Protocol
Эксперименты на животных были утверждены Центром животных для медико-биологических экспериментированию в Кёнсан национальном университете.
1. Подготовка к процедуре животных
- Подготовка взрослой женщины карликовых свиней для неинвазивного сбора MSCs из костного мозга и синовиальной жидкости. Провести клиническое обследование на карликовых свиней за один день до анестезии и сбора образцов.
- Обеспечить клинически здоровых животных для физических исследований, которые включают в себя температуру тела, частоту дыхания и частоту сердечных сокращений, а также для наблюдения за поведением и гематологическими статусов свиней, используя полные тесты анализ крови.
Примечание: интервалы параметров для клинически здоровых карликовых свиней составляет 11 - 29 об / мин для частоты дыхания, 68 - 98 об / мин для частоты сердечных сокращений, и 37 - 38 ° C для температуры тела.
- Обеспечить клинически здоровых животных для физических исследований, которые включают в себя температуру тела, частоту дыхания и частоту сердечных сокращений, а также для наблюдения за поведением и гематологическими статусов свиней, используя полные тесты анализ крови.
- Удалите все съедобное постельные принадлежности из клетки во время предоперационного периода голодания 6 - 12 ч Приог до введения анестезии для молодых и взрослых карликовых свиней, 3 ч голодания следует соблюдать для новорожденных. Обеспечить не питьевой воды до времени анестезии.
2. Подготовка животных для наркоза
- Medicate за карликовых свиней перед введением анестезии с ацепромазина (0,1 мг / кг), медетомидин (0,03 мг / кг) и атропин (0,04 мг / кг).
- Вводят все лекарства внутримышечно (IM) с использованием 21 G иглы длиной не менее 30 мм для взрослых карликовых свиней. Выполнять им инъекции 1-3 см позади уха в боковой шейки мышцу или в мышцу бедра.
Примечание: Выполнить все процедуры, не вызывая страх или стресс у животных или требующих грубого обращения, чтобы безопасно вводить премедикацию.
- Вводят все лекарства внутримышечно (IM) с использованием 21 G иглы длиной не менее 30 мм для взрослых карликовых свиней. Выполнять им инъекции 1-3 см позади уха в боковой шейки мышцу или в мышцу бедра.
- Поместите карликовых свиней в дорсальной-лежачем положении.
- Через пятнадцать минут после введения премедикации, инициировать анестезии с использованием 1,5% изофлуран администратораровано при вдыхании.
- Продолжить вдыхания изофлуран (1,5%) через эндотрахеальную трубку, с последующим повышением концентрации до 2,5%, при этом кислород (1,5 л / мин) в качестве газа-носителя.
- Постоянно контролировать частоту сердечных сокращений, температуру тела, и чрескожное насыщение крови кислородом (SPO 2) карликовых свиней во время анестезии. Используйте циркулирующий одеяло воды при температуре 38 - 39 ° C для поддержания температуры тела. Нанесите мазь офтальмологическое, чтобы защитить глаза от высыхания во время анестезии.
- Следуйте классификации Guedel, чтобы оценить глубину анестезии 13.
3. Подготовка к клеточной выделения и культивирования
- Культивировать MSCs полученных из костного мозга и синовиальной жидкости, готовят 500 мл модифицированной Дульбекко прогрессирующей Дульбекко (ADMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% GlutaMAX, 10 нг / мл роста фибробластов-фактог (bFGF), а 1,0% пенициллина-стрептомицина (10000 МЕ и 10000 мкг / мл, соответственно, Пен-Strep).
- Выдержите ADMEM при 38,5 ° C в увлажненной атмосфере 5% CO 2 в СО 2 инкубаторе.
- Приготовьте 500 мл фосфатного буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) в соответствии с инструкциями изготовителя для выделения клеток и промывки.
4. Сбор костного мозга от карликовых свиней
- Выберите область примерно 15 х 15 см в диаметре на гребень подвздошной кости (рисунок 1), и удалите волосы из этой области , используя стерилизованные безопасные бритвы или электрические ножницы. После того, как minipig позиционируется, поочередно вычистить процедурой сайту три раза со следующими агентами стерилизации: йодповидон и 70% этанола. После того, как область полностью не высохнет, нанесите стерильными пеленками.
- Предварительное покрытие 10 мл шприц с 100 ед / мл гепарина, промыв его с 3 - 4 мл гепарина до ejecтин анти-коагулирующего агента.
Примечание: Выполните этот шаг, чтобы избежать коагуляции в шприце во время аспирации костного мозга. - Экстракт минимум 5 мл костного мозга из подвздошного гребня кости minipig под анестезией, используя экстрактор костного мозга (3,0 × 100 мм), плотно прикрепленную к гепарин, предварительно покрытые шприц объемом 10 мл.
5. Выделение клеток Извлеченные из костного мозга и In Vitro Выращивание
- Изолировать клетки из извлеченного костного мозга.
- Развести извлеченный костный мозг с равным объемом ДЗФР в конической пробирке объемом 15 мл при комнатной температуре.
- Добавьте 3 мл плотности центрифугирование среды (Ficoll-Paque) в 15 мл коническую трубку.
- Развести 4 мл слой костного мозга с ДЗФР, который расположен на центрифугирование средств массовой плотности без перемешивания и центрифугируйте при 400 × г в течение 40 мин при комнатной температуре.
- Заготавливают слой мононуклеарных клеток(МНК) из лейкоцитарной пленки между двумя слоями, содержащими плазму (верхний слой) и плотность центрифугирование среды (нижний слой), и передать МНК в 15 мл коническую трубку.
- Развести перенесенные МНК с 7 - 8 мл ДЗФР и отцентрифугированы при 500 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и промыть клетки дважды с ДЗФР.
- Приостановить осадок клеток в 2 мл ADMEM и перенести его на 35 мм блюдо культуры ткани в. Инкубируют культуры блюдо при 38,5 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2.
- В пробирке культивирования клеток , выделенных из костного мозга.
- Через 48 ч аспирата среду с клетками, которые не прикреплены к чашке, и заменить 2 мл ADMEM и инкубировать ее при 38,5 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2. Изменение среды каждые третьи сутки.
- При температуре 70 - 80% сплошности, мыть клетки с ДЗФР, диссоциируют их с 1 мл 0,25%трипсин / ЭДТА, и инкубировать их при 37 ° С в течение 3 - 5 мин до тех пор, пока клетки не отделяться.
- Сбора клеток, используя 10 мл ADMEM, перевести их в 15 мл коническую пробирку и центрифугировать их при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
- Приостановка собранных клеток в 1 мл свежей ADMEM и сосчитать их с помощью гемоцитометра.
- Поместите клетки в 5 - 7,5 х 10 5 / 25Т колбу , содержащую 4 мл ADMEM и инкубировать их при 38,5 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2. Изменение среды каждый третий день.
6. Сбор синовиальной жидкости из карликовых свиней
- Аналогично процедуре аспирации костного мозга, выберите соответствующую область приблизительно 15 х 10 см (длина / ширина) над бедренной сустава и удалить волосы с помощью стерилизованных безопасных бритв или электрические машинки для стрижки, следуйте по процедурам санитарной обработки (шаг 4.1).
- Вставка 3 мл шприц с 23 гиглы в суставе после ориентиров пальпации (надколенника и большеберцовой кости гребень).
- Слегка отсос к шприцам для аспирации синовиальной жидкости в суставе. Примерный объем синовиальной жидкости, собранной из сустава составляет 0,5 - 1 мл, но это зависит от размера minipig или сустава. Промыть через ДЗФР в синовиальной полости, если собранный объем синовиальной жидкости слишком мала.
- Немедленно снять шприц, чтобы избежать загрязнения с кровью.
7. Выделение клеток из собранных синовиальной жидкости и в пробирке Выращивание
- Изолировать клеток от всасываемого синовиальной жидкости.
- Развести Аспирированную синовиальную жидкость с равным объемом ДЗФР в 15 мл коническую пробирку при комнатной температуре.
- Для того, чтобы удалить мусор, фильтровать разбавленный синовиальной жидкости с помощью нейлоновой ячейки фильтра 40 мкм.
- Добавьте 10 мл ДЗФР в пробирку, содержащую отфильтрованный синовиальнойжидкость и центрифугировать ее при 400 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и промыть клетки дважды с ДЗФР.
- Приостановка осадок клеток в 2 мл ADMEM, поместить клетки на 2 - 3 х 10 5 клеток / 35 мм блюдо культуры ткани с 2 мл ADMEM, и инкубировать их при 38,5 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2 ,
- Повторите шаг 5.2 для выращивания в пробирке изолированных синовиальной жидкости , полученных MSCs.
8. После процедуры ухода из карликовых свиней
- При необходимости, закройте кожу в месте инъекции экстрактор участка костного мозга с одним швом степлером кожи, после сбора костного мозга.
- После завершения процедуры, администрирование внутримышечную инъекцию энрофлоксацину (5 мг / кг) и мелоксикам (0,2 мг / кг) до карликовых свиней один раз в день в течение 3-х дней.
- После того, как процедура закончена, дезинфицируют костный мозг и синовиальной жидкости места сборас 0,1% повидон-йод один раз в день в течение 3-х дней. Тщательно соблюдайте ежедневно следить за признаками осложнений (например, отек, гной или покраснение).
9. Мобильный Фенотипирование Использование проточной цитометрии
- Когда MSCs составляют 70 - 80% сливающийся в проходах 3 - 5, мыть клетки с ДЗФР и относиться к ним с 1 мл 0,25% (об / об) трипсин / ЭДТА. Затем, инкубировать их при 37 ° С в течение 3 - 5 мин до тех пор, пока клетки не отсоединяются.
- Сбора клеток, используя 10 мл ДЗФР, перевести их в 15 мл коническую пробирку и центрифугировать их при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Отменить решение надосадочную.
- Чтобы зафиксировать клетки, приостановить осадок клеток в 10 мл 3,7% раствора формальдегида и держать их при температуре 4 ° С в течение одного дня перед анализом.
- Однажды после фиксации, мыть клетки с DPBS дважды с помощью центрифугирования при 300 × г в течение 5 мин каждый раз. Отменить решение надосадочную.
- Приостановить осадок клеток в 4 млиз ДЗФР, дополненную 1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА), и инкубацию гранулы в течение 1 часа при 4 ° С, чтобы блокировать неспецифические Fc-опосредованной взаимодействий.
- Распределить 500 мкл аликвоты суспензии клеток в 1,5 мл пробирки.
- Для получения неконъюгированных антител (CD29 и Виментин), промыть клетки центрифугированием при 300 × г в течение 3 мин. Отменить решение надосадочную.
- Приостановка осадок клеток в 500 мкл 1: 100 разбавление первичного антитела и инкубировать ее в течение 1 часа при 4 ° С.
- Вымойте клетки в два раза с 1% бычьего сывороточного альбумина путем центрифугирования при 300 × г в течение 5 мин каждый раз. Отменить решение надосадочную.
- Приостановка осадок клеток в 500 мкл 1: 100 разбавлении изотиоцианат флуоресцеина (FITC) -conjugated вторичного антитела и инкубировать ее в течение 1 ч в темноте при 4 ° C.
- Для FITC-конъюгированных антител (изотип, CD34, CD44 и CD45), промыть клетки с помощью centrifuдование при 300 × г в течение 3 мин. Отменить решение надосадочную.
- Приостановка осадок клеток в 500 мкл 1: 100 FITC-конъюгированного антитела и инкубировать ее в течение 1 ч в темноте при температуре 4 ° С.
- Для обоих условий окрашивания, мыть клетки дважды с ДЗФР центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин каждый раз. Отменить решение надосадочную.
- Приостановить клеток в 500 мкл ДЗФР, передавать их в 5 мл с круглым дном трубки, и анализировать результаты с использованием проточного цитометра 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание MSCs , полученные из костного мозга и синовиальной жидкости карликовых свиней
MSCs были успешно выделены из костного мозга и суставных синовиальных суставов карликовых свиней и расширена в пробирке (Рисунок 2). Шприц аспирации синовиальной жидкости является простым, и можно получить достаточное количество клеток прилипшие во время культивирования в пробирке первичных клеток. Морфология синовиальной жидкости производный ПКЦ аналогична из костного мозга, полученных ПКЦ, и оба MSCs имеют форму веретена фибробластов и однородно клейкий. Они наблюдали, чтобы иметь положительное выражение для щелочной фосфатазы (AP) окрашивания, после того, как третья субкультура была завершена.
Оценка клеточного фенотипа ПКЦ , полученную из костного мозга и синовиальной жидкостииз карликовых свиней
Анализы маркеров клеточной поверхности были выполнены, чтобы создать фенотип костного мозга и синовиальной жидкости, полученных из ПКЦ из карликовых свиней. Оба типа ПКЦ выражены значительные количества положительных маркеров клеточной поверхности, таких как CD29, CD44 и Виментин (≥96 - 99% положительных клеток), в то время как выражения CD34 и CD45 были отрицательными и низким (≤2% от положительных клеток) (рисунок 3). Эти результаты были идентичны таковым, полученным из отличительных ПКЦ, в том числе клеток, выделенных из синовиальной жидкости, и не было никаких существенных различий в маркеров клеточной поверхности между этими ПКЦ. Клетки , выделенные из костного мозга и синовиальной жидкости были подтверждены как MSCs в нашем предыдущем исследовании 8. Обе кости marrow- и синовиальной жидкости, полученных MSCs выражается стволовых клеток транскрипционные факторы (Oct3 / 4, Nanog и Sox2); кроме того, в пробирке дифференциации способность ч, как было подтверждено не только в мезенхимального происхождения (остеоциты, адипоциты и хондроциты), но и нервные клетки цитохимическим окрашивания и обнаружений экспрессии генов клеток специфических 8.
Рисунок 1. Расположение подвздошной гребня minipig. Красная стрелка представляет собой участок на гребня подвздошной кости , используемой для сбора костного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. MSCs , полученные из костного мозга и синовиальной жидкости. Карликовых свиней (А) однородна морфология первичных культур ПКЦ выявили форму фибробластов. (В) Окрашивание смесью5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат и нитро синий тетразолия (BCIP / NBT) показал активность AP в MSCs при прохождении 3. Шкала бар: 100 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ клеточных поверхностных маркеров ПКЦ , полученных из костного мозга и синовиальной жидкости карликовых свиней при прохождении 3. клеточной поверхности маркеры ПКЦ были идентифицированы с использованием проточной цитометрии анализа, и МСК были идентифицированы как положительные для CD29, CD44 и Виментин и отрицательным для CD34 и CD45. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Карликовых свиней были использованы для создания изоляции от МСК костного мозга и синовиальной жидкости. Для устранения различных физиологических состояний, таких как возраст, пол, и болезни, от карликовых свиней изогенных фоне доноров были выбраны, чтобы точно оценить источник клеток зависимой характеристики. Свиньи, как известно, анатомически, физиологически и генетически похожи на людей, и в частности, карликовых свиней могут производить размер соответствием органы; Таким образом, они могут быть использованы в качестве донорских видов заменителем для ксенотрансплантации 14,15. Относительно недавно предложили иммуномодулирующее свойство MSCs, indoleamine 2, 3-диоксигеназы (IDO) и синтазы окиси азота (NOS) , были использованы с MSCs посредничать иммуносупрессии, который является видовым, хотя MSCs от свиней и людей имеют тот же IDO 9 , Таким образом, модель свиньи в качестве донора ПКЦ может предоставить важную информацию о иммунных реакций MSCs для человека терапии. Кроме того, исследование свиных стебляклетки играют важную роль в биологическом понимании процессов в пробирке и их различных доклинических применения у людей 16,17. Костный мозг и синовиальную жидкость может быть неинвазивным собирают из карликовых свиней. Вся процедура, от анестезии для сбора проб, снижение уровня стресса системных или местных органов; Поэтому, карликовых свиней может быть использован в качестве реципиентов для трансплантации аутологичных. В этом эксперименте МСК были выделены из костного мозга и синовиальной жидкости карликовых свиней, на основе подтверждения синовиальной одножидкостной полученных ПКЦ с иммуносупрессия мощностей , полученных из мышиной модели РА в предыдущем исследовании 8
Сбор костного мозга от карликовых свиней
У свиней, клетки-предшественники взрослых, полученные из костного мозга мультипотентны и побудили неоваскуляризации и регенерации кардиомиоцитов. Возраст донора связано с повышенным содержанием жира иуменьшилось пролиферации и дифференцировки костного мозга; Таким образом, костный мозг не является лучшим источником MSCs в возрасте от животных. Гребня подвздошной кости в карликовых свиней является предпочтительным местом для костного мозга, полученного MSC изоляции, потому что это широкая и процедура сайта низкого риска для седалищного повреждения нервов. В случае возрасте или с избыточной массой тела карликовых свиней, жир, обогащенный толстые мышцы могут присутствовать на гребень подвздошной кости. При таких обстоятельствах, поножовщиной надрез на коже необходимо и пункционной биопсии костного мозга должна быть вставлена правильно, что может быть трудно применить на гребень подвздошной кости. Неспособность найти сайт правильной биопсии может привести к неудачным устремлениями костного мозга, так как игла блокируется костью или не может быть в состоянии достигнуть костный мозг внутри гребня подвздошной кости. Поэтому биопсия должна быть проверена должным образом, и знание толщины мягких тканей и коры кости гребня подвздошной кости требуется перед началом коллекции образцов.
аспирация синовиальной жидкости из суставов карликовых свиней
Синовиальной жидкости существует в полости синовиальных суставов, а объем синовиальной жидкости обычно увеличивается в воспаленных суставах. Синовиальной-жидкость полученных MSCs взяты из предпочтительных кандидатов участков для регенерации хрящевой ткани, как в естественных условиях и в пробирке. Кроме того, они , как было показано , чтобы вызвать иммуномодулирующими свойствами в RA 8. Синовиальная жидкость является не только легко доступным источником, но и обладает ценными свойствами мезенхимальные. Ограничения использования синовиальной жидкости в качестве источника для ПКЦ являются различные объемы, найденные в суставах, основанных на различных размеров и патологических состояний суставов и трудности при использовании 3 мл шприца для синовиальную жидкость аспирации из суставов. Таким образом, размер шприца должен быть не менее 5 - 10 мл, с высоким давлением. Кроме того, промывка синовиальной жидкости с 1 - 2 мл ДЗФР из шприцаявляется предпочтительным. При использовании этого метода, большое количество клеток, могут быть получены, даже от небольших пространств в суставах.
Характеризации костно-marrow- и синовиальной жидкости-производных MSCs из карликовых свиней
В организме человека Морфология синовиальной-fluid- и синовиальной мембраной , полученных от пациентов с ПКЦ остеоартритом сходны , но уже , чем морфологию костного мозга , полученных ПКЦ 12. Тем не менее, в в пробирке культурах, наблюдались Морфология обоих синовиальной жидкости , полученных из ПКЦ и костного мозга , полученных ПКЦ быть похожими в этом эксперименте. В предыдущем исследовании исследователей, способность пролиферации синовиальной жидкости , полученных из MSCs была высокой, по сравнению с костным мозгом полученных MSCs 8.
MSCs устанавливаются из различных источников ткани у взрослых доноров; Таким образом, неинвазивным полученные ткани-источника происхождения MSCs являются ценными для аутологичных стволовых клеток-йerapy. Источник клеток зависит от характеристик и возможностей заболевания или цели терапии стволовых клеток. У свиней, клетки - предшественники взрослых , полученные из костного мозга мультипотентны и индуцировали образование новых сосудов и кардиомиоцитов регенерации 18,19. MSCs были в основном изолированы из костного мозга, но и от надкостницы, скелетных мышцах, синовиальной оболочки, пуповины и зубных тканей, хотя получение клеток из этих тканей не так просто и может потребовать дополнительных хирургических процедур для пациентов. Тем не менее, объем синовиальной жидкости, как правило, увеличивается в суставах остеоартрита или больных РА, а также биопсию этих повышенных синовиальной жидкости используются для диагностики и лечения пациентов. Число ПКЦ также увеличивается в синовиальной жидкости пациентов с вырожденной хрящевой и остеоартрита 20.
В этом исследовании, клеточные фенотипы кости marrow- и синовиальной жидкости, полученных из MSCs оценивали, А.Н.d как MSCs представлены аналогичные уровни экспрессии для маркеров клеточной поверхности. Таким образом, клетки, выделенные из синовиальной жидкости и подтвержденные в MSCs имеют сходные фенотипы до костного мозга, полученных в MSCs карликовых свиней. Предыдущие исследования исследователей оценивали другие маркеры клеточной поверхности, например, CD90 и крупного гистосовместимого и сложного класса II (MHC II), и подтвердили способность к мульти-клонального дифференциации в Остеоциты, адипоциты, хондроциты и нейроны синовиальной жидкости -derived MSCs из карликовых свиней 8. В организме человека антигена клеточной поверхности профиля синовиальной жидкости производный ПКЦ аналогична синовиальной-мембранно 2,21 и костного мозга , полученных ПКЦ. Тем не менее, CD34 и CD45 выражения не были обнаружены в ПКЦ, полученных из синовиальной жидкости в височно больных сустава расстройства. Таким образом, микроокружение в суставе может влиять на клеточный фенотип ПКЦ, полученных из синовиальной жидкости. В этом эксперименте клетки были получены из костного маrrow и синовиальной жидкости с использованием карликовых свиней неинвазивные методы. Оба типа культивируемых клеток в пробирке были подтверждены как ПКЦ, и они имели сходные фенотипы клетки и общие совместимые характеристики мезенхимальных. Тем не менее, синовиальной жидкости, полученные MSCs показали больший потенциал для аутогенной терапии стволовых клеток для не только хрящевой и костной регенерации, но и для иммуносупрессии остеоартрита и RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
