Protocol
Dyreforsøk ble godkjent av Animal Senter for Biomedical Eksperimentering ved Gyeongsang National University.
1. Forberedelser for Animal Prosedyre
- Klargjør den voksne kvinnelige minigriser for ikke-invasiv samling av MSC fra benmarg og leddvæske. Utfør klinisk undersøkelse av minigriser en dag før anestesi og prøvetaking.
- Gi klinisk normale dyr for fysiske undersøkelser, som inkluderer kroppstemperatur, pustefrekvens og hjertefrekvens, og for observasjon av grisenes atferd og hematologiske statuser, ved hjelp av fullstendig blodtelling tester.
Merk: Parameter intervaller for klinisk friske minigriser er 11-29 / min for respirasjon, 68-98 / min for hjertefrekvens, og 37-38 ° C i kroppstemperaturen.
- Gi klinisk normale dyr for fysiske undersøkelser, som inkluderer kroppstemperatur, pustefrekvens og hjertefrekvens, og for observasjon av grisenes atferd og hematologiske statuser, ved hjelp av fullstendig blodtelling tester.
- Fjern alle spiselige sengetøy fra buret i løpet av fastetid periode på 6-12 timer PRIOr til administrasjonen av anestesi for unge og voksne minigriser, bør tre timers faste observeres for de nyfødte. Gi drikkevann inntil tidspunktet for anestesi.
2. Utarbeidelse av Dyr for Anesthesia
- Medisinere de minigriser før administrasjon av anestesi med acepromazine (0,1 mg / kg), medetomidin (0,03 mg / kg), og atropin (0,04 mg / kg).
- Injiser alle medisiner intramuskulært (IM) ved anvendelse av en 21 G nål med en lengde på minst 30 mm for voksne minigriser. Utfør IM injeksjon 1-3 cm bak øret inn i sidelivmorhals muskel eller i lårmuskelen.
Merk: Utfør alle prosedyrer uten å utløse frykt eller stress hos dyrene eller krever røff behandling trygt injisere premedisinering.
- Injiser alle medisiner intramuskulært (IM) ved anvendelse av en 21 G nål med en lengde på minst 30 mm for voksne minigriser. Utfør IM injeksjon 1-3 cm bak øret inn i sidelivmorhals muskel eller i lårmuskelen.
- Plasser minigriser i en rygg-tilbakelent stilling.
- Femten minutter etter administrasjon av premedikasjon, initiere anestesi ved hjelp av 1,5% isofluran admintrert ved innånding.
- Fortsett inhalering av isofluran (1,5%) gjennom et endotrakealt rør, etterfulgt av en økning i konsentrasjon til 2,5% med oksygen (1,5 l / min) som bærergassen.
- Kontinuerlig overvåke hjertefrekvens, kroppstemperatur, og perkutan blod oksygenmetning (SpO2) av minigriser under anestesi. Bruke en sirkulerende vannteppe ved en temperatur på 38-39 ° C for å opprettholde kroppstemperaturen. Påfør en øyelege salve for å beskytte øynene tørker ut under anestesi.
- Følg Guedel klassifikasjon å vurdere anestesidybden 13.
3. Forberedelser til Cell Isolering og dyrking
- For å dyrke MSC avledet fra benmarg og synovial væske, fremstille 500 ml avansert Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (ADMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basisk fibroblastvekstfaktor factor (bFGF), og 1,0% penicillin-streptomycin (10.000 IE og 10000 ug / ml, henholdsvis, Pen-Strep).
- Inkuber ADMEM ved 38,5 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 i løpet av en CO 2 inkubator.
- Forbered 500 ml Dulbeccos fosfatbuffer saltvann (DPBS) i henhold til produsentens instruksjoner for celleisolasjon og vask.
4. Samle Bone Marrow fra minigriser
- Velg et område ca 15 x 15 cm i størrelse på hoftekammen (figur 1), og fjerne hår fra dette området ved hjelp av steriliserte barberbladene eller elektriske klippere. Når minigris er plassert, vekselvis skrubbe prosedyren området tre ganger med følgende steriliseringsmidler: povidon jod og 70% etanol. Etter at området er helt tørt, gjelder sterile forheng.
- Pre-coat 10 ml sprøyte med 100 U / ml heparin ved å skylle den med 3 - 4 ml heparin før ejecting anti-koaguleringsmiddel.
Merk: Utfør dette trinnet for å unngå koagulering i sprøyten under benmarg aspirasjon. - Trekke ut et minimum av 5 ml benmarg fra hoftekammen ben av minigris under bedøvelse, ved å bruke en benmargsvifte (3,0 x 100 mm) tett festet til heparin pre-coated 10 ml sprøyte.
5. Isolering av Celler Hentet fra benmargen og In Vitro Dyrking
- Isolere cellene fra den utpakkede benmargen.
- Fortynn ekstrahert benmargen med et like stort volum av DPBS i et 15 ml konisk rør ved romtemperatur.
- Tilsett 3 ml av tetthetssentrifugeringsmateriale (Ficoll-Paque) til 15 ml koniske rør.
- Fortynn en 4 ml sjikt av benmargen med DPBS, som er plassert på den tetthetssentrifuge media uten blanding, og sentrifuger det ved 400 x g i 40 min ved romtemperatur.
- Høste lag av mononukleære celler(MNCer) fra buffy coat mellom de to lagene som inneholder plasma (øverste lag) og tettheten sentrifuge media (bunnlag), og overføre MNCer inn i et 15 ml konisk rør.
- Fortynn de overførte MNCer med 7 - 8 ml DPBS og sentrifuge dem ved 500 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og vaske cellene to ganger med DPBS.
- Suspendere cellepelleten i 2 ml ADMEM og overføre den til en 35 mm vev kultur parabolen. Inkuber kulturskålen ved 38,5 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
- In vitro dyrking av celler isolert fra benmarg.
- Etter 48 timer aspireres mediet med de celler som ikke har festet til formen, og erstatte 2 ml av den ADMEM og inkubere den ved 38,5 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. Endre medium hver tredje dag.
- Ved 70 - 80% konfluens, vaskes cellene med DPBS, dissosiere dem med 1 ml 0,25%trypsin / EDTA, og inkubere dem ved 37 ° C i 3 - 5 minutter inntil cellene løsner.
- Høste celler ved hjelp av 10 ml ADMEM, overføre dem til et 15 ml konisk rør, og sentrifuger dem ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Suspendere høstes cellene i 1 ml frisk ADMEM og telle dem ved hjelp av en hemocytometer.
- Plassere cellene i seg en 5 - 7,5 x 10 5 / 25T kolbe inneholdende 4 ml ADMEM og inkuber dem ved 38,5 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. Endre medium hver tredje dag.
6. Innsamling av leddvæske fra minigriser
- I likhet med prosedyren for benmarg aspirasjon, velges en passende område på ca 15 x 10 cm (lengde / bredde) over femoral leddet, og fjerne hår ved hjelp av steriliserte barberbladene eller elektriske clippers, følg med sanitization prosedyrer (trinn 4.1).
- Sett inn en 3 ml sprøyte med en 23 Gnålen inn i leddet etter landemerker palpation (patella og tibia crest).
- Påfør forsiktig sug til sprøytene for aspirasjon av leddvæsken i leddet. Den omtrentlige volum av synovial væske oppsamlet fra et felles er 0,5 - 1 ml, men dette varierer i henhold til størrelsen av minigris eller skjøten. Gjennomspyle DPBS i leddhulen hvis den oppsamlede volum av leddvæsken er for liten.
- sprøyten umiddelbart trekke seg for å unngå smitte via blod.
7. Cell Isolasjon fra Collected leddvæsken og In Vitro Dyrking
- Isolere cellene fra den aspirerte leddvæsken.
- Fortynn aspirert leddvæsken med et like stort volum av DPBS i et 15 ml konisk rør ved romtemperatur.
- For å fjerne rusk, filtrere utvannet leddvæske ved hjelp av en 40 mikrometer nylon celle sil.
- Tilsett 10 ml DPBS til røret som inneholder den filtrerte synovialvæske og sentrifuger det ved 400 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og vaske cellene to ganger med DPBS.
- Suspendere cellepelleten i 2 ml ADMEM, plassere cellene på en 2 - 3 x 10 5 celler / 35 mm vevskulturskål med 2 ml av ADMEM, og inkuber dem ved 38,5 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 .
- Gjenta trinn 5.2 for in vitro dyrking av isolerte synovial fluid-avledet MSC.
8. Post-prosedyre Care av minigriser
- Hvis det er nødvendig, lukker huden på benmargen avtrekksinjeksjonsstedet med en enkelt sutur ved hjelp av en hud stiftemaskin, etter benmargen samlingen.
- Etter at prosedyren er fullført, ved intramuskulær injeksjon av Enrofloxacin (5 mg / kg) og meloksikam (0,2 mg / kg) til minigriser en gang om dagen i 3 dager.
- Etter at prosedyren er fullført, desinfisere benmargen og leddvæske returpunktmed 0,1% povidon-jod gang om dagen i 3 dager. Nøye observere daglig for å overvåke tegn til komplikasjoner (f.eks hevelse, puss, eller rødhet).
9. Cell fenotyping ved hjelp av flowcytometri
- Når MSC-er 70 - 80% sammenflytende på passasjene 3 - 5, vask cellene med DPBS og behandle dem med 1 ml av 0,25% (volum / volum) trypsin / EDTA. Deretter, inkubere dem ved 37 ° C i 3 - 5 minutter inntil cellene er frittliggende.
- Høste celler ved hjelp av 10 ml DPBS, overføre dem til et 15 ml konisk rør, og sentrifuger dem ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Kast den overliggende oppløsning.
- For å fiksere cellene, suspen cellepelleten i 10 ml av en 3,7% formaldehyd-løsning og holde dem ved 4 ° C i en dag før analysen.
- En dag etter å fikse, vaske cellene med DPBS to ganger ved hjelp av sentrifugering ved 300 × g for 5 min hver gang. Kast den overliggende oppløsning.
- Suspendere cellepelleten i 4 mlav DPBS, som er supplert med 1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA), og inkuber pelleten i 1 time ved 4 ° C for å blokkere ikke-spesifikke Fc-formidlede interaksjoner.
- Fordel 500 ul alikvoter av cellesuspensjonen til 1,5 ml rør.
- For ikke-konjugerte antistoffer (CD29 og vimentin), vask cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 3 min. Kast den overliggende oppløsning.
- Suspendere cellepelleten i 500 ul av en 1: 100 fortynning av det primære antistoff og inkuberes det i 1 time ved 4 ° C.
- Vask cellene to ganger med 1% bovint serumalbumin ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min hver gang. Kast den overliggende oppløsning.
- Suspendere cellepelleten i 500 ul av en 1: 100 fortynning av fluorescein isotiocyanat (FITC) -konjugert sekundære antistoff og inkuberes det i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- For de FITC-konjugerte antistoffer (Isotype, CD34, CD44 og CD45), vaske cellene ved centrifusøkelsen ved 300 x g i 3 min. Kast den overliggende oppløsning.
- Suspendere cellepelleten i 500 ul av 1: 100 FITC-konjugert antistoff og inkuberes det i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- For begge fargingsbetingelser, vaskes cellene to ganger med DPBS ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min hver gang. Kast den overliggende oppløsning.
- Suspendere cellene i 500 pl av DPBS, overføre dem i en 5 ml rundbunnet rør, og analysere resultatene ved hjelp av et strømningscytometer 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av MSC Avledet fra benmargen og leddvæsken av minigriser
MSC ble med suksess isolert fra benmarg og artikulære synovial leddene i minigriser og ekspandert in vitro (figur 2). Sprøyte aspirasjon av leddvæsken er enkel, og det er mulig å oppnå tilstrekkelig adherente celler under in vitro dyrking av primære celler. Morfologien av synovial-væske-avledede MSC er lik den til benmarg-avledede MSC, og begge MSC har en fibroblastisk spindel form, og er homogent tilhenger. De ble observert å ha et positivt uttrykk for alkalisk fosfatase (AP) farging, etter den tredje subkulturen var fullstendig.
Evaluering av cellefenotyp av MSC Avledet fra benmargen og leddvæskeav minigriser
Analyser av celleoverflatemarkører ble utført for å skape en fenotype av benmarg og synovial-væske-avledede MSC i minigriser. Begge typer MSC uttrykte signifikante mengder av positive celleoverflatemarkører, for eksempel CD29, CD44, og vimentin (≥96 - 99% av de positive celler), mens uttrykket av CD34 og CD45 var negative og lav (≤2% av positive celler) (figur 3). Disse resultatene var identiske med de som er oppnådd fra karakteristiske MSCer, inkludert celler isolert fra leddvæske, og det var ingen signifikante forskjeller i celleoverflatemarkører mellom disse MSC. Cellene isolert fra benmargen og leddvæsken har blitt bekreftet som MSC i vår tidligere studie åtte. Både bein marrow- og leddvæske-avledet MSC uttrykt stamcelletranskripsjonsfaktorer (Oct3 / 4, Nanog, og Sox2); dessuten en in vitro differensiering evne hsom var klare, ikke bare inn i den mesenchymale avstamning (osteocytter, adipocytter, kondrocytter og), men også neurale celler ved cytokjemiske farging og påvisning av celle-spesifikk genekspresjon 8.
Figur 1. Plassering av hoftekammen av minigris. Den røde pilen representerer området på hoftekammen brukes til benmargen samlingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. MSCer avledet fra benmargen og synovialvæske fra minigriser. (A) Den homogene morfologi av primære kulturer av MSC avslørte en fibroblastisk form. (B) Farging med blanding av5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat og nitro blå tetrazolium (BCIP / NBT) viste AP aktivitet i MSC ved passering 3. Skala: 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av celleoverflatemarkører for MSCer avledet fra benmargen og synovialvæske fra minigriser ved passasje 3. De celleoverflatemarkører for MSC ble identifisert ved hjelp av en strømnings-cytometri analyse, og MSC ble identifisert til å være positiv for CD29, CD44 og vimentin og negativ for CD34 og CD45. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigriser ble anvendt for å etablere MSC isolert fra benmarg og synovial væske. For å eliminere forskjellige fysiologiske forhold, for eksempel alder, kjønn og sykdom, ble minigriser fra isogene bakgrunns givere valgt å vurdere nøyaktig cellen kilde avhengig karakteristikk. Griser er kjent for å være anatomisk, fysiologisk, og genetisk like mennesker, og i særdeleshet, minigriser kan produsere størrelse-matchet organer; Derfor kan de brukes som en erstatning giver arter for xenotransplantasjon 14,15. Når det nylig foreslått immunmodulerende egenskap av MSC, indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) og nitrogenoksid syntase (NOS) ble brukt med MSC å megle immunsuppresjon, som er artsspesifikke, selv om MSC fra griser og mennesker har samme IDO 9 . Dermed kan en gris modell som MSC donor gi viktig innsikt i immunresponser av MSC for menneskelig behandling. Videre forskning av den porcine stammen-celler spiller en viktig rolle i den biologiske forståelsen av in vitro-prosesser og deres forskjellige prekliniske anvendelser i mennesker 16,17. Benmarg og leddvæske kan være ikke-invasiv høstet fra minigriser. Hele prosedyren, fra anestesi til prøvetaking, redusert stress nivået av systemiske eller lokale organer; derfor kan minigriser benyttes som mottakere for autolog transplantasjon. I dette eksperimentet, ble MSCer isolert fra benmarg og synovialvæske fra minigriser, basert på bekreftelsen av synovial-væske-avledede MSCer med immunsuppresjonsteknikker kapasiteter avledet fra en RA musemodell i en tidligere studie 8
Innsamling av Bone Marrow fra minigriser
I griser, voksen stamceller hentet fra benmargen er multipotent og har indusert neovascularization og kardiomyocytt regenerering. Alderen på en donor er assosiert med øket fettinnhold ogredusert spredning og differensiering av benmarg; Derfor er benmargen ikke den beste kilden til MSC i alderen dyr. Den hoftekam i minigriser er den foretrukne stedet for benmargs-avledet MSC isolasjon fordi det er bred og er en lav-risiko prosedyre stedet for isjiasnerven skade. I tilfelle av alderen eller overvektige minigriser, kan fettanriket tykke musklene være til stede på hoftekammen. Under slike omstendigheter, er en knivstikking snitt på huden nødvendig og benmarg biopsi nål settes inn på riktig måte, noe som kan være vanskelig å anvende på hoftekammen. Unnlatelse av å finne den riktige biopsi nettstedet kan føre til mislykkede benmarg ambisjoner fordi nålen blir blokkert av bein eller ikke kan være i stand til å nå benmargen inne i hoftekammen. Derfor må biopsinål kontrolleres på riktig måte, og kunnskap om tykkelsen av bløtvev og cortex av benet av hoftekammen er nødvendig før begynnelsen prøvesamlinger.
Aspirasjon av leddvæske fra leddene minigriser
Synovial væske eksisterer i hulrommet av synovial leddene, og volumet av synovial fluid er vanligvis økt i betente ledd. Synovial-væske-avledede MSCer er tatt fra foretrukne kandidatwebområder for brusk regenerering, både in vivo og in vitro. I tillegg har de vist seg å lokke fram immunmodulerende egenskaper i RA 8. Leddvæsken er ikke bare en lett tilgjengelig kilde, men har også verdifulle mesenchymale egenskaper. Begrensningene ved bruk av leddvæske som en kilde for MSC er de forskjellige volumene som finnes i leddene basert på varierende størrelser og patologiske tilstander av leddene og vanskeligheten ved bruk av en 3 ml sprøyte for synovialvæske aspirasjon fra leddene. Derfor bør størrelsen av sprøyten være 5 - 10 ml med høyt trykk. I tillegg spyling av leddvæsken med 1 - 2 ml DPBS fra en sprøyteer å foretrekke. Ved å bruke denne metoden, kan oppnås et stort antall celler, selv fra små mellomrom i leddene.
Karakteristikk av de Bone-marrow- og synovial-væske-avledet MSC av minigriser
Hos mennesker, de morfologi av synovial-fluidum- og synovial membran-avledet MSC fra Artrose pasienter er like, men smalere enn morfologi av benmarg-deriverte MSC 12. Men i in vitro kulturer, ble morfologier for begge ledd-væske-avledet MSC og benmarg-avledede MSC observert å være lik i dette eksperimentet. I forskernes tidligere studie, spredning evne synovial-væske-avledet MSC var høy, sammenlignet med benmarg-deriverte MSC 8.
MSC er etablert fra ulike vev kilder hos voksne givere; derfor, ikke-invasiv innhentet vev-source-avledet MSC er verdifulle for autolog stamcelle therapy. Cellen kilden er avhengig av karakterisering og kapasiteter av sykdommen eller formålet med stamcelleterapi. I griser, voksen stamceller hentet fra benmargen er multipotent og har indusert neovascularization og kardiomyocytt regenerering 18,19. MSC har i hovedsak vært isolert fra benmarg, men også fra periosteum, skjelettmuskulatur, synovialhinne, navlestrenger, og dental vev, selv om få celler fra disse vev er ikke lett, og kan kreve ytterligere kirurgiske prosedyrer for pasientene. Imidlertid øker volumet av leddvæsken vanligvis i leddene av osteoartritt eller RA-pasienter, og biopsier av disse økte synovial væske blir brukt for å diagnostisere og behandle pasienter. Antallet MSCer øker også i leddvæsken hos pasienter med degenerert brusk og slitasjegikt 20.
I denne studien ble celle fenotyper av bein-marrow- og synovial-væske-avledet MSC evaluert, end både MSC presenteres tilsvarende nivåer av uttrykk for celleoverflatemarkører. Derfor celler isolert fra leddvæske og bekreftet som MSC har lignende fenotyper til benmarg-deriverte MSC i minigriser. Forskernes tidligere forskning vurdert andre celleoverflatemarkører, slik som CD90 og de store histocompatible og komplekse klasse II (MHC II), og bekreftet en kapasitet for multi-avstamning differensiering inn i osteocytter, adipocytter, chondrocytes og nerveceller i ledd-væske avledede MSC fra minigriser 8. Hos mennesker er den celleoverflateantigen profil av synovial-væske-avledet MSC lik den for synovial-membran 2,21 og benmarg-avledede MSC. Men CD34 og CD45 uttrykk ble ikke oppdaget i MSC avledet fra leddvæsken i kjeveledd lidelse pasienter. Således kan mikromiljøet i skjøten påvirke cellens fenotype av MSC avledet fra synovial væske. I dette eksperimentet, ble cellene oppnådd fra benet marrow og leddvæsken av minigriser med ikke-invasive metoder. Begge typer in vitro dyrkede celler ble bekreftet som MSC, og de hadde lignende celle fenotyper og delte kompatible mesenchymale egenskaper. Men synovial-væske-avledet MSC viste et større potensial for autolog stamcelleterapi for ikke bare brusk og bein regenerasjon, men også for immunsuppresjon av slitasjegikt og RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
