Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Zusammenfassung

Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.

Einleitung

Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA - Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper ¹ zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde ² verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt.

Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin - Rest in der CpG Dinukleotide DNA ^3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie ^2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Technik....

Protokoll

Alle Gewebe erhalten nach der Zustimmung des Institutional Review Board Ausschuss und, wenn alle Teilnehmer zugestimmt sowohl der molekularen Analysen und Follow-up-Studien. Die Protokolle werden von der Human Studies Committee an der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt.

1. Methyl-bindende DNA-Capture (MBDCap)

1. Probenentnahme und DNA - Isolierung
   1. Sammeln Sie Bulk-Tumor oder normalen Gewebeproben von Patienten Paraffingewebeproben eingebettet.
   2. Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Mini-Kit an genomische DNA aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben isolieren de....

Ergebnisse

Wir haben MBDCap-seq verwendet , um DNA - Methylierungs Veränderungen in einer großen Anzahl von Patienten , die an verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust- ^12, endometrial ^13, der Prostata ¹⁴ und Leberkrebs unter anderem studieren. Hier zeigen wir einige Informationen aus der Studie Brustkrebs vor kurzem ¹² veröffentlicht. In diesem Fall haben wir das gesamte Genom-Sequenzierung Ansatz zu CpG-Inseln zu identifizieren, die in den normalen bezüglich der Tumor in verschiedenen genomischen Regi.......

Diskussion

Die MBDCap-seq - Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz ³ als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten ¹⁵ zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist es .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Methylminer DNA-Anreicherungskit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Ultraschallgerät	Diagenode	B01020001
3 M Natriumacetat, pH 5,2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Vollautomatisches Bibliotheksbausystem
Adapter Primer	Bioo Scientific	514104	PCR Primer
Mix Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometrisches Quantifizierungssystem
PCR Master Mix	KAPA scientific	KK2621	PCR Master Mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Aufreinigungsperlen
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequenziersystem	Illumina