Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Summary

Ein Protokoll zur Etablierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs), die aus der Synovialflüssigkeit und dem Knochenmark von Minischweinen isoliert und nicht-invasiv mittels Spritzenaspiration entnommen wurden, wird vorgestellt. Die zelluläre Phänotypisierung wurde mittels Durchflusszytometrie nach Zellisolierung und in vitro Kultivierung von Knochenmark und Synovialflüssigkeiten, die aus MSCs gewonnen wurden, durchgeführt.

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden nach Isolierung aus verschiedenen Gewebequellen, einschließlich Knochenmark und Synovialflüssigkeit, etabliert. Kürzlich wurde berichtet, dass MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit gewonnen werden, ein Differenzierungspotenzial für mehrere Linien und immunmodulatorische Merkmale aufweisen, was darauf hindeutet, dass diese Zellen für das Tissue Engineering und systemische Behandlungen verwendet werden können. In dieser Studie wird ein Protokoll für die einfache und nicht-invasive Isolierung von MSCs aus dem Knochenmark und der Synovialflüssigkeit von Minischweinen vorgestellt, um Zelloberflächenmarker für die Zellphänotypisierung und in vitro-Kultivierung zu analysieren. Mit Hilfe von geschlechtsreifen sechs Monate alten Minischweinen wurde mit einem Knochenmarkextraktor Knochenmark aus dem Beckenkammknochen entnommen und die Synovialflüssigkeit aus dem Femorotibialgelenk aspiriert. Die Verfahren zur Entnahme von Proben aus beiden Quellen waren nicht-invasiv. Es werden Protokolle für die wirksame Isolierung von MSC aus geernteten Zellquellen und für die Schaffung von In-vitro-Kulturbedingungen zur Erweiterung stabiler MSC aus Minischweinen und die Anwendung systemischer autologe Behandlungen bereitgestellt. Für die Zellphänotypisierung wurden die Zelloberflächenmarker beider Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. In den Ergebnissen wurden die MSCs aus der Synovialflüssigkeit der Minischweine isoliert und zeigten, dass MSCs, die aus der Synovialflüssigkeit stammen, eine ähnliche Morphologie und einen ähnlichen Zellphänotyp aufweisen wie MSCs aus dem Knochenmark. Daher ist nicht-invasiv gewonnene Synovialflüssigkeit eine wertvolle Quelle für MSCs.

Introduction

Multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) können in mesenchymale Zelllinien eingeteilt werden, und MSCs wurden aus verschiedenen Gewebequellen etabliert und isoliert, wie z.B. aus Knochenmark, Nabelschnüren, Plazenten, Fettgewebe, Hauthaut, Skelettmuskulatur, Haarfollikeln, Synovialmembranen und Zähnen^1-5. Gegenwärtig wurde die Aufmerksamkeit auf synoviale MSCs gelegt, da diese Zellen bei der Behandlung von Gelenkerkrankungen wie Knochenbruch, Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis (RA) helfen können, und aufgrund des regenerativen Potenzials von MSCs in geschädigtem Knorpel oder Knochen können sie auch bei der Behandlung von Immunmodulation oder Auto....

Protocol

Tierversuche wurden von der Animal Center for Biomedical Experimentation in Gyeongsang National University zugelassen.

1. Die Vorbereitungen für die Tierordnung

1. Bereiten Sie die erwachsenen weiblichen minipigs für die nicht-invasive Sammlung von MSCs aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit. Führen Sie die klinische Untersuchung der minipigs einen Tag vor der Anästhesie und Probenentnahme.
   1. Geben Sie klinisch unauffälligen Tiere für körperliche Untersuchungen, die Körpertemperatur, Atemfrequenz umfassen, und die Herzfrequenz und für die Beobachtung des Verhaltens der Schweine und hämatologischen Zustände, unter Verwend....

Results

Gründung von MSCs aus dem Knochenmark und Synovialflüssigkeit von Minipigs Abgeleitet

MSCs wurden aus dem Knochenmark und articular synovialen Gelenke der minipigs erfolgreich isoliert und in vitro (2) erweitert. Spritze Aspiration von Synovialflüssigkeit ist einfach, und es ist möglich , eine ausreichende adhärenten Zellen während der in vitro Kultivierung der Primärzellen z.......

Discussion

Minipigs wurden verwendet, MSCs Isolierung aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit zu etablieren. Zu verschiedenen physiologischen Bedingungen, wie Alter, Geschlecht und Krankheits, Minipigs von isogenen Hintergrund Spender beseitigen wurden ausgewählt, um genau die Zellquelle abhängigen Charakterisierung auszuwerten. Schweine sind bekannt anatomisch, physiologisch und genetisch ähnlich wie beim Menschen zu sein, und insbesondere minipigs können Größe abgestimmte Organe produzieren; daher können sie als Ersatz Donator.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fortschrittliches Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC-Kulturmedium
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14190-144	Zellwaschmedium, frei von Ca2+/Mg2+
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	16000-044	Bestandteil des MSC-Mediums
Glutamax	Gibco	35050-061	Bestandteil des MSC-Mediums
Penicillin/Streptomycin	Gibco	10378-016	Bestandteil des MSC-Mediums
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Simga	F0291	Bestandteil des MSC-Mediums
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A6003	Bestandteil des MSC-Mediums
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Reagenz für die Zelldissoziation
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Bestandteil des MSCs Medium
Isotyp Antikörper	BD Pharmingen	BD 550616	Isotyp Kontrolle
CD29 Antikörper	BD Pharmingen	BD 552369	Integrin beta-1 MSCs Marker
CD44 Antikörper	BD Pharmingen	BD 553133	Zelloberfläche Glykoprotein MSCs Marker
CD45 Antikörper	BD Pharmingen	BD 340664	Marker für hämatopoetische Stammzellen
CD34-Antikörper	BD Pharmingen	BD 555821	Marker für hämatopoetische Stammzellen
CD90 Antikörper	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1-Membran-Glykoprotein MSCs-Marker
MHC Klasse II Antikörper	Santa Cruz	SC-32247	Antigen-präsentierender Zellmarker
Vimentin Antikörper	Sigma	Sigma-S6389	Typ III Zwischenfilament MSCs-Marker
Alkalische Phosphatase	Promega	S3841	Mischung aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblautetrazolium (NBT)
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Dichtegradientenzentrifugation
Zellsieb	BD Falcon	352340	40 µ m Nylon-Zellsieb
15 ml konisches Polystyrol-Röhrchen	BD Falcon	351095	Probenentnahme und Zellisolierung
35 mm Schalen	Nunc	153066	Zellkulturschale
Knochenmarkextraktor	GmbH Medizintechnologie, Deutschland	1145-1W010	TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Hämatokritkammer	Marinfeld	640130	Zellzählkammer
Atropin	Jeil Pharmaceutical Co, Südkorea		Atropinsulfat Hydrat
Acepromazin	Samu Median, Südkorea		Präanästhetikum Beruhigungsmittel und Antiemetikum
Medetomidin	Pfizer		Anästhetikum und Analgetikum
Enrofloxacin	Bayer Healthcare, Deutschland		Antibiotika
Meloxicam	über Veterinärmedizin, Argentinien	Entzündungshemmendes und schmerzstillendes Medikament
	Korea Pharma, Südkorea		Sterilisationsmittel
Ethanol	Sigma	E7023	Sterilisationsmittel
Heparin	Sigma	H3393	Antikoagulationsmittel
Formaldehyd	Sigma	F8775	Zellfixierungsmittel
Ophthalmologische Salbe	Pfizer		Oxytetracyclin HCl mit Polymyxin B-Sulfat
Zirkulierende Wasserdecke	Gaymar Industries		Erwärmungssystem während und nach der Anästhesie
Hautklammergerät	Covidien, USA		Nahthautverschluss
CO2 Inkubator	Thermo Forma	3111	Zellkulturausrüstung
Durchflusszytometer	BD Biosciences		Zellanalysator
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	T-Typ	Miniatur-Molch