Protocol
Tierversuche wurden von der Animal Center for Biomedical Experimentation in Gyeongsang National University zugelassen.
1. Die Vorbereitungen für die Tierordnung
- Bereiten Sie die erwachsenen weiblichen minipigs für die nicht-invasive Sammlung von MSCs aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit. Führen Sie die klinische Untersuchung der minipigs einen Tag vor der Anästhesie und Probenentnahme.
- Geben Sie klinisch unauffälligen Tiere für körperliche Untersuchungen, die Körpertemperatur, Atemfrequenz umfassen, und die Herzfrequenz und für die Beobachtung des Verhaltens der Schweine und hämatologischen Zustände, unter Verwendung von Blutbild-Tests.
Hinweis: Parameter Intervalle für klinisch gesunden minipigs sind 11-29 / min für die Atmungsrate, 68-98 / min für die Herzfrequenz und 37-38 ° C für die Körpertemperatur.
- Geben Sie klinisch unauffälligen Tiere für körperliche Untersuchungen, die Körpertemperatur, Atemfrequenz umfassen, und die Herzfrequenz und für die Beobachtung des Verhaltens der Schweine und hämatologischen Zustände, unter Verwendung von Blutbild-Tests.
- Entfernen Sie alle essbaren Betten aus dem Käfig während der präoperativen Fastenzeit von 6 bis 12 Stunden Prior auf die Verabreichung von Narkose für junge und erwachsene minipigs, 3 Stunden Fasten sollte für die Neugeborenen beobachtet werden. Bieten Wasser bis zum Zeitpunkt der Anästhesie zu trinken.
2. Vorbereitung der Tiere für Anästhesie
- Behandeln die minipigs vor der Verabreichung von Anästhesie mit Acepromazin (0,1 mg / kg), Medetomidin (0,03 mg / kg) und Atropin (0,04 mg / kg).
- Injizieren Sie alle Medikamente intramuskulär (IM) eine 21 G-Nadel mit einer Länge von mindestens 30 mm für erwachsene minipigs verwenden. Führen Sie die IM-Injektion 1-3 cm hinter dem Ohr in die seitliche zervikale Muskeln oder in den Oberschenkelmuskel.
Hinweis: Führen Sie alle Prozeduren ohne Hervorrufen Angst oder Stress bei den Tieren oder erfordern grobe Behandlung, um sicher die Prämedikation injizieren.
- Injizieren Sie alle Medikamente intramuskulär (IM) eine 21 G-Nadel mit einer Länge von mindestens 30 mm für erwachsene minipigs verwenden. Führen Sie die IM-Injektion 1-3 cm hinter dem Ohr in die seitliche zervikale Muskeln oder in den Oberschenkelmuskel.
- Legen Sie die minipigs in einer dorsalen liegende Position.
- Fünfzehn Minuten nach der Verabreichung der Prämedikation, initiieren Anästhesie mit 1,5% Isofluran Admintragene durch Einatmen.
- Weiterhin die Inhalation von Isofluran (1,5%) durch einen Endotrachealtubus, gefolgt von einer Erhöhung der Konzentration auf 2,5%, mit Sauerstoff (1,5 L / min) als Trägergas.
- Kontinuierlich die Herzfrequenz zu überwachen, Körpertemperatur, und perkutane Blutsauerstoffsättigung (SpO 2) der minipigs während der Narkose. Verwenden Sie eine zirkulierende Wasser Decke bei einer Temperatur von 38-39 ° C auf Körpertemperatur zu halten. Tragen Sie eine ophthalmologische Salbe, die Augen vor dem Austrocknen während der Narkose zu schützen.
- Folgen Sie Guedel Klassifizierung der Narkosetiefe 13 zu bewerten.
3. Vorbereitung zur Zellisolierung und Kultivierung
- Kultivieren der abgeleiteten MSCs aus dem Knochenmark und in der Synovialflüssigkeit, bereiten 500 ml fortgeschrittener Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (ADMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstums factor (bFGF) und 1,0% Penicillin-Streptomycin (10.000 IU bis 10.000 & mgr; g / ml bzw. Pen-Strep).
- Inkubieren ADMEM bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in einem CO 2 -Inkubator.
- Bereiten 500 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Zelltrennung und Waschen.
4. Sammeln von Knochenmark aus dem Minipigs
- Wählen Sie eine Fläche von etwa 15 x 15 cm in der Größe auf dem Beckenkamm (Abbildung 1), und entfernen Sie die Haare aus diesem Bereich unter Verwendung von sterilisierten Rasierapparate oder elektrische Haarschneidemaschine. Sobald die minipig positioniert ist, scheuern abwechselnd die Prozedur Seite dreimal mit folgenden Sterilisationsmittel: Povidon-Jod und 70% Ethanol. Nachdem der Bereich gründlich trocken ist, sterilen Tüchern.
- Pre-coat der 10 ml Spritze, die mit 100 U / ml Heparin indem sie sie mit 3 Spülen - 4 ml Heparin vor ejecting der Anti-Gerinnungsmittel.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt Koagulation in der Spritze während Knochenmarksaspiration zu vermeiden. - Extrahieren von mindestens 5 ml Knochenmark aus dem Beckenkamm Knochen des minipig unter Narkose, eine Knochenmark-Extraktor (3,0 × 100 mm) fest an dem Heparin vorbeschichtet 10-ml-Spritze.
5. Isolierung von Zellen aus dem Knochenmark entnommen und in vitro Kultivierung
- Isolieren der Zellen aus dem Knochenmark entnommen.
- Verdünne das extrahierte Knochenmark mit einem gleichen Volumen von DPBS in einem 15 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur.
- 3 ml Dichtezentrifugation Medium (Ficoll-Paque) an die 15 ml konischen Röhrchen.
- Verdünnen, um eine 4 ml-Schicht des Knochenmarks mit DPBS, die ohne Mischen auf der Dichtezentrifugation Medien angeordnet wird, und es Zentrifuge bei 400 × g für 40 min bei Raumtemperatur.
- Ernten Sie die Schicht aus einkernigen Zellen(MNCs) aus dem buffy coat zwischen den zwei Schichten mit dem Plasma (obere Schicht) und die Dichtezentrifugation Medien (untere Schicht), und übertragen die MNCs in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Verdünne die übertragenen MNCs mit 7 bis 8 ml DPBS und zentrifugiert sie bei 500 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS.
- Hängen Sie das Zellpellet in 2 ml ADMEM und übertragen sie auf eine 35-mm-Gewebekulturschale. Inkubieren der Kulturschale bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2.
- In - vitro - Kultivierung von Zellen aus Knochenmark isoliert.
- Nach 48 Stunden ansaugen das Medium mit den Zellen , die nicht an der Schale befestigt sind, und 2 ml des ADMEM ersetzen und bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 inkubieren. Ändern Sie das Medium alle dritten Tage.
- Bei 70 bis 80% Konfluenz, waschen Sie die Zellen mit DPBS, distanzieren sie mit 1 ml 0,25%Trypsin / EDTA, und sie für 3 bei 37 ° C inkubieren - 5 min, bis die Zellen abzulösen.
- Ernte der Zellen unter Verwendung von 10 ml ADMEM, übertragen sie in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren sie bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen.
- Suspend die geernteten Zellen in 1 ml frischem ADMEM und zähle sie eine Zählkammer.
- Platzieren Sie die Zellen in einer 5 bis 7,5 x 10 5 / 25T - Kolben mit 4 ml ADMEM und inkubieren sie bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2. jeden dritten Tag Ändern Sie das Medium.
6. Sammlung von Synovialflüssigkeit aus den Minipigs
- Ähnlich wie bei dem Verfahren für Mark-Aspiration Knochen, wählen Sie eine entsprechende Fläche von ca. 15 x 10 cm (Länge / Breite) über die Oberschenkelgelenk, und entfernen Sie die Haare sterilisiert mit Rasierapparaten oder elektrische Haarschneidemaschine, folgen von sanitization Verfahren (Schritt 4.1).
- Legen Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 23 GNadel in das Gelenk nach den Palpation Sehenswürdigkeiten (Patella und Tibia Kamm).
- Bewerben sanfte Saugwirkung auf die Spritzen für die Aspiration von Gelenkflüssigkeit im Gelenk. Das ungefähre Volumen der Synovialflüssigkeit aus einem gemeinsamen gesammelten 0,5-1 ml, was aber je nach der Größe des minipig oder das Gelenk. Spülen durch DPBS in der Synovialhöhle wenn das gesammelte Volumen an Synovia zu klein ist.
- Ab sofort zurückziehen, die Spritze Kontamination mit Blut zu vermeiden.
7. Zellisolierung aus dem gesammelten Synovialflüssigkeit und In - vitro - Kultivierung
- Isolieren der Zellen aus dem abgesaugten Synovialflüssigkeit.
- Verdünne das aspirierte Synovialflüssigkeit mit einem gleichen Volumen von DPBS in einem 15 ml konischen Röhrchen bei Raumtemperatur.
- Zum Entfernen von Schmutz, filtern das verdünnte Synovia eine 40 & mgr; m Nylon Zelle Sieb verwendet wird.
- 10 ml DPBS auf das Rohr des gefilterten synovial enthaltendFluid- und Zentrifuge es bei 400 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS.
- Suspendiere das Zellpellet in 2 ml ADMEM, setzen die Zellen auf einem 2 - 3 x 10 5 Zellen / 35 mm - Gewebekulturschale mit 2 ml ADMEM und inkubieren bei 38,5 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 .
- Wiederholen Sie Schritt 5.2 für die in vitro Kultivierung von isolierten Synovialflüssigkeit abgeleitete MSCs.
8. Post-Verfahren Pflege der Minipigs
- Wenn nötig, schließen Sie die Haut an der Injektionsstelle Extraktor Knochenmark mit einer einzigen Naht eine Haut Hefter nach der Knochenmarkentnahme verwenden.
- eine intramuskuläre Injektion von Enrofloxacin (5 mg / kg) und Meloxicam (0,2 mg / kg) auf die minipigs einmal täglich für 3 Tage, nachdem die Prozedur abgeschlossen ist, verabreichen.
- Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, zu desinfizieren, das Knochenmark und Synovia Sammelortmit 0,1% Povidon-Iod einmal täglich für 3 Tage. Beachten Sie sorgfältig täglich auf Anzeichen von Komplikationen zu überwachen (zB Schwellungen, Eiter oder Rötung).
9. Zelle Phänotypisierung Mit Flow Cytometry
- Wann sind die MSCs 70-80% konfluent bei Passagen 3 bis 5, waschen Sie die Zellen mit DPBS und behandeln sie mit 1 ml 0,25% (v / v) Trypsin / EDTA. Dann brüten sie bei 37 ° C 3 - 5 min, bis die Zellen abgelöst werden.
- Ernte der Zellen unter Verwendung von 10 ml DPBS, übertragen sie in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren sie bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen Lösung.
- Um die Zellen zu reparieren, zu suspendieren das Zellpellet in 10 ml einer 3,7% igen Formaldehydlösung und halten sie bei 4 ° C für einen Tag vor der Analyse.
- Einen Tag nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal unter Verwendung von Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
- Suspendiere das Zellpellet in 4 mlDPBS, das mit 1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), und Inkubieren des Pellets für 1 Stunde bei 4 ° C zu blockieren unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen ergänzt wird.
- 500 ul Aliquots der Zellsuspension in 1,5 ml Röhrchen verteilen.
- Für nicht-konjugierten Antikörper (CD29 und Vimentin), wasche die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min. Überstand verwerfen Lösung.
- Suspendiere das Zellpellet in 500 ul einer 1: 100-Verdünnung des primären Antikörpers und Inkubieren für 1 Stunde bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1% Rinderserumalbumin durch Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
- Suspendiere das Zellpellet in 500 ul einer 1: 100-Verdünnung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem sekundärem Antikörper und Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
- Für die FITC-konjugierte Antikörper (Isotyp, CD34, CD44 und CD45), waschen Sie die Zellen durch centrifusuchung bei 300 × g für 3 min. Überstand verwerfen Lösung.
- Suspendiere das Zellpellet in 500 ul der 1: 100-FITC-konjugierten Antikörper und Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
- Für beide Färbebedingungen, wasche die Zellen zweimal mit DPBS durch Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 min. Überstand verwerfen Lösung.
- Die Zellen in 500 ul DPBS, übertragen sie in einen 5 ml - Rundbodenrohr und analysieren die Ergebnisse eines Durchflusszytometers 8 verwenden.
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Representative Results
Gründung von MSCs aus dem Knochenmark und Synovialflüssigkeit von Minipigs Abgeleitet
MSCs wurden aus dem Knochenmark und articular synovialen Gelenke der minipigs erfolgreich isoliert und in vitro (2) erweitert. Spritze Aspiration von Synovialflüssigkeit ist einfach, und es ist möglich , eine ausreichende adhärenten Zellen während der in vitro Kultivierung der Primärzellen zu erhalten. Die Morphologie der synovial-fluid-abgeleiteten MSCs ist ähnlich dem von Knochenmark abgeleiteten MSCs, und beide haben eine MSCs fibroblastic Spindelform und sind homogen haftend. Sie waren eine positive Ausdruck für alkalische Phosphatase (AP) Färbung nach der dritten Subkultur vollständig war haben beobachtet.
Bewertung des Zellphänotyp von MSCs aus dem Knochenmark und Synovialflüssigkeit Abgeleitetvon Minipigs
Assays der Zelloberflächenmarker wurden durchgeführt, einen Phänotyp der Knochenmark- und synovial-fluid-abgeleitete MSCs von Minipigs zu schaffen. Beide Arten von MSCs exprimiert signifikante Mengen an positiven Zelloberflächenmarker, wie CD29, CD44, Vimentin und (≥96 - 99% der positiven Zellen), während die Ausdrücke von CD34 und CD45 waren negativ und gering (≤2% der positive Zellen) (Abbildung 3). Diese Ergebnisse waren identisch mit denen von Unterscheidungs MSCs erhalten, einschließlich von Synovialflüssigkeit isolierten Zellen, und es gab keine signifikanten Unterschiede in den Zelloberflächenmarker unter diesen MSCs. Die Zellen isoliert aus dem Knochenmark und Synovia haben als MSCs in unserer früheren Studie 8 bestätigt. Sowohl aus Knochenmark und Synovia abgeleitete MSCs ausgedrückt Stammzellen Transkriptionsfaktoren (Oct3 / 4, Nanog und Sox2); Darüber hinaus kann ein in vitro Differenzierungsfähigkeit hwie bereits in die mesenchymalen Abstammungslinie nicht nur bestätigt (Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten und), sondern auch neuronale Zellen durch zytochemische Färbung und Detektionen von zellspezifischen Genexpression 8.
Abbildung 1. Standort des Beckenkamms des minipig. Der rote Pfeil zeigt die Stelle auf dem Beckenkamm für die Knochenmarkentnahme verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. MSCs aus dem Knochenmark stammen und Synovia von minipigs. (A) Die homogene Morphologie der Primärkulturen von MSCs zeigte eine fibroblastic Form. (B) Die Färbung mit einer Mischung aus5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-phosphat und Nitroblautetrazolium (BCIP / NBT) ergab , die AP - Aktivität in den MSCs bei Passage 3. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Analyse der Zelloberflächenmarker von MSCs abgeleitet aus dem Knochenmark und in der Synovialflüssigkeit von Minipigs bei Passage 3. Die Zelloberflächenmarker von MSCs wurden unter Verwendung einer Durchflusszytometrie - Analyse identifiziert und MSCs wurden identifiziert als positiv sein für CD29, CD44 und Vimentin und negativ für CD34 und CD45. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Minipigs wurden verwendet, MSCs Isolierung aus dem Knochenmark und Gelenkflüssigkeit zu etablieren. Zu verschiedenen physiologischen Bedingungen, wie Alter, Geschlecht und Krankheits, Minipigs von isogenen Hintergrund Spender beseitigen wurden ausgewählt, um genau die Zellquelle abhängigen Charakterisierung auszuwerten. Schweine sind bekannt anatomisch, physiologisch und genetisch ähnlich wie beim Menschen zu sein, und insbesondere minipigs können Größe abgestimmte Organe produzieren; daher können sie als Ersatz Donatorspezies für die Xenotransplantation 14,15 verwendet werden. Im Hinblick auf die vor kurzem vorgeschlagen immunmodulatorische Eigentum von MSCs, indoleamine 2, 3-Dioxygenase (IDO) und Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) wurden mit MSCs verwendet Immunsuppression zu vermitteln, die Spezies-spezifisch ist, obwohl MSCs von Schweinen und Menschen die gleiche IDO haben 9 . So könnte ein Schweinemodell als MSCs Spender für die menschliche Therapien, um wichtige Erkenntnisse der Immunantwort von MSCs sorgen. Darüber hinaus ist die Forschung des Schweine-StammZellen spielt eine wichtige Rolle im biologischen Verständnis von in vitro Verfahren und ihre verschiedenen präklinischen Anwendungen beim Menschen 16,17. Knochenmark und Gelenkflüssigkeit kann nicht-invasiv aus minipigs geerntet werden. Das gesamte Verfahren, aus der Narkose Sammlung zu probieren, reduziert den Stress von systemischen oder lokalen Organe; Daher minipigs kann als Empfänger für die autologe Transplantation verwendet werden. In diesem Experiment wurden MSCs wurden aus dem Knochenmark und Synovialflüssigkeit von Minipigs isoliert, basierend auf die Bestätigung der synovial-fluid-abgeleitete MSCs mit Immunsuppression Kapazitäten abgeleitet von einem RA - Maus - Modell in einer früheren Studie 8
Sammlung von Knochenmark aus den Minipigs
Bei Schweinen aus dem Knochenmark erwachsener Vorläuferzellen sind multipotent und haben Neovaskularisation und Kardiomyozyten Regeneration induziert. Das Alter eines Spenders mit einem erhöhten Fettgehalt zugeordnet ist, undProliferation und Differenzierung von Knochenmark verringert; daher ist Knochenmark nicht die beste Quelle für MSCs bei alten Tieren. Der Beckenkamm in minipigs ist der bevorzugte Ort für Knochenmark abgeleiteten MSC Isolation, weil sie breit und ist ein Low-Risk-Verfahren Website für Ischiasnerv Schäden. Im Fall der im Alter oder Übergewicht minipigs, fettangereicherte dicke Muskeln können auf dem Beckenkamm vorhanden sein. Unter solchen Umständen ist ein stechender Einschnitt auf der Haut notwendig ist und die Biopsienadel bone marrow muss richtig eingesetzt werden, was schwierig sein kann, auf dem Beckenkamm anzuwenden. Eine fehlerhafte Biopsiestelle zu finden, kann zu gescheitert Knochenmarkaspirationen führen, da die Nadel durch den Knochen blockiert wird oder nicht in der Lage sein, das Knochenmark in den Beckenkamm zu erreichen. Daher muss die Biopsienadel korrekt überprüft werden, und die Kenntnis der Dicke des Weichgewebes und der Rinde des Knochens des Beckenkamms erforderlich, vor der Probensammlungen beginnt.
Aspiration von Synovialflüssigkeit aus den Gelenken von Minipigs
Synovialflüssigkeit besteht in den Hohlraum der synovialen Gelenke, und das Volumen der Gelenkflüssigkeit wird in der Regel in entzündeten Gelenken erhöht. Synovial-Flüssigkeit abgeleiteter MSCs werden aus bevorzugten Kandidatenstellen für Knorpelregeneration genommen, sowohl in vivo und in vitro. Zusätzlich wurden sie immunmodulatorische Eigenschaften in RA 8 zu entlocken gezeigt. Synovia ist nicht nur eine leicht zugängliche Quelle, sondern hat auch wertvolle mesenchymalen Eigenschaften. Einschränkungen als Quelle Synovialflüssigkeit Verwendung für MSCs sind die unterschiedlichen Volumina in den Gelenken auf die verschiedenen Größen und pathologischen Zuständen der Gelenke und der Schwierigkeit bei der Verwendung einer 3 ml Spritze zur Synovialflüssigkeit Aspiration von den Gelenken basiert gefunden. Daher sollte die Größe der Spritze sein, von 5 bis 10 ml mit hohem Druck. Zusätzlich Spülen der Synovialflüssigkeit mit 1 bis 2 ml DPBS aus einer Spritzebevorzugt. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann eine große Anzahl von Zellen, die aus kleinen Räumen in den Gelenken erhalten, auch werden.
Charakterisierungen der Knochen marrow- und Synovial-Flüssigkeit abgeleitete MSCs von Minipigs
Beim Menschen sind die Morphologien der synovialen-fluid- und synovialen Membran abgeleitete MSCs von Osteoarthritis - Patienten ähnlich , aber schmaler als die Morphologie von Knochenmark abgeleiteten MSCs 12. Jedoch in in vitro - Kulturen, die Morphologien beider synovial-fluid-abgeleitete MSCs und Knochenmark abgeleitete MSCs wurden beobachtet in diesem Experiment ähnlich. In der früheren Studie der Forscher, die Proliferationsfähigkeit von synovial-fluid-abgeleitete MSCs war hoch, verglichen mit der von Knochenmark abgeleiteten MSCs 8.
MSCs werden aus verschiedenen Gewebequellen in erwachsenen Spendern etabliert; Daher nicht-invasiv erhaltenen Gewebequelle abgeleitete MSCs sind wertvoll für die autologe Stammzellen therapy. Die Zellquelle ist abhängig von den Charakterisierungen und Kapazitäten der Krankheit oder dem Zweck der Stammzelltherapie. Bei Schweinen aus dem Knochenmark erwachsener Vorläuferzellen sind multipotent und haben Neovaskularisation und Kardiomyozyten Regeneration 18,19 induziert. MSCs wurden hauptsächlich isoliert aus dem Knochenmark, aber auch vom Periost, Skelettmuskeln, Synovium, Nabelschnur und Zahngewebe, obwohl Zellen, die aus diesen Geweben zu erhalten ist nicht einfach und zusätzliche chirurgische Verfahren für die Patienten erfordern kann. Jedoch in der Regel das Volumen der Synovialflüssigkeit erhöht in den Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis oder Osteoarthritis, und Biopsien dieser erhöhten Synovialflüssigkeiten verwendet werden zur Diagnose und Behandlung von Patienten. Die Anzahl der MSCs erhöht auch in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit degenerierten Knorpels und Osteoarthritis 20.
In dieser Studie wurden bewertet die Zellphänotypen Knochen marrow- und synovial-fluid-abgeleitete MSCs, eind beide MSCs zeigten ähnliche Expressionsniveaus für Zelloberflächenmarker. Daher ist aus Synovia und bestätigt als MSCs isolierte Zellen haben ähnliche Phänotypen Knochenmark abgeleiteten MSCs in minipigs. Die Forscher der bisherigen Forschung ausgewertet andere Zelloberflächenmarker, wie CD90 und dem großen histokompatibles und komplexe Klasse II (MHC II), und bestätigte eine Kapazität für Multilinien-Differenzierung in die Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten, und Neuronen der Gelenkflüssigkeits abgeleitetes MSCs aus minipigs 8. Beim Menschen ist die Zelloberflächenantigen Profil von synovial-fluid-abgeleiteten MSCs ähnlich der Synovial-Membran- 2,21 und Knochenmark abgeleiteten MSCs. Allerdings wurden CD34 und CD45 Ausdrücke nicht in MSCs erfasst von Synovia abgeleitet in Kiefergelenk Störung Patienten. Somit kann die Mikroumgebung in der gemeinsamen Zellphänotyps von MSCs beeinflussen aus Synovialflüssigkeit abgeleitet. In diesem Experiment wurden die Zellen aus dem Knochen ma erhaltenrrow und Synovialflüssigkeit von Minipigs nicht-invasive Verfahren. Beide Arten von in vitro kultivierten Zellen wurden als MSCs bestätigt, und sie hatten ähnliche Zellphänotypen und gemeinsame kompatibel mesenchymalen Eigenschaften. Synovial-Flüssigkeit abgeleiteter MSCs zeigte jedoch ein größeres Potenzial für eine autologe Stammzellentherapie nicht nur für Knorpel- und Knochenregeneration, sondern auch für die Immunsuppression von Osteoarthritis und RA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
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