Protocol
Los experimentos con animales fueron autorizados por el Centro de Experimentación Animal para Biomédica en la Universidad Nacional de Gyeongsang.
1. Preparativos para realizar el procedimiento de Animales
- Preparar el adulto cerdos enanos hembra para la recogida no invasiva de las MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Realizar el examen clínico de los cerdos enanos un día antes de la anestesia y la recogida de muestras.
- Proporcionar los animales clínicamente normales para los exámenes físicos, que incluyen la temperatura corporal, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca y de la observación del comportamiento y hematológicos estados de los cerdos, utilizando pruebas de conteo sanguíneo completo.
Nota: los intervalos de parámetros para cerdos enanos clínicamente sanos son 11 a 29 / min para la velocidad de respiración, 68-98 / min para el ritmo cardíaco, y 37 a 38 ° C para la temperatura del cuerpo.
- Proporcionar los animales clínicamente normales para los exámenes físicos, que incluyen la temperatura corporal, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca y de la observación del comportamiento y hematológicos estados de los cerdos, utilizando pruebas de conteo sanguíneo completo.
- Retire la ropa de cama comestible a partir de la jaula durante el período de ayuno preoperatorio de 6 - 12 horas prior para la administración de la anestesia para cerdos enanos jóvenes y adultos, 3 h de ayuno debe ser observado para los recién nacidos. Proporcionar agua potable hasta el momento de la anestesia.
2. Preparación de los animales para la anestesia
- Medicar los cerdos enanos antes de la administración de la anestesia con acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), y atropina (0,04 mg / kg).
- Inyectar todos los medicamentos por vía intramuscular (IM) usando una aguja de 21 G con una longitud de al menos 30 mm para cerdos enanos adultos. Realizar la inyección IM 1-3 cm por detrás de la oreja en el músculo cervical lateral o en el músculo del muslo.
Nota: Realizar todos los procedimientos sin provocar miedo o estrés en los animales o que requieren una manipulación brusca para inyectar la medicación previa.
- Inyectar todos los medicamentos por vía intramuscular (IM) usando una aguja de 21 G con una longitud de al menos 30 mm para cerdos enanos adultos. Realizar la inyección IM 1-3 cm por detrás de la oreja en el músculo cervical lateral o en el músculo del muslo.
- Coloque los cerdos enanos en una posición dorsal-reclinada.
- Quince minutos después de la administración de la medicación previa, iniciar la anestesia utilizando 1,5% de administrador isofluranotrado por inhalación.
- Continuar la inhalación de isoflurano (1,5%) a través de un tubo endotraqueal, seguido de un aumento en la concentración de 2,5%, con oxígeno (1,5 L / min) como gas portador.
- Un seguimiento continuo de la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal, y la saturación de oxígeno en sangre percutánea (SpO 2) de los cerdos enanos durante la anestesia. Utilice una manta de agua circulante a una temperatura de 38-39 ° C para mantener la temperatura corporal. Aplicar una pomada oftalmológica para proteger los ojos se sequen durante la anestesia.
- Siga la clasificación de Guedel para evaluar la profundidad de la anestesia 13.
3. Preparativos para el aislamiento y cultivo celular
- Para cultivar las MSCs derivadas de médula ósea y el líquido sinovial, se preparan 500 ml de medio avanzado de Dulbecco Eagle modificado (ADMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml de crecimiento de fibroblastos básico factor (bFGF), y 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI y 10.000 g / ml, respectivamente, Pen-Strep).
- Incubar la ADMEM a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 dentro de una incubadora de CO 2.
- Preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) según las instrucciones del fabricante para el aislamiento de células y lavado.
4. Recopilación de Médula Ósea de la cerdos enanos
- Seleccione un área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamaño en la cresta ilíaca (Figura 1), y quitar el pelo de esta área usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica. Una vez que se coloca el cerdo enano, alternativamente fregar el sitio del procedimiento tres veces con los siguientes agentes de esterilización: yodo povidona y 70% de etanol. Después de que el área esté completamente seco, aplicar paños estériles.
- Pre-capa de la jeringa 10 ml con 100 U / ml de heparina por lavado con 3 - 4 ml de heparina antes de ejecting el agente anti-coagulante.
Nota: Realice este paso para evitar la coagulación en la jeringa durante la aspiración de médula ósea. - Extracto de un mínimo de 5 ml de médula ósea de la cresta ilíaca del hueso de la minipig bajo anestesia, utilizando un extractor de médula ósea (3,0 × 100 mm) firmemente unido a la jeringa 10 ml de heparina pre-revestido.
5. Aislamiento de células extraídas de la médula ósea y cultivo in vitro
- Aislar las células de la médula ósea extraída.
- Diluir la médula ósea se extrajo con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
- Añadir 3 ml de medio de centrifugación de densidad (Ficoll-Paque) al tubo cónico de 15 ml.
- Diluir una capa de 4 ml de la médula ósea con DPBS, que se coloca en el soporte de centrifugación de densidad sin mezclar y centrifugar al 400 × g durante 40 min a temperatura ambiente.
- Cosecha de la capa de células mononucleares(MNC) de la capa leucocitaria entre las dos capas que contienen el plasma (capa superior) y los medios de centrifugación de densidad (capa inferior), y transferir las multinacionales en un tubo cónico de 15 ml.
- Diluir las multinacionales transferidos con 7 - 8 ml de DPBS y centrifúguelas a 500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS.
- Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM y transferirla a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm. Incubar la placa de cultivo a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2.
- El cultivo in vitro de células aisladas de la médula ósea.
- Después de 48 hr, aspirar el medio con las células que no se han adherido a la placa, y reemplazar 2 ml de la ADMEM e incubar al 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. Cambiar el medio cada tres días.
- En 70 a 80% de confluencia, se lavan las células con DPBS, disociar con 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, y incubarlos a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que las células se separan.
- Recoger las células utilizando 10 ml de ADMEM, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante.
- Suspender las células recogidas en 1 ml de ADMEM fresco y contarlos utilizando un hemocitómetro.
- Colocar las células en un 5 a 7,5 x 10 5 / 25T matraz que contiene 4 ml de ADMEM y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. Cambiar el medio cada tres días.
6. Recogida de líquido sinovial de los cerdos enanos
- Al igual que en el procedimiento de aspiración de médula ósea, seleccionar un área adecuada de aproximadamente 15 x 10 cm (longitud / anchura) sobre la articulación del fémur, y quitar el pelo usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica, siga por procedimientos de sanitización (paso 4.1).
- Inserte una jeringa de 3 ml con un 23 Gaguja en la articulación después de los puntos de referencia (palpación de la cresta de la rótula y la tibia).
- Aplicar succión suave a las jeringas para la aspiración de líquido sinovial en la articulación. El volumen aproximado de líquido sinovial extraída de un conjunto es de 0,5 - 1 ml, pero esto varía de acuerdo con el tamaño de la minipig o la articulación. Enjuague a través de DPBS en la cavidad sinovial si el volumen recogido de líquido sinovial es demasiado pequeño.
- Inmediatamente retirar la jeringa para evitar la contaminación con sangre.
7. aislamiento de células del líquido sinovial y recogió el cultivo in vitro
- Aislar las células del líquido sinovial aspirado.
- Diluir el líquido sinovial de aspiración con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
- Para eliminar los desechos, se filtra el líquido sinovial diluida usando un filtro de células de nylon de 40 micras.
- Añadir 10 ml de DPBS al tubo que contiene el filtrado sinovialfluido y centrifugar al 400 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS.
- Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM, colocar las células en un 2 - placa de cultivo tisular 3 x 10 5 células / 35 mm con 2 ml de ADMEM, y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 .
- Repita el paso 5.2 para el cultivo in vitro de las MSC de líquido derivado sinoviales aisladas.
8. Después del procedimiento de los cerdos enanos
- Si es necesario, cerrar la piel en el sitio de la inyección extractor de médula ósea con una sola sutura con una grapadora de piel, después de la extracción de la médula ósea.
- Después de que se completa el procedimiento, administrar una inyección intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) y meloxicam (0,2 mg / kg) a los cerdos enanos una vez al día durante 3 días.
- Después de que se completa el procedimiento, la desinfección de la médula ósea y el sitio de recogida de fluido sinovialcon 0,1% de yodo povidona una vez al día durante 3 días. Observe cuidadosamente a diario para vigilar los signos de complicaciones (por ejemplo, hinchazón, pus o enrojecimiento).
9. Fenotipificación celular mediante citometría de flujo
- Cuando las MSCs son 70 a 80% de confluencia en pasajes 3 - 5, se lavan las células con DPBS y tratarlos con 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. A continuación, los incuban a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que se separan las células.
- Recoger las células utilizando 10 ml de DPBS, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar la solución sobrenadante.
- Para fijar las células, suspender el sedimento celular en 10 ml de una solución de formaldehído al 3,7% y mantenerlos a 4 ° C durante un día antes del análisis.
- Un día después de la fijación, se lavan las células con DPBS dos veces con centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
- Suspender el sedimento de células en 4 mlde DPBS, que se complementa con 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA), e incubar el sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacciones no específicas Fc mediada.
- Distribuir partes alícuotas de 500 l de la suspensión celular en tubos de 1,5 ml.
- Para los anticuerpos no conjugados (CD29 y vimentina), se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante.
- Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 del anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con 1% de albúmina de suero bovino por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
- Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 de la isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario e incubar durante 1 h en la oscuridad a 4 ° C.
- Para los anticuerpos conjugados con FITC (isotipo, CD34, CD44 y CD45), se lavan las células por centrifugación a 300 × g durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante.
- Suspender el sedimento celular en 500 l de la 1: 100 de anticuerpo conjugado con FITC y se incuba durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C.
- Por tanto en condiciones de tinción, se lavan las células dos veces con DPBS por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
- Suspender las células en 500 l de DPBS, transferirlos a un tubo de 5 ml de fondo redondo, y analizar los resultados utilizando un citómetro de flujo 8.
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Representative Results
Establecimiento de las MSC derivadas de la médula ósea y de líquido sinovial de los cerdos enanos
MSCs se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales articulares de los cerdos enanos y se expandieron in vitro (Figura 2). Jeringa de aspiración de líquido sinovial es simple, y es posible obtener suficientes células adherentes durante el cultivo in vitro de las células primarias. La morfología de las MSC de origen sinovial-líquido es similar a la de las MSC de médula ósea derivados, y los dos MSCs tener una forma de huso fibroblástica y son de forma homogénea adherente. Se observó que tenía una expresión positiva para la fosfatasa alcalina tinción (AP), después de la tercera subcultivo fue completa.
La evaluación del fenotipo de las células de las MSC derivadas de la médula ósea y el líquido sinovialde cerdos enanos
Se llevaron a cabo ensayos de los marcadores de superficie celular para crear un fenotipo de las MSC de la médula ósea y del líquido sinovial derivados de de cerdos enanos. Ambos tipos de MSCs expresaron cantidades significativas de positivos marcadores de superficie celular, tales como CD29, CD44, y vimentina (≥96 - 99% de las células positivas), mientras que las expresiones de la CD34 y CD45 fueron negativos y baja (≤2% de la células positivas) (Figura 3). Estos resultados fueron idénticos a los obtenidos a partir de MSCs distintivas, incluyendo las células aisladas a partir de líquido sinovial, y no hubo diferencias significativas en los marcadores de superficie celular entre estos MSCs. Las células aisladas de la médula ósea y el líquido sinovial se han confirmado como MSC en nuestro estudio anterior 8. Tanto marrow- hueso y MSC fluido sinovial derivado expresan factores de transcripción de células madre (Oct3 / 4, Nanog, y Sox2); por otra parte, un in vitro la diferenciación de capacidad hcomo ha confirmado no sólo en el linaje mesenquimal (osteocitos, adipocitos y condrocitos,), pero también las células neuronales por tinción citoquímica y las detecciones de la expresión génica específica de la célula 8.
Figura 1. Localización de la cresta ilíaca del cerdo enano. La flecha roja representa el sitio en la cresta ilíaca utilizado para la extracción de la médula ósea. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. MSC derivadas de la médula ósea y el líquido sinovial de cerdos enanos. (A) La morfología homogénea de cultivos primarios de MSCs revelaron una forma fibroblástica. (B) tinción con mezcla de5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato y nitro azul tetrazolio (BCIP / NBT) revelaron la actividad de AP en las MSC en el paso de la barra 3. Escala: 100 micras favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de los marcadores de superficie celular de las MSC derivadas de la médula ósea y el líquido sinovial de cerdos enanos en el paso 3. Se identificaron los marcadores de superficie celular de MSC usando un flujo de análisis de citometría, y MSCs se identificaron como positivos para CD29, CD44 y vimentina y negativa para CD34 y CD45. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Cerdos enanos se utilizaron para establecer el aislamiento MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Para eliminar diversas condiciones fisiológicas, tales como la edad, el género, y la enfermedad, cerdos enanos de donantes fondo isogénicas se eligieron para evaluar con precisión la caracterización dependiente fuente de células. Los cerdos son conocidos por ser anatómicamente, fisiológicamente, y genéticamente similares a los humanos y, en particular, cerdos enanos pueden producir órganos tamaño emparejados; por lo tanto, pueden ser utilizados como una especie donante sustituto para xenotrasplantes 14,15. En cuanto a la propiedad inmunomoduladora sugerido recientemente de las MSC, indoleamine 2, 3-dioxigenasa (IDO) y óxido nítrico sintasa (NOS) se usa con las MSC para mediar en la inmunosupresión, que es específico de la especie, a pesar de las MSC de cerdos y seres humanos tienen la misma IDO 9 . Por lo tanto, un modelo de cerdo como donante MSCs podría proporcionar importantes conocimientos de las respuestas inmunes de las MSC para terapias humanas. Además, la investigación del vástago porcinocélulas juega un papel importante en la comprensión de los procesos biológicos in vitro y sus diversas aplicaciones preclínicos en humanos 16,17. La médula ósea y el líquido sinovial puede ser cosechado de cerdos enanos no invasiva. Todo el procedimiento, de la anestesia para la recogida de muestras, redujo el nivel de estrés de órganos sistémicos o locales; Por lo tanto, cerdos enanos se pueden utilizar como receptores para el trasplante autólogo. En este experimento, se aislaron MSC de la médula ósea y el líquido sinovial de cerdos enanos, basado en la confirmación de las MSC del líquido sinovial derivado con capacidades de inmunosupresión derivadas de un modelo de RA ratón en un estudio anterior 8
Recogida de médula ósea de los cerdos enanos
En los cerdos, las células progenitoras adultas derivadas de la médula ósea son multipotentes y han inducido la neovascularización y regeneración de los cardiomiocitos. La edad de un donante se asocia con un mayor contenido de grasa ydisminución de la proliferación y la diferenciación de la médula ósea; por lo tanto, la médula ósea no es la mejor fuente de MSCs en animales de edad avanzada. La cresta ilíaca en cerdos enanos es el sitio preferido para el aislamiento de MSC derivadas de la médula ósea, ya que es amplia y es un sitio del procedimiento de bajo riesgo para el daño del nervio ciático. En el caso de los cerdos enanos de edad o con sobrepeso, gruesos músculos enriquecida en grasa pueden estar presentes en la cresta ilíaca. En tales circunstancias, una incisión punzante en la piel es necesario y la aguja de biopsia de médula ósea debe ser insertado correctamente, lo que puede ser difícil de aplicar en la cresta ilíaca. Si no se encuentra el sitio de la biopsia correcta puede conducir a aspiraciones de médula ósea fallidos ya que la aguja sea bloqueada por el hueso o puede no ser capaz de llegar a la médula ósea dentro de la cresta ilíaca. Por lo tanto, la aguja de biopsia se debe comprobar correctamente, y se requiere el conocimiento del grosor del tejido blando y la corteza del hueso de la cresta ilíaca antes de comenzar las colecciones de muestras.
La aspiración de líquido sinovial de las articulaciones de los cerdos enanos
existe líquido sinovial en la cavidad de las articulaciones sinoviales, y el volumen del líquido sinovial es generalmente aumentada en las articulaciones inflamadas. MSCs del líquido sinovial derivado se toman de los sitios candidatos preferidos para la regeneración del cartílago, tanto in vivo como in vitro. Además, se han mostrado inducir propiedades inmunomoduladoras en la AR 8. El líquido sinovial es no sólo una fuente fácilmente accesible, pero también tiene propiedades valiosas mesenquimales. Limitaciones del uso de líquido sinovial como fuente de MSCs son los diferentes volúmenes se encuentran en las articulaciones en base a los diferentes tamaños y condiciones patológicas de las articulaciones y la dificultad en el uso de una jeringa de 3 ml para la aspiración de líquido sinovial de las articulaciones. Por lo tanto, el tamaño de la jeringa debe ser de 5 - 10 ml con alta presión. Además, el lavado del fluido sinovial con 1 - 2 ml de DPBS de una jeringaes preferible. Mediante el uso de este método, un gran número de células se puede obtener, incluso de pequeños espacios en las articulaciones.
Caracterizaciones de las MSC de médula marrow- y derivado del líquido sinovial-de cerdos enanos
En los seres humanos, la morfología de las MSC derivadas de la sinovial-membrana sinovial-fluidos y de los pacientes con osteoartritis son similares, pero más estrecho que la morfología de las MSC de médula ósea derivados 12. Sin embargo, en cultivos in vitro, se observaron las morfologías de los dos MSCs derivadas-sinovial de fluido y las MSC derivadas de la médula ósea para ser similar en este experimento. En el estudio anterior de los investigadores, la capacidad de proliferación de las MSC derivadas de la sinovial de fluido era alta, en comparación con la de la médula ósea derivada de MSCs 8.
MSC se establecen a partir de diversas fuentes de tejidos de donantes adultos; MSC-tejido de origen derivados, por lo tanto, no invasiva obtenidos son valiosos para autólogo de células madre THerapy. La fuente de células depende de las caracterizaciones y capacidades de la enfermedad o el propósito de la terapia con células madre. En los cerdos, las células progenitoras adultas derivadas de la médula ósea son multipotentes y han inducido la neovascularización y la regeneración de cardiomiocitos 18,19. MSCs han sido principalmente aislado de la médula ósea, sino también desde el periostio, los músculos esqueléticos, membrana sinovial, el cordón umbilical, y los tejidos dentales, aunque la obtención de células de estos tejidos no es fácil y puede requerir procedimientos quirúrgicos adicionales para los pacientes. Sin embargo, el volumen de líquido sinovial por lo general aumenta en las articulaciones de pacientes con AR o la osteoartritis, y las biopsias de estos mayor cantidad de líquidos sinoviales se utilizan para diagnosticar y tratar a los pacientes. El número de MSCs también aumenta en el fluido sinovial de pacientes con cartílago degenerado y la osteoartritis 20.
En este estudio, se evaluaron los fenotipos de células de hueso-marrow- y MSCs derivadas-sinovial-líquido, unad ambos MSCs presenta niveles similares de expresión de marcadores de superficie celular. Por lo tanto, las células aisladas del líquido sinovial y se ha confirmado que las MSC tienen fenotipos similares a las MSC de médula ósea procedentes de cerdos enanos. la investigación anterior de los investigadores evaluaron otros marcadores de superficie celular, tales como CD90 y la clase principal histocompatible y complejo II (MHC II), y se confirmó una capacidad de diferenciación multi-linaje en los osteocitos, adipocitos, condrocitos, y las neuronas de sinovial de fluido MSC -derivado de cerdos enanos 8. En los seres humanos, el perfil de antígeno de superficie celular de las MSC de origen sinovial-líquido es similar a la de las MSC derivadas de la médula ósea sinovial-membrana 2,21 y. Sin embargo, CD34 y CD45 expresiones no se detectaron en las MSC derivadas de líquido sinovial en pacientes con trastorno de la articulación temporomandibular. Por lo tanto, el microambiente en la articulación puede afectar el fenotipo de las células de las MSC derivadas de líquido sinovial. En este experimento, las células se obtuvieron de la ma huesorrow y el líquido sinovial de cerdos enanos utilizando métodos no invasivos. Ambos tipos de células cultivadas in vitro fueron confirmados como MSC, y tenían fenotipos de células mesenquimales características similares y compatibles compartidos. Sin embargo, las MSC derivadas de la sinovial-líquido mostraron un mayor potencial para la terapia de células madre autólogas para no sólo cartílago y el hueso de regeneración, sino también para la inmunosupresión de la osteoartritis y la artritis reumatoide.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
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