Protocol
Experimentos em animais foram autorizados pelo Centro animal for Biomedical Experimentação da Universidade Nacional de Gyeongsang.
1. Preparativos para o Procedimento de animal
- Prepara-se o adulto porquinhos do sexo feminino para a recolha não-invasivo de MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Realizar o exame clínico dos porquinhos um dia antes da anestesia e coleta de amostras.
- Fornecer animais clinicamente normais de exames físicos, que incluem a temperatura corporal, freqüência respiratória e freqüência cardíaca, e pela observação do comportamento e hematológicos status dos porcos, utilizando hemograma completo.
Nota: intervalos de parâmetros para miniporcos clinicamente saudáveis são 11-29 / min para a taxa de respiração, 68-98 / min para o ritmo cardíaco, e 37-38 ° C para a temperatura do corpo.
- Fornecer animais clinicamente normais de exames físicos, que incluem a temperatura corporal, freqüência respiratória e freqüência cardíaca, e pela observação do comportamento e hematológicos status dos porcos, utilizando hemograma completo.
- Remover todas as camas comestível da gaiola durante o período de jejum pré-operatório de 6 - prio 12 hrr para a administração de anestesia para jovens e adultos minipigs, 3 horas de jejum deve ser observado para os recém-nascidos. Fornecer água potável até o momento da anestesia.
2. Preparação dos animais para anestesia
- Medicar os porquinhos antes da administração da anestesia com acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), e atropina (0,04 mg / kg).
- Injectar todos os medicamentos por via intramuscular (IM) utilizando uma agulha G 21 com um comprimento de pelo menos 30 mm para porquinhos adultos. Realizar a injecção IM 1-3 cm atrás da orelha no músculo cervical lateral ou no músculo da coxa.
Nota: Execute todos os procedimentos, sem provocar medo ou estresse nos animais ou que exijam manuseio brusco para injetar com segurança a pré-medicação.
- Injectar todos os medicamentos por via intramuscular (IM) utilizando uma agulha G 21 com um comprimento de pelo menos 30 mm para porquinhos adultos. Realizar a injecção IM 1-3 cm atrás da orelha no músculo cervical lateral ou no músculo da coxa.
- Coloque os porquinhos em posição dorsal-deitada.
- Quinze minutos após a administração da medicação pré-anestésica, iniciar a anestesia utilizando 1,5% de administração de isofluranoregis- por inalação.
- Continuar a inalação de isoflurano (1,5%) através de um tubo endotraqueal, seguido de um aumento na concentração de 2,5%, com o oxigénio (1,5 L / min) como o gás portador.
- Monitorar continuamente a frequência cardíaca, temperatura corporal, e saturação de oxigênio no sangue percutânea (SpO2) dos porquinhos durante a anestesia. Usar um cobertor de água em circulação a uma temperatura de 38-39 ° C para manter a temperatura corporal. Aplicar uma pomada oftalmológica para proteger os olhos de secar durante a anestesia.
- Siga classificação de Guedel para avaliar a profundidade da anestesia 13.
3. Preparativos para o isolamento de células e Cultivo
- Para cultivar as MSC derivadas de medula óssea e de fluido sinovial, preparar 500 ml de meio de Dulbecco modificado avançada águia (ADMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico factoR (bFGF), e 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI e 10000 ng / mL, respectivamente, Pen-Strep).
- Incubar a ADMEM a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 num incubador de CO 2.
- Preparar 500 ml de solução salina de tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) de acordo com as instruções do fabricante para o isolamento de células e de lavar roupa.
4. Recolha de Medula Óssea a partir do miniporcos
- Seleccionar uma área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamanho na crista ilíaca (Figura 1), e remover o cabelo a partir desta área usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou corta-eléctricos. Uma vez que o minipig está posicionado, alternadamente esfregar o local procedimento três vezes com os seguintes agentes de esterilização: iodopovidona e 70% de etanol. Depois que a área está completamente seco, aplique campos estéreis.
- Pré-revestimento da seringa de 10 ml com 100 U / ml de heparina, enxaguando-a com 3 - 4 ml de heparina antes ejecting o agente anti-coagulante.
Nota: Execute esta etapa para evitar a coagulação na seringa durante a aspiração de medula óssea. - Extrair um mínimo de 5 ml de medula óssea a partir do osso da crista ilíaca de minipig sob anestesia, utilizando um extractor de medula óssea (3,0 × 100 mm) firmemente ligado à heparina pré-revestidos seringa de 10 ml.
5. Isolamento de células extraídas da medula óssea e cultivo in vitro
- Isolar as células da medula óssea extraída.
- Dilui-se a medula é extraída com um volume igual de DPBS num tubo cónico de 15 ml à temperatura ambiente.
- Adicionar 3 ml de meio de centrifugação de densidade (Ficoll-Paque) para o tubo de 15 ml.
- Dilui-se uma camada de 4 ml de medula óssea com DPBS, que é colocado no suporte de centrifugação de densidade, sem misturar, e centrifuga-se que a 400 x g durante 40 min à temperatura ambiente.
- Colher a camada de células mononucleares(PTM) do creme leucocitário entre as duas camadas contendo o plasma (camada superior) e os meios de centrifugação de densidade (camada inferior), e transferir as multinacionais em um tubo de 15 ml.
- Diluir os EMNs transferidos com 7 - 8 mL de DPBS e centrifugar-los a 500 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS.
- Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM e transferi-lo para um prato de cultura de tecidos de 35 mm. Incubar a placa de cultura a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2.
- O cultivo in vitro de células isoladas a partir de medula óssea.
- Após 48 horas, aspirar o meio com as células que não se ligaram aos prato, e substitui a 2 ml de ADMEM e incubar-lo a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Alterar o meio em cada três dias.
- Na 70 - 80% de confluência, lavar as células com DPBS, dissociar-los com 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, e incubar a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células de separar.
- Colher as células por meio de 10 ml de ADMEM, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante.
- Suspender as células colhidas em 1 ml de ADMEM fresco e contá-los usando um hemocitômetro.
- Colocar as células em de 5 - 7,5 x 10 5 / 25T balão contendo 4 ml de ADMEM e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Mudar o meio cada três dias.
6. Recolha de líquido sinovial das miniporcos
- Semelhante ao procedimento de aspiração da medula óssea, selecione uma área adequada de aproximadamente 15 x 10 cm (comprimento / largura) sobre a articulação femoral, e remover o cabelo usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou clippers elétricos, siga por procedimentos de higienização (passo 4.1).
- Inserir uma seringa de 3 ml com um 23 Gagulha na articulação após os marcos de palpação (patela e da crista da tíbia).
- Aplicar sucção suave para as seringas para a aspiração do líquido sinovial na articulação. O volume aproximado de fluido sinovial recolhidas de uma junta é de 0,5 - 1 ml, mas isto varia de acordo com o tamanho do minipig ou da articulação. Lave através DPBS na cavidade sinovial, se o volume recolhido de fluido sinovial é muito pequeno.
- retirar imediatamente a seringa para evitar a contaminação com sangue.
7. cela de isolamento do Collected líquido sinovial e cultivo in vitro
- Isolar as células do fluido sinovial aspirado.
- Dilui-se o fluido sinovial aspirado com um volume igual de DPBS em um tubo de 15 ml à temperatura ambiente.
- Para remover os detritos, filtrar o fluido sinovial diluída usando um coador de células de nylon de 40? M.
- Adicionar 10 ml de DPBS para o tubo contendo o filtrado sinovialfluido e centrifugar-lo a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS.
- Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM, colocar as células em um 2 - prato de cultura de tecidos de 3 x 10 5 células / 35 mm, com 2 ml de ADMEM, e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 .
- Repita o passo 5.2 para o cultivo in vitro de MSCs derivadas do líquido sinovial isoladas.
8. pós-procedimento Cuidado dos miniporcos
- Se necessário, fechar a pele no local da injecção extractor de medula óssea com um único fio de sutura com agrafos da pele, após a recolha de medula óssea.
- Após o processo é completado, administrar uma injecção intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) e meloxicam (0,2 mg / kg) para os porquinhos uma vez por dia durante 3 dias.
- Após o processo é completado, desinfectar a medula óssea e o local de recolha de fluido sinovialcom 0,1% de iodo povidona, uma vez por dia durante 3 dias. Observe cuidadosamente diariamente para monitorar os sinais de complicações (por exemplo, inchaço, pus ou vermelhidão).
9. A fenotipagem celular utilizando Citometria de Fluxo
- Quando as MSCs são de 70 - 80% confluentes em passagens 3 - 5, lavar as células com DPBS e tratá-los com 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. Em seguida, incubam-los a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células são separadas.
- Colher as células utilizando 10 mL de DPBS, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar a solução sobrenadante.
- Para fixar as células, suspender o sedimento celular em 10 ml de uma solução de formaldeído a 3,7% e mantê-los a 4 ° C durante um dia antes da análise.
- Um dia após a fixação, lavar as células duas vezes com DPBS utilizando centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
- Suspende-se o sedimento de células em 4 mlde DPBS, que é suplementado com 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), e incuba-se o sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacções não específicas mediada por Fc.
- Distribuir alíquotas de 500 ul da suspensão de células em tubos de 1,5 ml.
- Para os anticorpos não conjugados (CD29 e vimentina), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante.
- Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição de 1: 100 do anticorpo primário e incubar por 1 h a 4 ° C.
- Lavar as células duas vezes com 1% de albumina de soro bovino por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
- Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição 1: 100 de conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
- Para os anticorpos conjugados com FITC (de isotipo, CD34, CD44 e CD45), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante.
- Suspende-se o sedimento celular em 500 uL de anticorpo a 1: 100 conjugado com FITC e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
- Para ambas as condições de coloração, lavar as células duas vezes com DPBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
- Suspender as células em 500 ul de DPBS, transferi-los para um tubo de 5 ml de fundo redondo, e analisar os resultados usando um citómetro de fluxo 8.
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Representative Results
Estabelecimento de MSCs derivadas da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos
MSCs foram isolados com sucesso a partir da medula óssea e das articulações sinoviais articulares dos porquinhos e expandidas in vitro (Figura 2). Seringa de aspiração de fluido sinovial é simples, e é possível obter células aderentes suficientes durante a cultura in vitro das células primárias. A morfologia das MSCs-sinovial derivada de fluido é semelhante à de MSC de osso derivadas de medula, e ambas as MSCs têm uma forma fuso fibroblástica e são homogeneamente aderente. Eles foram observados para ter uma expressão positiva para fosfatase alcalina (AP) coloração, após a terceira subcultura foi completa.
Avaliação do fenótipo celular de MSCs derivadas da medula óssea e do fluido sinovialde miniporcos
Ensaios dos marcadores de superfície celular foram realizadas para criar um fenótipo dos MSC de medula óssea e sinovial de líquido derivadas de porcos anões. Ambos os tipos de MSCs expressa quantidades significativas de marcadores de superfície de células positivas, tais como CD29, CD44, e vimentina (≥96 - 99% das células positivas), ao passo que as expressões de CD34 e CD45 foram negativos e baixo (≤2% do células positivas) (Figura 3). Estes resultados eram idênticos aos obtidos a partir de MSCs distintivas, incluindo as células isoladas a partir de fluido sinovial, e não houve diferenças significativas nos marcadores de superfície celular entre esses MSC. As células isoladas a partir de medula óssea e de fluido sinovial foram confirmados como MSCs no nosso estudo anterior 8. Ambos marrow- óssea e MSCs derivadas do líquido sinovial expressa fatores de transcrição de células-tronco (OCT3 / 4, NANOG, e Sox2); Além disso, uma capacidade de diferenciação in vitro hcomo foi confirmado não só para a linhagem mesenquimal (osteócitos, adipócitos, condrócitos e), mas também as células neurais por coloração citoquímica e detecções de expressão de genes específicos de células 8.
Figura 1. Localização da crista ilíaca do minipig. A seta vermelha representa o local na crista ilíaca utilizado para a coleta de medula óssea. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. MSC derivadas da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos. (A) A morfologia homogénea de culturas primárias de MSCs revelou uma forma fibroblástica. (B) Coloração com mistura de-5-bromo 4-cloro-3-indolil-fosfato e azul de tetrazólio nitro (BCIP / NBT) revelou atividade AP nos MSCs na passagem bar 3. Escala: 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise dos marcadores de superfície celular de MSC derivadas da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos a passagem 3. Os marcadores de superfície celular de MSC foram identificados usando uma análise de citometria de fluxo, e as MSCs foram identificados como sendo positivo para CD29, CD44 e vimentina e negativas para CD34 e CD45. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Miniporcos foram utilizados para estabelecer o isolamento MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Para eliminar várias condições fisiológicas, tais como idade, sexo, e as doenças, minipigs de isog�nicas doadores fundo foram escolhidos para avaliar com precisão a caracterização depende fonte de células. Os porcos são conhecidos por serem anatomicamente, fisiologicamente, e geneticamente semelhantes aos seres humanos, e em particular, podem produzir miniporcos órgãos pareados por tamanho; portanto, eles podem ser utilizados como um substituto espécies dadoras para xenotransplante 14,15. No que respeita à propriedade imunomodulador recentemente sugerido de MSCs, indoleamina 2, 3-dioxigenase (IDO) e sintase de óxido nítrico (NOS) foram usadas com MSCs para mediar a imunossupressão, que é específico da espécie, embora as MSCs a partir de porcos e os seres humanos têm o mesmo IDO 9 . Assim, um modelo suíno como um doador de MSCs pode fornecer insights importantes das respostas imunes de MSCs para terapias humanas. Além disso, a pesquisa da haste porcinecélulas desempenha um papel importante na compreensão dos processos biológicos in vitro e as suas várias aplicações pré-clínicos em humanos 16,17. A medula óssea e fluido sinovial pode ser colhida a partir de porcos anões de forma não invasiva. Todo o processo, desde a anestesia da coleta da amostra, reduziu o nível de estresse dos órgãos sistêmicos ou locais; Portanto, miniporcos podem ser utilizados como receptores para transplante autólogo. Nesta experiência, as MSC foram isoladas a partir da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos, com base na confirmação de MSCs-sinovial derivada de líquido com capacidades de imunossupressão derivados a partir de um modelo de ratinho RA num estudo anterior 8
Recolha de Medula Óssea a partir dos miniporcos
Nos suínos, as células progenitoras adultas derivadas da medula óssea são multipotentes e induziram neovascularização e regeneração de cardiomiócitos. A idade de um dador está associada com o aumento de conteúdo de gordura ediminuição da proliferação e diferenciação da medula óssea; por conseguinte, a medula óssea não é a melhor fonte de MSCs em animais idosos. A crista ilíaca em minipigs é o local preferido para o isolamento MSC de medula óssea derivada porque é amplo e é um site de procedimento de baixo risco de lesão do nervo ciático. No caso de miniporcos com idade ou com excesso de peso, espessura músculos enriquecido em gordura pode estar presente na crista ilíaca. Sob tais circunstâncias, uma incisão na pele facada é necessário e a agulha de biópsia de medula óssea deve ser inserido correctamente, o que pode ser difícil de aplicar na crista ilíaca. A falha em encontrar o local da biópsia correctas pode levar a aspirações de medula óssea falharam porque a agulha fica bloqueada pelo osso ou pode não ser capaz de chegar à medula óssea no interior da crista ilíaca. Portanto, a agulha de biópsia tem de ser devidamente verificadas, e no conhecimento de a espessura do tecido mole e do córtex do osso da crista ilíaca é necessária antes do início colecções de amostras.
A aspiração de líquido sinovial das articulações de miniporcos
O líquido sinovial existente na cavidade de articulações sinoviais, e o volume de fluido sinovial é geralmente aumentada nas articulações inflamadas. MSC-sinovial derivadas de fluidos são retirados locais candidatos preferidos para a regeneração da cartilagem, tanto in vivo como in vitro. Além disso, eles têm sido mostrados para eliciar propriedades imunomoduladoras na AR 8. O líquido sinovial não é apenas uma fonte de fácil acesso, mas também tem propriedades mesenquimais valiosos. As limitações do uso de fluido sinovial como uma fonte para o MSC são os diferentes volumes encontrados nas articulações, com base nos diferentes tamanhos e condições patológicas das articulações e a dificuldade na utilização de uma seringa de 3 ml, durante a aspiração de fluido sinovial das articulações. Por conseguinte, o tamanho da seringa deve ser de 5 - 10 ml com alta pressão. Além disso, a lavagem do fluido sinovial com 1 - 2 mL de DPBS a partir de uma seringaé preferível. Ao utilizar este método, pode ser obtido um grande número de células, mesmo a partir de pequenos espaços nas articulações.
Caracterizações dos MSCs Bone-marrow- e sinovial derivadas de líquido de miniporcos
Nos seres humanos, as morfologias das MSCs-sinovial dos Fluidos, da membrana sinovial-derivadas de pacientes de osteoartrite são semelhantes, mas mais estreitos do que a morfologia das MSCs com osso derivadas de medula 12. No entanto, em culturas in vitro, foram observadas as morfologias de ambas as MSCs-sinovial derivadas de fluido e MSC de medula óssea derivadas de ser semelhantes nesta experiência. No estudo anterior, os pesquisadores, a capacidade de proliferação das MSCs-sinovial derivadas de fluido foi alta, comparada com a de osso derivadas de medula MSCs 8.
MSCs são estabelecidas a partir de várias fontes de tecido em doadores adultos; Tissue-derivadas de MSC de origem, por conseguinte, de forma não invasiva obtidos são valiosos para células estaminais autóloga therapy. A fonte de células é dependente das caracterizações e as capacidades da doença ou efeitos da terapia de células estaminais. Em suínos, as células progenitoras adultas derivadas da medula óssea são multipotentes e ter induzido neovascularização e cardiomiócitos regeneração 18,19. MSC têm sido principalmente isolado a partir de medula óssea, mas também a partir do periósteo, músculos esqueléticos, membrana sinovial, cordões umbilicais, e tecidos dentais, embora a obtenção de células a partir destes tecidos não é fácil e pode exigir procedimentos cirúrgicos adicionais para os pacientes. No entanto, o volume de fluido sinovial aumenta geralmente nas articulações de doentes com RA ou osteoartrite, e biópsias do aumento dos fluidos sinoviais são usadas para diagnosticar e tratar pacientes. O número de MSCs também aumenta no fluido sinovial de pacientes com osteoartrite cartilagem degenerada e 20.
Neste estudo, foram avaliados os fenótipos de células de osso marrow- e MSCs sinovial-fluido-derivados, umad tanto MSCs apresentaram níveis semelhantes de expressão de marcadores de superfície celular. Portanto, as células isoladas a partir de fluido sinovial e confirmados como MSCs ter fenótipos semelhantes a MSCs osso derivadas de medula em miniporcos. pesquisas anteriores dos pesquisadores avaliaram outros marcadores de superfície celular, tais como CD90 ea classe principal histocompat�el e complexo II (MHC II), e confirmou a capacidade de diferenciação multi-linhagem para os osteócitos, adipócitos, condrócitos, e neurônios de sinovial de líquido MSCs -derived de minipigs 8. Nos seres humanos, o perfil de antigénio de superfície celular das MSCs-sinovial derivada de fluido é semelhante à de MSC-sinovial por membrana de 2,21 e de medula óssea derivadas. No entanto, CD34 e CD45 expressões não foram detectadas em MSCs derivadas de líquido sinovial em pacientes disfunção da articulação temporomandibular. Assim, o micro-ambiente na articulação podem afectar o fenótipo da célula de MSC derivadas a partir de fluido sinovial. Nesta experiência, as células foram obtidas a partir do osso MArrow e líquido sinovial de minipigs usando métodos não-invasivos. Ambos os tipos de células cultivadas in vitro foram confirmados como MSCs, e eles tinham fenótipos celulares semelhantes e compartilhadas características mesenquimais compatíveis. No entanto, as MSCs-sinovial fluidos derivados mostraram um maior potencial para a terapia de células-tronco autólogo, não só para a regeneração de osso e cartilagem, mas também para a imunossupressão de osteoartrite e artrite reumatóide.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
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