Protocol
動物実験は、慶尚大学校での生物医学実験用動物センターによって承認されました。
動物手順1.準備
- 骨髄および滑液からのMSCの非侵襲的なコレクションのために成人女性のミニブタを準備します。麻酔および試料収集の1日前ミニブタの臨床検査を実行します。
- 完全血球計数検査を使用して、体温、呼吸数、および心拍数を含む健康診断のための、および豚の行動と血液学的状態の観察のために臨床的に正常な動物を提供します。
注：臨床的に健康なミニブタのパラメータ間隔は11です - 呼吸数29 /分、68 - 心拍数98 /分、および37 - 体温のために38°C。
- 完全血球計数検査を使用して、体温、呼吸数、および心拍数を含む健康診断のための、および豚の行動と血液学的状態の観察のために臨床的に正常な動物を提供します。
- 12時間のPRIO - 6の術前絶食期間中にケージからすべての食用の寝具を削除若者や成人のミニブタのための麻酔の投与rは、空腹時の3時間は、新生児のために観察されるはずです。麻酔時まで飲料水を提供します。
麻酔のための動物の作製
- アセプロマジン（0.1ミリグラム/キログラム）、メデトミジン（0.03ミリグラム/ kg）で麻酔の投与前ミニブタを薬で治療し、アトロピン（0.04ミリグラム/キログラム）。
- 成人ミニブタについて少なくとも30mmの長さの21 G針を使用して、すべての薬剤を筋肉内（IM）を注射します。横子宮頸部筋肉内または大腿部筋肉に1〜3センチメートル耳の後ろにIM注射を実行します。
注意：動物で恐怖やストレスを誘発または安全に前投薬を注入するために乱暴な取り扱いを必要とせずに、すべての手順を実行します。
- 成人ミニブタについて少なくとも30mmの長さの21 G針を使用して、すべての薬剤を筋肉内（IM）を注射します。横子宮頸部筋肉内または大腿部筋肉に1〜3センチメートル耳の後ろにIM注射を実行します。
- 背臥位でミニブタを置きます。
- 15分前投薬の投与後、1.5％イソフルラン管理を使用して麻酔を開始吸入を介してistered。
- キャリアガスとして酸素（/分1.5 L）で、2.5％の濃度の増加に続いて、気管内チューブを介してイソフルランの吸入（1.5％）を継続します。
- 連続麻酔中ミニブタの心拍数、体温、および経皮的血液酸素飽和度（SpO 2）モニタ。体温を維持するために39°C - 38の温度で循環水ブランケットを使用してください。麻酔中に乾燥から目を保護するために眼科軟膏を適用します。
- 麻酔13の深さを評価するGuedelの分類に従ってください。
細胞の単離および培養のための3の準備
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した高度ダルベッコ改変イーグル培地（ADMEM）、1％グルタマックス500mlの、塩基性線維芽細胞成長ファクトを10ng / mlのを準備する、骨髄および滑液由来するMSCを培養しますR（bFGFを）、および1.0％ペニシリン - ストレプトマイシン（それぞれ万IU 10,000μgの/ mlの、ペニシリン - ストレプトマイシン）。
- CO 2インキュベーター内で5％CO 2の加湿雰囲気中で38.5℃でADMEMをインキュベートします。
- 細胞分離および洗浄のための製造業者の指示に従ってダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）500mlのを準備します。
4.ミニブタから骨髄を収集
- エリア腸骨稜（ 図1）上のサイズは約15×15センチ選択し、滅菌剃刀や電気バリカンを使用して、この領域から毛を取り除きます。ポビドンヨードおよび70％エタノール：ミニブタが配置されると、交互に次の消毒剤を使用して手順サイトを3回スクラブ。領域が完全に乾燥した後、滅菌ドレープを適用します。
- ejec前にヘパリンの4ミリリットル - プレコート10mlを3でそれをすすぐことによって、ヘパリンの100 U / mlのシリンジティン抗凝固剤。
注：骨髄穿刺時にシリンジ内の凝固を避けるために、この手順を実行します。 - しっかりとヘパリンプレコートされた10ミリリットルの注射器に取り付けられた骨髄抽出（3.0×100ミリメートル）を使用して、麻酔下でミニブタの腸骨稜骨から骨髄の5ミリリットルの最小値を抽出します。
骨髄からとインビトロ栽培で抽出した細胞の単離5.
- 抽出された骨髄から細胞を単離します。
- 室温で15 mLのコニカルチューブ中のDPBSの等量で抽出した骨髄を希釈します。
- 15ミリリットルコニカルチューブに密度遠心分離培地（フィコール・パック）の3ミリリットルを追加します。
- 室温で40分間、400×gでで4 mLの混合せずに密度遠心分離媒体上に配置されるDPBSで骨髄の層、及び遠心分離して希釈します。
- 単核細胞層を回収します血漿（上層）と密度遠心分離媒体（下層）を含む二つの層の間に軟膜から（多国籍企業）、そして15mlコニカルチューブに多国籍企業を移します。
- 7で転送多国籍企業を希釈 - DPBSの8ミリリットル、室温で10分間、500×gで、それらを遠心分離します。上清を捨て、DPBSで細胞を2回洗浄します。
- ADMEM 2ml中の細胞ペレットを中断し、35mm組織培養皿に移します。 5％CO 2の加湿雰囲気中で38.5℃で培養皿をインキュベートします。
- 骨髄から単離された細胞のインビトロ培養で 。
- 48時間後、皿に付着していない細胞を含む培地を吸引し、ADMEMの2ミリリットルを交換し、5％のCO 2の加湿雰囲気中で38.5℃で静置します。すべての第三日間培養液を交換します。
- 80％の密集度、DPBSで細胞を洗浄し、0.25％の1mlでそれらを分離 - 70でトリプシン/ EDTA、3 37℃でそれらをインキュベートする - 細胞が剥がれるまで5分。
- ADMEMを10mlを用いて細胞を収穫を15mlコニカルチューブにそれらを転送し、室温で5分間、300×gで、それらを遠心。上清を捨てます。
- 新鮮なADMEMの1ミリリットルで収穫された細胞を懸濁し、血球計数器を使用してそれらを数えます。
- 5に細胞を置き- ADMEMの4ミリリットルを含む7.5×10 5 / 25Tフラスコ、5％CO 2の加湿雰囲気中で38.5℃でそれらをインキュベートします。二日おきに培地を変更します。
ミニブタから関節液の6集
- 骨髄穿刺するための手順と同様に、大腿関節の上に約15×10センチメートル（長さ/幅）の適切な領域を選択し、滅菌剃刀や電気バリカンを使って髪を除去、消毒手順（ステップ4.1）によって従ってください。
- 23 Gで3 mlシリンジを挿入触診のランドマーク（膝蓋骨と脛骨稜）の後に関節に針。
- 関節における滑液の吸引のための注射器に穏やかな吸引を適用します。 1ミリリットルが、これはミニブタや関節の大きさに応じて変化する - 関節から採取した滑液のおおよその体積は0.5です。滑液の収集量が少なすぎると滑液腔にDPBSを通してフラッシュします。
- 直ちに血液による汚染を避けるために注射器を引き抜きます。
収集された関節液からおよびインビトロ栽培7.細胞の単離
- 吸引滑液から細胞を分離します。
- 室温で15ミリリットルコニカルチューブ内のDPBS等量の吸引滑液を希釈します。
- 破片を除去するために、40μmのナイロン細胞ストレーナーを用いて希釈滑液をフィルタリングします。
- フィルタリング滑膜を含むチューブにDPBSの10ミリリットルを追加します。流体、室温で10分間、400×gで遠心分離して。上清を捨て、DPBSで細胞を2回洗浄します。
- 2のセルを配置し、ADMEM 2ml中の細胞ペレットを懸濁- ADMEM 2mlで3×10 5細胞/ 35 mm組織培養皿、および5％CO 2の加湿雰囲気中で38.5℃でそれらをインキュベート。
- 孤立した滑液由来MSCのin vitro培養のための手順を繰り返し5.2。
ミニブタの8.ポスト手順ケア
- 必要に応じて、骨髄採取後、皮膚ステープラーを使用して、単一の縫合糸を用いて骨髄抽出注射部位の皮膚を閉じます。
- 手順が完了した後、3日間1日1回ミニブタへのエンロフロキサシン（5mg / kg）およびメロキシカム（0.2ミリグラム/ kg）を筋肉内注射を投与します。
- 手順が完了した後、骨髄および滑液収集部位を消毒3日間、一日一回、0.1％ポビドンヨードを持ちます。慎重な合併症の兆候（ 例えば 、腫れ、膿、または赤み）を監視するために毎日観察します。
フローサイトメトリーを使用した9セルの表現型
- 継代3 80％コンフルエント - 5 - 、DPBSで細胞を洗浄し、0.25％（v / v）のトリプシン/ EDTA 1mlで扱うMSCは70である場合。細胞が剥離するまで5分 - そして、3 37℃でそれらをインキュベートします。
- DPBSを10mlを用いて細胞を収穫を15mlコニカルチューブにそれらを転送し、室温で5分間、300×gで、それらを遠心。上澄み液を捨てます。
- 細胞を固定し、3.7％ホルムアルデヒド溶液10mlに細胞ペレットを懸濁し、分析前に一日4℃でそれらを維持します。
- ある日固定した後、DPBSは二回5分毎時間、300×gで遠心分離を用いて細胞を洗浄。上澄み液を捨てます。
- 4ミリリットル中に細胞ペレットを一時停止1％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）を補充し、非特異的Fc媒介性相互作用をブロックするために4℃で1時間ペレットをインキュベートさDPBSの。
- 1.5ミリリットルチューブに細胞懸濁液の500μlのアリコートを配布します。
- 非結合抗体（CD29及びビメンチン）のために、3分間300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。上澄み液を捨てます。
- 1500μlの中で細胞ペレットサスペンド：一次抗体の100倍希釈をし、4℃で1時間静置します。
- 毎回5分間、300×gで遠心分離することにより、1％ウシ血清アルブミンで細胞を2回洗浄します。上澄み液を捨てます。
- 二次抗体を抱合フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の100倍希釈し、4℃の暗所で1時間のためにそれをインキュベート：1500μlの中で細胞ペレットを中断します。
- FITC結合抗体（アイソタイプ、CD34、CD44およびCD45）について、centrifuによって細胞を洗浄3分間300×gでゲーション。上澄み液を捨てます。
- 1500μlの中で細胞ペレットサスペンド：100 FITC結合抗体を、4℃の暗所で1時間のためにそれをインキュベートします。
- 両方の染色条件のために、5分間G×300での遠心分離によってDPBSで2回時間細胞を洗浄します。上澄み液を捨てます。
- DPBS500μlの中に細胞をサスペンド、5ミリリットル丸底チューブにそれらを転送し、8フローサイトメーターを使用して結果を分析します。
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Representative Results
ミニブタの骨髄および滑液由来MSCの設立
MSCは、正常（ 図2）骨髄およびミニブタの関節滑膜関節から単離され、 インビトロで増殖させました。滑液のシリンジ吸引が簡単であり、初代細胞のインビトロ培養中に十分な接着性細胞を得ることが可能です。滑膜流体由来MSCの形態は、骨髄由来のMSCと同様であり、両方のMSCは、線維芽細胞、スピンドル形状を有し、均一に付着されています。第三の継代培養が完了した後、それらは、アルカリホスファターゼ（AP）染色陽性発現を有することが観察されました。
骨髄および関節液由来MSCの細胞表現型の評価ミニブタの
細胞表面マーカーのアッセイはミニブタの骨髄および滑膜流体由来MSCの表現型を作成するために行きました。 CD34とCD45の表現はの≤2％（負と低かったのに対し、 - （陽性細胞の99％≥96）MSCのどちらのタイプには、CD29、CD44、およびビメンチン陽性細胞表面マーカー、かなりの量のを表明しました陽性細胞）（ 図3）。これらの結果は、滑液から単離された細胞を含む独特のMSCから得られたものと同一であり、これらのMSC間の細胞表面マーカーに有意差はなかったです。骨髄および滑液から単離された細胞は、我々の以前の研究8中のMSCとして確認されています。骨髄および滑液由来MSCの両方が、幹細胞転写因子（のOct3 / 4、Nanogの、およびSox2の）を発現し;さらに、in vitroでの分化能の時間細胞化学染色および細胞特異的遺伝子発現8の検出によってのみならず、間葉系系統（骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞）だけでなく、神経細胞に確認されて。
ミニブタの腸骨稜の図1.ロケーション赤い矢印は骨髄採取のために使用される腸骨稜上の部位を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
骨髄とミニブタの滑液由来。（A）図2. MSCは MSCの初代培養物の均質な形態は、線維芽細胞の形状を明らかにしました。 （B）の混合物を用いた染色5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウム（BCIP / NBT）は通路3スケールバーでのMSCにAP活性を明らかにした：100ミクロンはこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 MSCの細胞表面マーカーをフローサイトメトリー分析を用いて同定した通路3に骨髄とミニブタの滑液由来するMSCの細胞表面マーカーの分析 、およびMSCがCD29、CD44について陽性であると同定されました、ビメンチンおよびCD34およびCD45について陰性とは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ミニブタは、骨髄および滑液からのMSCの単離を確立するために使用しました。年齢、性別、および疾患などの様々な生理的条件を、排除するために、同質遺伝子背景ドナーからのミニブタは正確に細胞源に依存する特性化を評価するために選ばれました。ブタであることが知られている解剖学的、生理学的、および遺伝的にヒトに類似し、特に、サイズが一致した臓器を作り出すことができるミニブタ。従って、それらは、異種移植14,15の代替ドナー種とし て使用することができます。ブタおよびヒトからMSCは同じIDOを持っているがMSCは、インドールアミン2、3ジオキシゲナーゼ（IDO）と一酸化窒素合成酵素（NOS）の最近示唆免疫調節プロパティについては、種特異的である免疫抑制を媒介するためのMSCで使用された9 。したがって、MSCの供与体としてブタモデルは、ヒトの治療のためのMSCの免疫応答の重要な洞察を提供するかもしれません。さらに、ブタの幹の研究細胞は、in vitroでのプロセスと人間16,17におけるそれらの様々な前臨床用途の生物学を理解する上で重要な役割を果たしています。骨髄および滑液を非侵襲的にミニブタから回収することができます。麻酔からのサンプル収集に手順全体は、全身または局所の臓器のストレスレベルを減少させました。従って、ミニブタは、自家移植のためのレシピエントとして使用することができます。この実験では、MSCは、以前の研究では、RAマウスモデル由来の免疫抑制能力を持つ滑膜流体由来MSCの確認に基づいて、骨髄およびミニブタの滑液から単離された8
ミニブタからの骨髄のコレクション
ブタでは、骨髄由来の成体前駆細胞は多能であり、血管新生および心筋細胞の再生を誘導しています。ドナーの年齢が増加した脂肪含有量に関連付けられており、増殖および骨髄の分化を減少、したがって、骨髄は、高齢の動物でのMSCの最高のソースではありません。それは広く、坐骨神経損傷のための低リスクの手続きサイトですので、ミニブタにおける腸骨稜は、骨髄由来のMSCの単離のための好ましい部位です。高齢者や太りすぎのミニブタの場合には、脂肪濃縮太い筋肉は腸骨稜上に存在することができます。このような状況下で、腸骨稜に適用することは困難であることができる、皮膚に刺し切開が必要であり、骨髄生検針が正しく挿入されなければなりません。針が骨にブロックされた状態になるか、腸骨稜の内側骨髄に達することができない場合がありますので、正確な生検のサイトを見つけるために失敗すると、失敗した骨髄の願望につながる可能性があります。したがって、生検針を適切にチェックしなければならない、と軟部組織の厚さと腸骨稜の骨の皮質の知識は、サンプル収集を開始する前に必要とされます。
ミニブタの接合部からの流体滑膜の "jove_content"> 吸引
滑液は、滑膜関節のキャビティ内に存在し、滑液の量は、通常、炎症を起こした関節に増加します。滑膜流体由来MSCは、 インビボおよびインビトロの両方で 、軟骨再生のための好ましい候補部位から採取されます。さらに、それらは、RA 8で免疫調節特性を誘発することが示されています。滑液はないだけで簡単にアクセス源であるだけでなく、貴重な間葉特性を有しています。 MSCのソースとして滑液を使用する場合の制限は、さまざまなサイズや関節の病態や関節からの滑液吸引に3ミリリットル注射器を使用する際の困難性に基づく関節に見られる異なるボリュームです。高い圧力で10ミリリットル - したがって、注射器の大きさは5でなければなりません。注射器からのDPBSの2ミリリットル - 1と滑液の他に、フラッシング好ましいです。この方法を用いることにより、多数のセルがあっても関節の小さなスペースから得ることができます。
ミニブタの骨marrow-及び滑膜流体由来MSCのキャラクタリゼーション
ヒトでは、変形性関節症患者からの滑膜-流体-及び滑膜-膜由来MSCの形態が類似しているが、骨髄由来MSC 12の形態よりも狭くなっています。しかし、 インビトロ培養において、両方の滑膜流体由来MSCの形態とは、骨髄由来MSCは、この実験では類似していることが観察されました。研究者の以前の研究では、滑膜流体由来MSCの増殖能は、骨髄由来MSC 8のそれに比べて、高いものでした。
MSCは、成人ドナーにおける様々な組織源から確立されています。したがって、非侵襲的に得られた組織源由来MSCは自家幹細胞番目のために価値がありますerapy。細胞源は、幹細胞治療の疾患または目的の特性評価と能力に依存しています。豚では、骨髄由来の成体前駆細胞は多能であり、血管新生および心筋再生18,19を誘発しました。これらの組織から細胞を得ることが容易ではない患者のために追加の外科手術を必要とするが、MSCは、主に、骨髄からだけでなく、骨膜、骨格筋、滑膜、臍帯、及び歯の組織から単離されています。しかし、滑液の量は、通常、変形性関節症またはRA患者の関節に増加し、この増加した滑液の生検は、患者を診断し、治療するために使用されます。 MSCの数はまた、変性軟骨および骨関節炎20の患者の滑液中で増加します。
本研究では、骨marrow-および滑膜流体由来MSCの細胞表現型を評価しました、D MSCの両方が細胞表面マーカーについての発現の同様のレベルを提示しました。したがって、滑液から単離されたMSCであることが確認された細胞は、ミニブタにおける骨髄由来MSCと類似の表現型を持っています。研究者のこれまでの研究では、このようなCD90および主要組織適合性と複合体クラスII（MHC II）のような他の細胞表面マーカーを、評価、および滑膜流体の骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、およびニューロンへの多系列分化能を確認しましたミニブタ8から由来のMSC。ヒトでは、滑膜流体由来MSCの細胞表面抗原プロファイルは、滑膜-、膜2,21と骨髄由来MSCと同様です。しかし、CD34とCD45式は顎関節疾患患者の滑液由来のMSCは検出されませんでした。このように、関節内の微小環境は、滑液由来MSCの細胞の表現型に影響を与える可能性があります。この実験では、細胞は、骨、MAから入手しました。rrowおよび非侵襲的な方法を用いて、ミニブタの滑液。 in vitroで培養した細胞の両方のタイプは、MSCのように確認され、それらは類似の細胞表現型および共有互換性間葉特性を有していました。しかし、滑膜流体由来MSCだけでなく、軟骨および骨再生のための自家幹細胞治療のためだけでなく、変形性関節症およびRAの免疫抑制のための大きな可能性を示しました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
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