Protocol
Les expérimentations animales ont été autorisées par l'Animal Center for Biomedical Expérimentation à l'Université nationale de Gyeongsang.
1. Préparatifs de la procédure animale
- Préparer minicochons l'adulte femelle pour la collecte non invasif des cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse et du liquide synovial. Effectuer l'examen clinique des miniporcs un jour avant l'anesthésie et le prélèvement d'échantillons.
- Fournir des animaux cliniquement normaux pour des examens physiques, qui comprennent la température du corps, la fréquence respiratoire, et la fréquence cardiaque, et pour l'observation des comportements et des hémopathies les statuts des porcs, à l'aide de tests complets de comptage de sang.
Remarque: Les intervalles de paramètres pour minipigs cliniquement sains sont 11-29 / min pour le taux de respiration, 68-98 / min pour la fréquence cardiaque, et 37-38 ° C pour la température du corps.
- Fournir des animaux cliniquement normaux pour des examens physiques, qui comprennent la température du corps, la fréquence respiratoire, et la fréquence cardiaque, et pour l'observation des comportements et des hémopathies les statuts des porcs, à l'aide de tests complets de comptage de sang.
- Enlevez toute la literie comestible de la cage au cours de la période de jeûne préopératoire de 6-12 h prior à l'administration de l'anesthésie pour les jeunes et les adultes miniporcs, 3 heures de jeûne doit être observé pour les nouveau-nés. Fournir de l'eau potable jusqu'à ce que le temps de l'anesthésie.
2. Préparation des animaux pour l'anesthésie
- Medicate les miniporcs avant l'administration de l'anesthésie avec de l'acépromazine (0,1 mg / kg), médétomidine (0,03 mg / kg), et de l'atropine (0,04 mg / kg).
- Injecter tous les médicaments par voie intramusculaire (IM) en utilisant une aiguille 21 G avec une longueur d'au moins 30 mm pour minipigs adultes. Effectuer l'injection IM 1-3 cm derrière l'oreille dans le muscle cervical latéral ou dans le muscle de la cuisse.
Remarque: Effectuez toutes les procédures sans susciter la peur ou le stress chez les animaux ou nécessitant une manipulation brutale pour injecter en toute sécurité la prémédication.
- Injecter tous les médicaments par voie intramusculaire (IM) en utilisant une aiguille 21 G avec une longueur d'au moins 30 mm pour minipigs adultes. Effectuer l'injection IM 1-3 cm derrière l'oreille dans le muscle cervical latéral ou dans le muscle de la cuisse.
- Placez les miniporcs dans une position dorsale-allongée.
- Quinze minutes après l'administration de la prémédication, initier une anesthésie à l'aide de 1,5% d'isoflurane administrationenre- par inhalation.
- Continuer l'inhalation d'isoflurane (1,5%) à travers un tube endotracheal, suivi d'une augmentation de la concentration de 2,5%, avec de l'oxygène (1,5 L / min) en tant que gaz porteur.
- Surveiller en permanence le rythme cardiaque, la température corporelle, et percutanée saturation en oxygène du sang (SpO 2) des miniporcs pendant l' anesthésie. Utiliser une couverture à circulation d'eau à une température de 38-39 ° C pour maintenir la température corporelle. Appliquer une pommade ophtalmologique pour protéger les yeux de sécher pendant l'anesthésie.
- Suivez la classification de Guedel pour évaluer la profondeur de l' anesthésie 13.
3. Préparation de cellules d'isolement et de culture
- Cultiver les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et du liquide synovial, de préparer 500 ml de milieu Eagle modifié de pointe Dulbecco (à ADMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de Glutamax, 10 ng / ml de croissance des fibroblastes basique faitr (bFGF), et 1,0% de pénicilline-streptomycine (10000 UI et 10.000 pg / ml, respectivement, de Pen-Strep).
- Incuber la ADMEM à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 dans un incubateur à CO2.
- Préparer 500 ml de tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS) en suivant les instructions du fabricant pour l'isolement de cellules et de lavage.
4. La collecte de moelle osseuse de la Minipigs
- Sélectionnez une zone d' environ 15 x 15 cm en taille sur la crête iliaque (Figure 1), et enlever les poils de cette zone à l' aide de rasoirs de sécurité stérilisés ou tondeuses électriques. Une fois que le porc miniature est positionnée, alternativement frotter le site de procédure à trois reprises avec des agents de stérilisation suivants: povidone iode et 70% d'éthanol. Après la zone est complètement sec, appliquer des champs stériles.
- Prérevêtement la seringue de 10 ml avec 100 U / ml d'héparine par rinçage avec 3 - 4 ml d'héparine avant ejecting l'agent anti-coagulant.
Remarque: Effectuez cette étape pour éviter la coagulation dans la seringue lors de l'aspiration de la moelle osseuse. - Extraire un minimum de 5 ml de la moelle osseuse de l'os iliaque du porc miniature, sous anesthésie, à l'aide d'un extracteur de moelle osseuse (3,0 x 100 mm) fermement fixé à l'héparine prérevêtu seringue de 10 ml.
5. Isolement des cellules extraites de la moelle osseuse et de la culture in vitro
- Isoler les cellules de la moelle osseuse extraite.
- Diluer la moelle osseuse extraite avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 ml à la température ambiante.
- Ajouter 3 ml de milieu de centrifugation de densité (Ficoll-Paque) pour le tube conique de 15 ml.
- Diluer une couche de 4 ml de la moelle osseuse avec du DPBS, qui est placé sur le support de centrifugation par densité, sans mélange et on centrifuge à 400 x g pendant 40 min à température ambiante.
- Récolter la couche de cellules mononucléaires(EMN) à partir de la couche leucocytaire entre les deux couches contenant le plasma (couche supérieure) et le support de centrifugation de densité (couche inférieure), et transférer les PTM dans un tube de 15 ml conique.
- Diluer les multinationales transférés avec 7 - 8 ml de DPBS et centrifuger eux à 500 × g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec DPBS.
- Suspendre le culot de cellules dans 2 ml de ADMEM et le transférer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm. Incuber la boîte de culture à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2.
- La culture in vitro de cellules isolées à partir de moelle osseuse.
- Au bout de 48 h, aspirer le milieu avec les cellules qui ne sont pas attachées à la cuvette, et remplacer 2 ml de la ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Changer le milieu tous les jours tiers.
- À 70 - 80% de confluence, laver les cellules avec du DPBS, les dissocier avec 1 ml de 0,25%trypsine / EDTA, et incuber à 37 ° C pendant 3 - 5 min jusqu'à ce que les cellules se détachent.
- Récolter les cellules en utilisant 10 ml de ADMEM, de les transférer dans un tube conique de 15 ml, et on les centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant.
- Suspendre les cellules récoltées dans 1 ml de ADMEM frais et les compter en utilisant un hémocytomètre.
- Placer les cellules dans un 5 - 5 x 10 / 25T fiole contenant 7,5 ml de 4 ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Changer le support tous les trois jours.
6. Collection de liquide synovial des Minipigs
- Semblable à la procédure d'aspiration de la moelle osseuse, sélectionnez une zone appropriée d'environ 15 x 10 cm (longueur / largeur) sur l'articulation du fémur, et enlever les poils à l'aide des rasoirs de sécurité stérilisés ou tondeuses électriques, suivre des procédures de désinfection (étape 4.1).
- Insérer une seringue de 3 ml avec une 23 Gaiguille dans l'articulation après les repères de palpation (rotule et le tibia crête).
- Appliquer une aspiration douce aux seringues pour l'aspiration du liquide synovial dans l'articulation. Le volume approximatif de liquide synovial prélevé chez un joint est de 0,5 - 1 ml, mais cela varie en fonction de la taille du porc miniature ou l'articulation. Rincer par du DPBS dans la cavité synoviale si le volume recueilli du liquide synovial est trop petit.
- Retirer immédiatement la seringue pour éviter la contamination par le sang.
7. Cellule d' isolement du liquide synovial Collectées et culture in vitro
- Isoler les cellules à partir du liquide synovial aspiré.
- On dilue le liquide synovial aspiration avec un volume égal de DPBS dans un tube conique de 15 ml à la température ambiante.
- Pour éliminer les débris, filtrer le liquide synovial dilué en utilisant une cellule de nylon tamis de 40 um.
- Ajouter 10 ml de DPBS dans le tube contenant la synoviale filtréefluide et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec DPBS.
- Suspendre le culot de cellules dans 2 ml de ADMEM, placer les cellules sur une 2 - boîte de culture tissulaire de 3 x 10 5 cellules / 35 mm avec 2 ml de ADMEM et incuber à 38,5 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 .
- Répétez l' étape 5.2 pour la culture in vitro des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial isolées.
8. Post-procédure de soins des Minipigs
- Si nécessaire, fermez la peau au niveau du site d'injection d'extraction de moelle osseuse avec une seule suture à l'aide d'une agrafeuse de la peau, après la collecte de la moelle osseuse.
- Une fois la procédure terminée, administrer une injection intramusculaire d'enrofloxacine (5 mg / kg) et le méloxicam (0,2 mg / kg) aux miniporcs une fois par jour pendant 3 jours.
- Après la procédure est terminée, désinfecter la moelle osseuse et synovial site de collecte de fluideavec 0,1% de povidone iodée une fois par jour pendant 3 jours. Observer attentivement tous les jours pour surveiller les signes de complications (par exemple, de l' enflure, du pus, ou rougeur).
9. Cellule phénotypage par cytométrie en flux
- Lorsque les cellules souches mésenchymateuses sont de 70 - 80% confluentes à passages 3 - 5, laver les cellules avec du DPBS et les traiter avec 1 ml de 0,25% (v / v) trypsine / EDTA. Ensuite, les incuber à 37 ° C pendant 3 à 5 min jusqu'à ce que les cellules sont décollées.
- Récolter les cellules en utilisant 10 ml de DPBS, de les transférer dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger eux à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Jeter la solution surnageante.
- Pour fixer les cellules, suspension le culot cellulaire dans 10 ml d'une solution de formaldéhyde à 3,7%, et les conserver à 4 ° C pendant un jour avant l'analyse.
- Un jour après la fixation, laver les cellules deux fois avec du DPBS en utilisant une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
- Suspension le culot cellulaire dans 4 mlde DPBS, qui est additionné de 1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA), et incuber le culot pendant 1 heure à 4 ° C pour bloquer les interactions à médiation de Fc non spécifique.
- Distribuer des aliquotes de 500 ul de la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 ml.
- Pour les anticorps non conjugués (CD29 et Vimentin), laver les cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min. Jeter la solution surnageante.
- Suspension le culot cellulaire dans 500 pi d'une dilution 1: 100 de l'anticorps primaire, et incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec 1% de sérum-albumine bovine par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
- Suspension le culot cellulaire dans 500 pi d'une dilution 1: 100 de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et un anticorps secondaire incuber pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
- Pour les anticorps conjugués au FITC (Isotype, CD34, CD44 et CD45), laver les cellules par centrifution à 300 × g pendant 3 min. Jeter la solution surnageante.
- Suspension le culot cellulaire dans 500 pi de 1: 100 d'anticorps conjugué au FITC et on incube pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
- Pour les deux conditions de coloration, laver les cellules deux fois avec DPBS par centrifugation à 300 g pendant 5 min à chaque fois. Jeter la solution surnageante.
- Suspendre les cellules dans 500 ul de DPBS, de les transférer dans un 5 ml tube rond-bas, et d' analyser les résultats en utilisant un cytomètre de flux 8.
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Representative Results
Mise en place des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et le liquide synovial de Minipigs
MSCs ont été isolés avec succès à partir de l'os articulations synoviales articulaires des miniporcs osseuse et élargis et in vitro (Figure 2). Seringue d' aspiration du liquide synovial est simple, et il est possible d'obtenir des cellules adhérentes suffisantes pendant la culture in vitro des cellules primaires. La morphologie des cellules souches mésenchymateuses synovial fluide dérivé est similaire à celle des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées, et les deux cellules souches mésenchymateuses ont une forme de broche et sont fibroblastique de manière homogène adhérente. Ils ont observé une expression positive pour la phosphatase alcaline (AP) coloration, après la troisième sous-culture était complète.
Évaluation du phénotype cellulaire des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et du liquide synovialde Minipigs
Les dosages des marqueurs de la surface cellulaire ont été réalisées pour créer un phénotype des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse et du fluide synovial dérivés de miniporcs. Les deux types de cellules souches mésenchymateuses expriment des quantités importantes des marqueurs de surface de cellules positives, telles que CD29, CD44, et la vimentine (≥96 - 99% des cellules positives), tandis que l'expression de CD34 et CD45 ont été négatifs et faible (≤2% du cellules positives) (figure 3). Ces résultats étaient identiques à ceux obtenus à partir de cellules souches mésenchymateuses distinctes, comprenant des cellules isolées à partir du liquide synovial, et il n'y avait pas de différences significatives dans les marqueurs de surface des cellules entre ces cellules souches mésenchymateuses. Les cellules isolées de la moelle osseuse et le liquide synovial ont été confirmés comme MSCs dans notre précédente étude 8. Deux marrow- osseuse et MSCs de liquide synovial provenant exprimé facteurs de transcription de cellules souches (Oct3 / 4, Nanog et Sox2); En outre, une différenciation in vitro la capacité hcomme cela a été confirmé non seulement dans la lignée mésenchymateuse (ostéocytes, les adipocytes, et chondrocytes), mais aussi des cellules nerveuses par la coloration et les détections de l' expression génique spécifique à une cellule 8 cytochimique.
Figure 1. Localisation de la crête iliaque de l'minipig. La flèche rouge représente le site sur la crête iliaque utilisé pour la collecte de la moelle osseuse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. MSCs dérivées de la moelle osseuse et le liquide synovial des miniporcs. (A) La morphologie homogène des cultures primaires de cellules souches mésenchymateuses ont révélé une forme fibroblastique. (B) Coloration avec un mélange de5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate et nitro tétrazolium (BCIP / NBT) ont révélé une activité AP dans les MSCs au passage bar 3. Echelle: 100 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse des marqueurs de surface cellulaire des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse et le liquide synovial des miniporcs au passage 3. Les marqueurs de surface cellulaire des cellules souches mésenchymateuses ont été identifiés en utilisant une cytométrie de flux et de cellules souches mésenchymateuses ont été identifiés comme étant positifs pour CD29, CD44 et vimentine et négatives pour CD34 et CD45. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Minipigs ont été utilisés pour établir des MSCs l'isolement de la moelle osseuse et le liquide synovial. Pour éliminer diverses conditions physiologiques, telles que l'âge, le sexe et la maladie, minipigs de donneurs de fond isogéniques ont été choisis pour évaluer avec précision la caractérisation dépend de la source de la cellule. Les porcs sont connus pour être anatomiquement, physiologiquement et génétiquement semblables aux humains, et en particulier, minipigs peuvent produire des organes de taille appariés; par conséquent, ils peuvent être utilisés comme une espèce de substitution des donateurs pour la xénotransplantation 14,15. En ce qui concerne la propriété immunomodulatrice récemment suggéré de MSCs, indoleamine 2, 3-dioxygénase (IDO) et l'oxyde nitrique synthase (NOS) ont été utilisés avec MSCs de médiation immunosuppression, qui est spécifique de l' espèce, bien que MSCs de porcs et les humains ont la même IDO 9 . Ainsi, un modèle de porc comme donneur MSCs pourrait fournir des informations importantes sur les réponses immunitaires des cellules souches mésenchymateuses pour les thérapies humaines. En outre, la recherche de la tige porcineles cellules jouent un rôle important dans la compréhension biologique des processus in vitro et leurs diverses applications précliniques chez les humains 16,17. La moelle osseuse et du liquide synovial peuvent être récoltées de façon non invasive à partir miniporcs. L'ensemble de la procédure, de l'anesthésie à un prélèvement d'échantillon, réduit le niveau des organes systémiques ou locaux le stress; par conséquent, minipigs peuvent être utilisés comme receveurs pour la transplantation autologue. Dans cette expérience, les MSC ont été isolées de la moelle osseuse et le liquide synovial des miniporcs, sur la base de la confirmation de MSCs synoviale fluides dérivées avec des capacités d'immunosuppression dérivées d'un modèle de PR de la souris dans une étude précédente 8
Collection de moelle osseuse à partir des Minipigs
Chez le porc, les cellules souches adultes dérivées de la moelle osseuse sont multipotentes et ont induit une néovascularisation et la régénération des cardiomyocytes. L'âge d'un donneur est associé à une teneur accrue en matières grasses etdiminution de la prolifération et la différenciation de la moelle osseuse; Par conséquent, la moelle osseuse ne sont pas la meilleure source de cellules souches mésenchymateuses chez les animaux âgés. La crête iliaque dans minipigs est le site préféré pour l'isolement du MSC de moelle osseuse dérivés parce qu'elle est large et est un site de procédure à faible risque pour les dommages du nerf sciatique. Dans le cas des miniporcs âgés ou en surpoids, les muscles épais de graisse enrichi peuvent être présents sur la crête iliaque. Dans de telles circonstances, une incision de coups de couteau sur la peau est nécessaire et l'aiguille de biopsie de la moelle osseuse doit être insérée correctement, ce qui peut être difficile à appliquer à la crête iliaque. Le défaut de trouver le site de biopsie correcte peut conduire à des aspirations de moelle osseuse ont échoué parce que l'aiguille est bloquée par l'os ou peut ne pas être en mesure d'atteindre l'os à l'intérieur de la crête iliaque osseuse. Par conséquent, l'aiguille de biopsie doit être vérifiée correctement, et la connaissance de l'épaisseur des tissus mous et le cortex de l'os de la crête iliaque est nécessaire avant de commencer la collecte d'échantillons.
Aspiration du liquide synovial des articulations de Minipigs
synovie existe dans la cavité des articulations synoviales, et le volume du liquide synovial est généralement augmentée dans les articulations enflammées. MSCs synovial fluides dérivés sont prises à partir de sites candidats préférés pour la régénération du cartilage, à la fois in vivo et in vitro. En outre, ils se sont avérés induire des propriétés immunomodulatrices dans la PR 8. Le liquide synovial est non seulement une source facilement accessible, mais a également des propriétés mésenchymateuses précieuses. Limites de l'utilisation du liquide synovial comme une source de cellules souches mésenchymateuses sont les différents volumes trouvés dans les articulations en fonction des tailles variables et des états pathologiques des articulations et de la difficulté à l'aide d'une seringue de 3 ml pour l'aspiration du liquide synovial dans les articulations. Par conséquent, la taille de la seringue doit être de 5 - 10 ml avec une pression élevée. En outre, le rinçage du liquide synovial avec 1 - 2 ml de DPBS à partir d'une seringueest préférable. En utilisant ce procédé, un grand nombre de cellules peut être obtenue, même de petits espaces dans les joints.
Caractérisations des MSCs os marrow- et synovial fluides dérivés de Minipigs
Chez l' homme, les morphologies des cellules souches mésenchymateuses synovial-fluides et aux synovial membrane dérivées de patients souffrant d'arthrose sont similaires , mais plus étroite que la morphologie des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées 12. Toutefois, dans des cultures in vitro, les morphologies des deux MSCs synovial fluide et dérivés de moelle osseuse cellules souches mésenchymateuses dérivées ont été observés à être similaires dans cette expérience. Dans l' étude précédente , les chercheurs, la capacité de prolifération des cellules souches mésenchymateuses synovial fluide dérivés est élevée, comparée à celle de la moelle osseuse dérivées de cellules souches mésenchymateuses 8.
MSCs sont établies à partir de diverses sources de tissus de donneurs adultes; tissus-sources dérivés MSCs donc non effractive obtenus sont précieux pour cellulaire autologue souches eerapy. La source cellulaire dépend des capacités et des caractérisations de la maladie ou du but de la thérapie par les cellules souches. Chez les porcs, les cellules progénitrices adultes dérivées de la moelle osseuse sont multipotentes et ont induit une néovascularisation et la régénération des cardiomyocytes 18,19. MSCs ont principalement été isolées à partir de moelle osseuse, mais aussi du périoste, les muscles squelettiques, la synovie, le cordon ombilical et des tissus dentaires, bien que l'obtention de cellules à partir de ces tissus est difficile et peut nécessiter des interventions chirurgicales supplémentaires pour les patients. Cependant, le volume de liquide synovial augmente habituellement dans les articulations de l'arthrose ou de patients atteints de PR, et des biopsies de ces fluides synoviaux accrus sont utilisés pour diagnostiquer et traiter les patients. Le nombre de cellules souches mésenchymateuses augmente également dans le liquide synovial des patients atteints de dégénérescence du cartilage et de l' arthrose 20.
Dans cette étude, les phénotypes cellulaires de l'os et marrow- MSCs synovial fluide dérivés ont été évalués, und MSCs aussi présenté des niveaux similaires d'expression des marqueurs de surface cellulaire. Par conséquent, des cellules isolées à partir du liquide synovial et confirmées comme MSCs ont des phénotypes similaires à MSCs moelle osseuse dérivés dans miniporcs. la recherche précédente, les chercheurs a évalué d'autres marqueurs de surface cellulaire, telles que CD90 et de la classe majeure histocompatible et II (CMH II), et a confirmé la capacité de différenciation de lignées multiples dans les ostéocytes, les adipocytes, les chondrocytes et les neurones de synovial fluide MSCs -derived de minipigs 8. Chez l'être humain, le profil de l' antigène de surface cellulaire des cellules souches mésenchymateuses synovial fluide dérivé est similaire à celle des cellules souches mésenchymateuses-synoviale et aux membranes 2,21 moelle osseuse dérivées. Cependant, CD34 et CD45 expressions ne sont pas détectés dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial dans temporo patients souffrant de troubles articulaires. Ainsi, le micro-environnement de l'articulation peut influer sur le phénotype cellulaire des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial. Dans cette expérience, les cellules ont été obtenues à partir de l'os marrow et le liquide synovial des miniporcs en utilisant des méthodes non invasives. Les deux types de cellules cultivées in vitro ont été confirmés comme MSCs, et ils avaient des phénotypes cellulaires similaires et des caractéristiques mésenchymateuses compatibles partagées. Cependant, MSCs synovial fluide dérivés ont montré un plus grand potentiel pour la thérapie de cellules souches autologues non seulement le cartilage et la régénération osseuse, mais aussi pour l'immunosuppression de l'arthrose et la polyarthrite rhumatoïde.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
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