Protocol
Djurförsök godkändes av Animal Center for Biomedical Experiment på Gyeongsang National University.
1. Förberedelser för djurordningen
- Förbereda den vuxna kvinnliga minigrisar för icke-invasiv insamling av MSC: er från benmärgen och synovialvätska. Utför klinisk undersökning av minigrisar en dag före anestesi och provtagning.
- Tillhandahålla kliniskt normala djur för fysiska undersökningar, bland annat kroppstemperatur, andningsfrekvens och hjärtfrekvens, och för observation av grisarnas beteende och hematologiska status, med hjälp av kompletta blodprov räkna.
Anm: Parameterintervall för kliniskt friska minigrisar är 11-29 / min för andningshastighet, 68-98 / min för hjärtfrekvensen, och 37 till 38 ° C under kroppstemperaturen.
- Tillhandahålla kliniskt normala djur för fysiska undersökningar, bland annat kroppstemperatur, andningsfrekvens och hjärtfrekvens, och för observation av grisarnas beteende och hematologiska status, med hjälp av kompletta blodprov räkna.
- Ta bort alla ätliga sängkläder från buren under den preoperativa fasteperioden 6-12 tim prior till förvaltningen av anestesi för unga och vuxna minigrisar bör observeras tre timmar av fasta för nyfödda. Tillhandahålla dricksvatten fram till tiden för anestesi.
2. Förberedelse av djuren för anestesi
- Medicinera de minigrisar innan administreringen av anestesi med acepromazin (0,1 mg / kg), medetomidin (0,03 mg / kg), och atropin (0,04 mg / kg).
- Injicera alla mediciner intramuskulärt (IM) med en 21 G nål med en längd av minst 30 mm för vuxna minigrisar. Utför intramuskulär injektion 1-3 cm bakom örat i den laterala halsmuskeln eller i lårmuskeln.
Obs: Utför alla förfaranden utan att framkalla rädsla eller stress hos djuren eller kräver omild behandling för att på ett säkert sätt injicera premedicinering.
- Injicera alla mediciner intramuskulärt (IM) med en 21 G nål med en längd av minst 30 mm för vuxna minigrisar. Utför intramuskulär injektion 1-3 cm bakom örat i den laterala halsmuskeln eller i lårmuskeln.
- Placera minigrisar i en dorsal liggande ställning.
- Femton minuter efter administreringen av premedicinering, initiera anestesi med användning av 1,5% isofluran adminrade genom inandning.
- Fortsätta inandning av isofluran (1,5%) genom en endotrakealtub, följt av en ökning i koncentration till 2,5%, med syre (1,5 L / min) som bärargas.
- Kontinuerligt övervaka hjärtfrekvens, kroppstemperatur, och perkutan blod syremättnad (SpO 2) i minigrisar under narkos. Använda en cirkulerande vatten filt vid en temperatur av 38-39 ° C för att upprätthålla kroppstemperaturen. Applicera en oftalmologiska salva för att skydda ögonen från att torka ut under narkos.
- Följ Guedel klassificering för att bedöma djupet av anestesi 13.
3. Förberedelser för cellisolering och odling
- Att odla MSCs härledda från benmärg och synovialvätska, förbereda 500 ml avancerad Dulbeccos modifierade Eagle-medium (ADMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml av basisk fibroblasttillväxtfaktor factor (bFGF), och 1,0% penicillin-streptomycin (10.000 IU och 10.000 | ig / ml, respektive, Pen-Strep).
- Inkubera ADMEM vid 38,5 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 i en CO2-inkubator.
- Bered 500 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) i enlighet med tillverkarens anvisningar för cellisolering och tvätt.
4. Samla Benmärg från minigrisar
- Välj ett område cirka 15 x 15 cm i storlek på höftkammen (Figur 1), och ta bort hår från detta område med hjälp av steriliserade rakhyvlar eller elklipper. När minigris är positionerad, växelvis skrubba förfarande webbplats tre gånger med följande steriliseringsmedel: povidon jod och 70% etanol. Efter området är helt torr, tillämpa sterila draperier.
- Pre-belägga 10 ml spruta med 100 U / ml av heparin genom att skölja det med 3 - 4 ml heparin före ejecting anti-koagulerande medel.
Obs: Utför detta steg för att undvika koagulering i sprutan under benmärgen aspiration. - Extrahera ett minimum av 5 ml av benmärg från höftbenskammen benet hos minigris under narkos, med användning av en benmärgs extraktor (3,0 x 100 mm) tätt fäst till heparin förbelagd 10 ml sprutan.
5. Isolering av celler som extraherats från benmärgen och odling in vitro
- Isolera cellerna från den extraherade benmärgen.
- Späd den extraherade benmärg med en lika stor volym DPBS i en 15 ml koniskt rör vid rumstemperatur.
- Tillsätt 3 ml densitetscentrifugering media (Ficoll-Paque) till 15 ml koniska rör.
- Späd en 4 ml skikt av benmärgen med DPBS, som är placerad på densitetscentrifugering media utan att blanda, och centrifugera det vid 400 x g under 40 minuter vid rumstemperatur.
- Skörda skiktet av mononukleära celler(MNC) från buffy coat mellan de två skikten som innehåller plasma (översta lagret) och densitetscentrifugering media (bottenskikt), och överföra MNC i en 15 ml koniska rör.
- Späd de överförda MNC med 7 - 8 ml DPBS och centrifugera dem vid 500 x g under 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tvätta cellerna två gånger med DPBS.
- Suspendera cellpelleten i 2 ml ADMEM och överföra den till en 35 mm vävnadsodlingsskål. Inkubera kulturen skålen vid 38,5 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
- In vitro-odling av celler isolerade från benmärg.
- Efter 48 h, aspirera mediet med de celler som inte har fäst till skålen, och ersätta 2 ml av ADMEM och inkubera det vid 38,5 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2. Ändra medium var tredje dag.
- Vid 70 - 80% konfluens, tvätta cellerna med DPBS, dissociera dem med 1 ml av 0,25%trypsin / EDTA och inkubera dem vid 37 ° C under 3-5 min tills cellerna lossnar.
- Skörda cellerna med användning av 10 ml ADMEM, överföra dem till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera dem vid 300 x g under 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Suspendera de skördade cellerna i 1 ml färskt ADMEM och räkna dem med hjälp av en hemocytometer.
- Placera cellerna i en 5-7,5 x 10 5 / 25T-kolv innehållande 4 ml av ADMEM och inkubera dem vid 38,5 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2. Ändra mediet var tredje dag.
6. Insamling av synovialvätska från minigrisar
- I likhet med förfarandet för benmärg aspiration, välj en lämplig yta på cirka 15 x 10 cm (längd / bredd) över lårbens leden, och ta bort hår med hjälp av steriliserade rakhyvlar eller elklipper, följa efter sanering förfaranden (steg 4,1).
- Sätt i en 3 ml spruta med en 23 Gnålen i leden efter landmärken palpation (patella och skenben vapen).
- Tillämpa mild sugning till sprutor för aspiration av ledvätskan i leden. Den ungefärliga volymen av synovialvätska som samlats in från ett gemensamt är 0,5 - 1 ml, men detta varierar beroende på storleken på minigris eller fogen. Spola igenom DPBS i den synoviala kaviteten om den uppsamlade volymen av synovialvätska är för liten.
- Omedelbart dra tillbaka sprutan för att undvika kontaminering med blod.
7. Cell Isolering från Collected ledvätska och odling in vitro
- Isolera cellerna från det insugna ledvätskan.
- Späd aspire synovialvätska med en lika stor volym av DPBS i en 15 ml koniskt rör vid rumstemperatur.
- För att ta bort skräp, filtrera den utspädda ledvätskan med hjälp av en 40 pm nylon cell sil.
- Tillsätt 10 ml DPBS till röret innehållande den filtrerade synovialfluid och centrifugera det vid 400 x g under 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tvätta cellerna två gånger med DPBS.
- Suspendera cellpelleten i 2 ml ADMEM, placera cellerna på 2 - 3 x 10 5 celler / 35 mm vävnadsodlingsskål med 2 ml ADMEM, och inkubera dem vid 38,5 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 .
- Upprepa steg 5,2 för odling av isolerade ledvätska härledda MSC in vitro.
8. Post-förfarande Skötsel av minigrisar
- Om det behövs, stänga huden vid benmärgs extractor injektionsstället med en enda sutur med användning av en hud häftapparat, efter benmärgs samlingen.
- Efter ingreppet är avslutat, administrera en intramuskulär injektion av enrofloxacin (5 mg / kg) och meloxikam (0,2 mg / kg) till de minigrisar en gång om dagen i 3 dagar.
- Efter ingreppet är avslutat, desinficera benmärgen och synovialvätska insamlingsplatsmed 0,1% povidonjod en gång om dagen i 3 dagar. Noggrant följa dagligen för att övervaka tecken på komplikationer (t.ex. svullnad, pus eller rodnad).
9. Cell fenotypning med flödescytometri
- När MSCs är 70-80% sammanflytande vid passagerna 3 - 5, tvätta cellerna med DPBS och behandla dem med 1 ml av 0,25% (vol / vol) Trypsin / EDTA. Därefter inkubera dem vid 37 ° C under 3-5 min tills cellerna lossnat.
- Skörda cellerna med användning av 10 ml DPBS, överföra dem till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera dem vid 300 x g under 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten lösning.
- Att fixera cellerna, suspendera cellpelleten i 10 ml av en 3,7% -ig formaldehydlösning och hålla dem vid 4 ° C under en dag före analysen.
- En dag efter fixering, tvätta cellerna med DPBS två gånger med användning centrifugering vid 300 x g under 5 min varje gång. Kassera supernatanten lösning.
- Suspendera cellpelleten i 4 mlDPBS, som är kompletterad med 1% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA), och inkubera pelleten i 1 timme vid 4 ° C för att blockera icke-specifika Fc-medierade interaktioner.
- Fördela 500 | il alikvoter av cellsuspensionen in i 1,5 ml rör.
- För icke-konjugerade antikroppar (CD29 och vimentin), tvätta cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 3 min. Kassera supernatanten lösning.
- Suspendera cellpelleten i 500 ^ il av en 1: 100 utspädning av den primära antikroppen och inkubera det i 1 timme vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med 1% bovint serumalbumin genom centrifugering vid 300 x g under 5 min varje gång. Kassera supernatanten lösning.
- Suspendera cellpelleten i 500 ^ il av en 1: 100 utspädning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad sekundär antikropp och inkubera det i 1 timme i mörker vid 4 ° C.
- För de FITC-konjugerade antikroppar (isotyp, CD34, CD44 och CD45), tvätta cellerna genom centrifugedighet vid 300 x g under 3 min. Kassera supernatanten lösning.
- Suspendera cellpelleten i 500 | il av en: 100 FITC-konjugerad antikropp och inkubera det i 1 timme i mörker vid 4 ° C.
- För båda färgningsbetingelser, tvätta cellerna två gånger med DPBS genom centrifugering vid 300 x g under 5 min varje gång. Kassera supernatanten lösning.
- Suspendera cellerna i 500 ^ il DPBS, överföra dem till en 5 ml rundbottnad röret, och analysera resultaten med användning av en flödescytometer 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av MSC-celler härledda från benmärgen och synovialvätskan hos minigrisar
MSC framgångsrikt isolerades från benmärgen och artikulära synovialled av minigrisar och expanderas in vitro (Figur 2). Spruta aspiration av synovialvätska är enkel, och det är möjligt att erhålla tillräckliga vidhäftande celler under odling in vitro av de primära cellerna. Morfologin hos synovial-fluid-derived MSCs är liknande den hos ben-märghärstammande MSCs, och båda MSCs har en fibroblastisk spindelform och är homogent vidhäftande. De observerades ha ett positivt uttryck för alkaliskt fosfatas (AP) färgning, efter den tredje subkulturen var fullständig.
Utvärdering av cellfenotyp av MSC-celler Härlett från benmärgen och synovialvätskaav minigrisar
Analyser av de cellytmarkörer utfördes för att skapa en fenotyp av benmärg och synovial-fluid-härledda MSCs av minigrisar. Båda typerna av MSC: er uttryckte signifikanta mängder av positiva cellytmarkörer, såsom CD29, CD44, och Vimentin (≥96 - 99% av positiva celler), medan uttrycken för CD34 och CD45 var negativa och låg (≤2% av den positiva celler) (Figur 3). Dessa resultat var identiska med de som erhölls från distinkta MSC, inklusive celler som isolerats från ledvätska, och det fanns inga signifikanta skillnader i cellytmarkörer bland dessa MSC. De celler som isolerats från benmärg och ledvätska har bekräftats som MSC i vår tidigare studie 8. Både ben marrow- och ledvätska härrörande MSC uttryckte stamcelltranskriptionsfaktorer (Oct3 / 4, nanog och Sox2); Dessutom ett in vitro differentiering förmåga hsom bekräftats inte bara in i mesenkymala härstamningen (osteocyter, adipocyter, och kondrocyter), men även neurala celler genom cytokemisk färgning och detekteringar av cellspecifik genexpression 8.
Figur 1. Placering av höftkammen hos minigris. Den röda pilen representerar platsen på höftkammen används för benmärgs samlingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. MSC härrör från benmärgen och ledvätska av minigrisar. (A) Den homogena morfologi av primära kulturer av MSC avslöjade en fibroblastisk form. (B) Färgning med blandning av5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat och nitroblå tetrazolium (BCIP / NBT) avslöjade AP-aktivitet i MSC vid passage 3. Skala bar: 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av cellytmarkörer av MSC som härrör från benmärgen och ledvätska av minigrisar vid passage 3. cellytmarkörer av MSC identifierades med hjälp av en flödescytometrianalys, och MSC identifierades som positivt för CD29, CD44 och Vimentin och negativ för CD34 och CD45. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigrisar användes för att fastställa MSC: er isolering från benmärg och synovialvätska. För att eliminera olika fysiologiska förhållanden, såsom ålder, kön och sjukdom, var minigrisar från isogena bakgrunds givare valt att noggrant utvärdera cellkälla beroende karakterisering. Grisar är kända för att vara anatomiskt, fysiologiskt och genetiskt liknar människor, och i synnerhet, minigrisar kan producera storleksmatchade organ; Därför kan de användas som ett substitut donatorart för xenotransplantation 14,15. När det nyligen föreslagit immunmodulerande egenskap hos MSC, indoleamine 2, 3-dioxygenas (IDO) och kväveoxidsyntas (NOS) användes med MSCs att förmedla immunsuppression, som är artspecifik, även MSCs från svin och människor har samma IDO 9 . Således kan en gris modell som en MSC donator ge viktiga insikter i immunsvaren av MSCs för mänskliga terapier. Vidare forskning av svinstammenceller spelar en viktig roll i den biologiska förståelsen av in vitro-processer och deras olika prekliniska tillämpningar i människor 16,17. Benmärg och ledvätska kan vara icke-invasivt skördas från minigrisar. Hela förfarandet, från anestesi till provtagning, minskade spänningsnivå av systemiska eller lokala organ; Därför kan minigrisar användas som mottagare för autolog transplantation. I detta experiment var MSCs isolerades från benmärg och synovialvätskan hos minigrisar, baserat på bekräftelse av synovial-fluid-härledda MSCs med immunosuppression kapacitet som härrör från en RA musmodell i en tidigare studie 8
Insamling av benmärg från minigrisar
Hos svin, vuxna stamceller som härrör från benmärg är multipotenta och har inducerad kärlnybildning och cardiomyocyte förnyelse. Åldern på en donator är associerad med ökad fetthalt ochminskad proliferation och differentiering av benmärg; Därför är benmärgen inte den bästa källan till MSC i äldre djur. Höftbenskammen i minigrisar är den föredragna platsen för benmärg-härledda MSC isolering eftersom det är bred och är en låg risk förfarande plats för ischiasnervskada. I fallet med åldrade eller överviktiga minigrisar, kan fettberikad tjocka muskler vara närvarande på höftbenskammen. Under sådana omständigheter är en stickande snitt på huden nödvändig och benmärgsbiopsi nål måste sättas på rätt sätt, vilket kan vara svårt att tillämpa på höftkammen. Misslyckandet med att hitta den korrekta biopsi stället kan leda till misslyckade benmärgs strävanden eftersom nålen blir blockerad av ben eller kanske inte kan nå benmärgen inuti höftbenskammen. Därför måste biopsinålen kontrolleras på rätt sätt, och kunskap om tjockleken hos mjukvävnad och cortex av benet av höftbenskammen krävs innan provsamlingar.
Aspiration av ledvätskan från lederna i minigrisar
Synovialvätska existerar i kaviteten i synoviala leder, och volymen av synovialvätska ökas vanligen i inflammerade leder. Synovial-vätske härledda MSC tas från föredragna kandidatplatser för broskregenerering, både in vivo och in vitro. Dessutom har de visat sig framkalla immunmodulerande egenskaper i RA 8. Synovial fluid är inte bara en lättillgänglig källa men har också värdefulla mesenkymala egenskaper. Begränsningar för användning av ledvätskan som en källa för MSC är de olika volymer som finns i lederna baserat på de varierande storlek och patologiska tillstånd i leder och svårigheten att använda en 3 ml spruta för ledvätska aspiration från lederna. Därför bör storleken av sprutan vara 5 - 10 ml med högt tryck. Dessutom spolning av ledvätskan med 1 - 2 ml DPBS från en sprutaär att föredra. Genom att använda denna metod kan ett stort antal celler erhållas, även från små utrymmen i lederna.
Karakteriseringar av benet-marrow- och Synovial-vätske härledda MSCs av minigrisar
Hos människor, de morfologier av synovial-vätske- och synovial-membran-härledda MSCs från patienter med artros är liknande men mindre än morfologi ben märghärstammande MSC 12. I in vitro-kulturer, morfologier av både synovial-vätske härledda MSC och benmärg-härledda MSCs observerades vara lika i detta experiment. I forskarnas tidigare studie, var spridningen förmåga synovial-vätske härledda MSCs hög, jämfört med ben märghärstammande MSC 8.
MSC etableras från olika vävnadskällor hos vuxna donatorer; Därför, icke-invasivt erhållna vävnads-source-härledda MSC är värdefulla för autolog stamcellstransplantation therapy. Cellkällan är beroende av beskrivningar och kapacitet av sjukdomen eller syftet med stamcellsterapi. Hos svin, vuxna stamceller som härrör från benmärg är multipotenta och har inducerad kärlnybildning och cardiomyocyte regenerering 18,19. MSCs har huvudsakligen varit isolerade från benmärg, men också från benhinnan, skelettmuskler, synovium, navelsträngar, och dentala vävnader, även om få celler från dessa vävnader är inte lätt och kan kräva ytterligare kirurgiska ingrepp för patienterna. Ökar emellertid volymen av ledvätskan vanligtvis i lederna hos artros eller RA-patienter, och biopsier från dessa ökade synovialvätskor används för att diagnostisera och behandla patienter. Antalet MSCs ökar också i ledvätskan hos patienter med degenererad brosk och artros 20.
I denna studie var cell fenotyper ben marrow- och synovial-vätske härledda MSCs utvärderas, end både MSC presenterade liknande nivåer av uttryck för cellytemarkörer. Därför celler som isolerats från ledvätska och bekräftats MSC har liknande fenotyper till ben märghärstammande MSC i minigrisar. Forskarnas tidigare forskning utvärderat andra cellytmarkörer, såsom CD90 och större histokompatibla och komplexa klass II (MHC II), och bekräftade en kapacitet för flera härstamning differentiering i osteocyter, adipocyter, kondrocyter och nervceller i synovial-vätska härledda MSCs från minigrisar 8. Hos människa är cellyteantigenet profilen för synovial-fluid-derived MSCs liknande den i synovial-membran- 2,21 och benmärg-härledda MSCs. Men CD34 och CD45 uttryck inte registreras i MSC härrör från ledvätskan i käkleden oordning patienter. Sålunda kan mikromiljö i fogen påverka cellfenotypen av MSC-celler härledda från synovialvätska. I detta experiment ades cellerna erhölls från benet marrow och ledvätska av minigrisar med hjälp av icke-invasiva metoder. Båda typerna av in vitro odlade celler bekräftades som MSC, och de hade liknande cellfenotyper och delade kompatibla mesenkymala egenskaper. Men synovial-vätske härledda MSCs visade en större potential för autolog stamcellsterapi för att inte bara brosk och benuppbyggnad men också för immunsuppression av artros och RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
