pfizer Anesthetic and analgesic drug
Enrofloxacin Bayer Healthcare, Germany Anti-biotics
Meloxicam Over Veterinary Medicine, Argentina Anti-inflammatory and analgesic drug
Isoflurane Hana pharm, South Korea Inhalational anesthesia
Povidone iodine  Korea Pharma, South Korea Sterilization agent
Ethanol Sigma E7023 Sterilization agent
Heparin Sigma H3393 Anti-coagulating agent
Formaldehyde Sigma F8775 Cell fixation agent
Ophthalmologic ointment  Pfizer Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate
Circulating water blanket Gaymar Industries Warming system during and after anesthesia
Skin stapler Covidien, USA Suture skin closure
CO2 Incubator Thermo Forma 3111 Cell culture Equipment
Flow cytometer BD Biosciences Cell analyzer
Minipig PWG Genetics Korea, Ltd. T-type Miniature pig

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
  2. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  3. De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
  4. Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
  5. Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
  6. Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
  7. Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
  8. Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
  9. Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
  10. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  11. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
  12. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
  13. John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
  14. Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
  15. Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
  16. Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
  17. Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
  18. Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
  19. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  20. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
  21. Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).

Tags

الطب، العدد 113، الوسيطة الخلايا الجذعية، minipig، السائل الزليلي، ونخاع العظام، والعزلة الخلية، زراعة الخلايا، النمط الظاهري الخلوية، علامة سطح الخلية، وتدفق الخلوي، بيولوجيا الخلايا الجذعية
العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, W. J., Park, J. S., Jang, S.… More

Lee, W. J., Park, J. S., Jang, S. J., Lee, S. C., Lee, H., Lee, J. H., Rho, G. J., Lee, S. L. Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs. J. Vis. Exp. (113), e54077, doi:10.3791/54077 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter