Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.
Abstract
מתילציה היא אחד השינויים אפיגנטיים החיוניים ל- DNA, האחראית על ויסות המדויק של הגנים דרושים התפתחות והתמיינות יציבות של סוגי רקמות שונים. חוסר ויסות של תהליך זה הוא לעתים קרובות סימן ההיכר של מחלות שונות כמו סרטן. כאן, אנו מתארים אחת טכניקות הרצף האחרונות, מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), המשמש לכמת מתילציה שונה רקמות בריאות ומחלות עבור קבוצות גדולות של מטופלים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של גישת העשרת זיקה זו יחד עם צינור ביואינפורמטיקה להשיג כימות אופטימלי. טכניקה זו נעשה שימוש כדי רצף מאות חולים ברחבי סוגי סרטן שונים כמו חלק מפרויקט methylome 1,000 (מערכת Methylome סרטן).
Introduction
תקנה אפיגנטיים של גנים באמצעות מתילציה DNA היא אחד המנגנונים החיוניים הדרושים כדי לקבוע את גורל התא על ידי בידול יציב של סוגי רקמות שונים בגוף 1. חוסר ויסות של תהליך זה כבר ידוע לגרום למחלות שונות, כולל סרטן 2.
תהליך זה בעיקר יהיה כרוך בתוספת של קבוצות מתיל על שאריות ציטוזין ב CPG dinucleotides של DNA 3. ישנן כמה טכניקות שונות המשמשים כיום כדי לחקור את המנגנון הזה, שלכל אחד מהם יתרונות משלהם כפי שמתואר מחקרים רבים 2-8. כאן נדונו באחת הטכניקות הללו בשם מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), שבו אנו משתמשים בטכניקת העשרת זיקה לזהות אזורים מפוגלים של ה- DNA. טכניקה זו בונה על היכולת מחייב מתיל של החלבון MBD2 להעשיר עבור קטעי דנ"א גנומי המכיל אתרים CPG מפוגל. אנו מנצלים ערכת העשרה DNA מסחרית מפוגלתעבור הבידוד של אזורים המפוגלים אלה. המעבדה שלנו הוקרנה מאות דגימות חולות באמצעות טכניקה זו וכאן אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה מקיף, אשר ניתן להשתמש בם כדי לחקור קבוצות גדולות של מטופלים.
כפי שעולה עם כל טכנולוגית רצף של הדור הבא, MBDCap-seq גם דורש גישה ביואינפורמטיקה ספציפית על מנת לכמת את הרמות של מתילציה במדויק על פני הדגימות. נעשו מחקרים רבים שנערכו לאחרונה במאמץ כדי לייעל את תהליך הנורמליזציה וניתוח של נתוני רצף 9, 10. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים באחת השיטות הבאות יישום גישת התאוששות קריאה ייחודית - LONUT - ואחריו נורמליזציה ליניארי של כל דגימה על מנת לאפשר השוואות משוחדות על פני מספר רב של דגימות חולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמות מתקבלות לאחר אישור ועדת דירקטוריון הסקירה המוסדית וכאשר כל המשתתפים הסכימו הם בניתוחים מולקולריים ומחקרים ומעקב. הפרוטוקולים מאושרים על ידי ועדת לימודי האדם באוניברסיטת למדעי הבריאות מרכז טקסס בסן אנטוניו.
1. לכידת DNA מתיל-מחייב (MBDCap)
- איסוף דגימת DNA ובידוד
- אסוף גידול בתפזורת או דגימות רקמה נורמליות מן דגימות רקמה מוטבעת פרפין חולה.
- השתמש ערכת מיני DNA מסחרית לבודד הדנ"א הגנומי מן דגימות הרקמה מוטבעת פרפין על פי הפרוטוקול של היצרן.
- השתמש ערכת העשרה DNA מפוגלת עם ההליך המתואר כאן על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לשטוף חרוז ראשוני
הערה: חרוזים משמשים זוג עם חלבון MBD-ביוטין, אשר מזהה מתילציה DNA על הגנום. חרוזים בדרך כלל מושעיםבתמיסת מניות. השתמש בשלבים הבאים כדי לשטוף את הנוזל.- Resuspend את המניה של חרוזים streptavidin (ראה לוח חומרים) על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לקבל השעיה הומוגנית. אין לערבב את החרוזים על ידי vortexing.
- ראשית מיקרוגרם של ה- DNA קלט, add10 μL של חרוזים לצינור עם 90 μL של 1x לאגד / הצפת לשטוף. סובב דקות 1. אל תערבב ידי vortexing.
- מניחים את הצינור (ים) על מדף מגנטי עבור 1 דקות.
- הסר את הנוזל עם טפטפת וזורקים את הנוזל.
- הוסף 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים ולסובב דקות 1.
- חזור על שלבי 1.2.3 - 1.2.5 פעמים.
- צימוד חלבון MBD-ביוטין חרוזים
- עבור 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, להוסיף 7 μL (3.5 מיקרוגרם) של חלבון MBD-ביוטין על צינור אחד.
- להוסיף 93 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף לחלבון לעשות נפח סופי של 100 μL.
- מערבבים את חלבון חרוזיםתערובת על מערבל סיבוב ב RT במשך שעה 1.
- הקטועה DNA (קלט)
- DNA Sonicate על ידי הוספת 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי הכולל 96 μL של חיץ TE ו -24 μL של 5x לאגד / לשטוף חיץ לבצע פתרון 120 μL. לשימוש כוח של 30 ו OFF כוח 30 s במהלך sonication, 20 - 25 פעמים.
- הפעל 1 μL של פתרון ה- DNA sonicated באמצעות מערכת bioanalyzer עם ערכת DNA מסחרי רגישות גבוהה כדי לבדוק את גודל שברי להיות בטווח של 150 - 350 נ"ב על פי פרוטוקול של היצרן.
- שטוף את-חרוזי MBD
- מניחים את הצינור המכיל MBD-חרוזים על מתלה מגנטי 1 דקות.
- הסר וזורקים את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים.
- Resuspend את החרוזים עם 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף.
- מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב ב RT במשך 5 דקות.
- חזור על שלבי 1.5.1 - 1.5.4 פעמים.
- תגובה ללכוד DNA מקוטע (DNA קלט 1 מיקרוגרם)
- מעבירים את התערובת דנ"א / הצפת הצינור המכיל את החרוזים MBD.
- מערבבים את-חרוזים MBD עם ה- DNA על מערבל סיבוב של 1 ש 'ב RT. לחלופין, לערבב O / N ב 4 מעלות צלסיוס
- הסרת DNA הלא שנתפסו מן החרוזים
- לאחר ערבוב דנ"א MBD-חרוזים, במקום צינור על המדף המגנטי דקות 1. לרכז את כל החרוזים על הקיר הפנימי של הצינור.
- הסר את הנוזל supernatant עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge DNase ללא נקי כמו DNA nonmethylated. אחסן מדגם זה על הקרח.
- הוספת 200 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים כדי לשטוף את החרוזים.
- מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות.
- מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות.
- הסר את הנוזל עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge.
- שווהture התגובות של ≤1 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, חזור על שלבים 1.7.3 - 1.7.6 עבור 2 שברים לשטוף יותר בסך הכל.
- Elution חלק יחיד
- מערבבים חיץ דלת מלח עם חיץ גבוה מלח (1: 1) כדי לקבל חיץ elution (1,000 מ"מ NaCl).
- Resuspend את החרוזים 200 μL של חיץ elution (1,000 מ"מ NaCl).
- דגירה חרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות.
- מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות.
- עם הצינור במקום על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים עם קצה פיפטה, ולשמור אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge DNase ללא נקי. אחסן מדגם זה על הקרח.
- חזור על שלבים 1.8.1 - 1.8.4 פעם, איסוף הדגימה השנייה באותו צינור (הנפח הכולל יהיה 400 μL). חנות המדגם ונקווה על הקרח.
- ממטרי אתנול (ניקוי DNA)
- לכל noncaptured, לשטוף, ו elution חלק from על השלבים הקודמים, להוסיף 1 גליקוגן μL (20 מיקרוגרם / μL, כלולים בערכה), 1/10 מדגם נפח של נתרן אצטט 3M, pH 5.2 (למשל, 40 μL לכל 400 μL של המדגם) ו -2 כרכים מדגם של 100% אתנול (למשל, 800 μL לכל 400 μL של המדגם). ההיקף הכולל הוא 1,241 μL.
- מערבבים היטב דגירה ב -80 מעלות צלסיוס לפחות h 2.
- צנטריפוגה הצינור במשך 15 דקות ב 11,363 XG ב 4 מעלות צלסיוס
- בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה.
- הוספת 500 μL של אתנול 70% קר.
- צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 11,363 XG ב 4 מעלות צלסיוס
- בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה.
- חזור על שלבי 1.9.6 - 1.9.7 פעם וסרה supernatant שיורית הנותרים.
- אוויר יבש גלולה עבור ~ 5 דקות. אין לייבש את הגלולה לחלוטין.
- Resuspend גלולה DNA ב 37.5 μL של מים ללא DNase או אחריםהיקף המאגר מתאים.
- מניחים את ה- DNA על הקרח או לאחסן את ה- DNA ב -20 מעלות צלסיוס או מתחת עד לשימוש נוסף.
- בדוק כי הסכום הכולל של ה- DNA הוא מעל 20 ng, (למשל, להשתמש במערכת quantitation fluorometric, ראה לוח חומרים).
רצף 2.
- השתמש שברי הדנ"א שנמצא הליך MBDCap על רצף. עבור כל דגימה כדי להיות רצף, בסכום כולל של 20 - 40 DNA ng נדרש הכנת ספרייה.
- להכנת ספרייה-seq DNA להשתמש במערכת בניית ספרייה אוטומטית לחלוטין (ראה לוח חומרים) ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי המסופק על ידי היצרן. קטעי דנ"א בחר בגודל 200 - נ"ב 400 להכנת הספרייה. המערכת כן ספריית האוטומציה מאפשרת סטנדרטיזציה של הליך הכנת הספרייה ומזעור הווריאציה על פני הדגימות בשל הכנה ידנית.
- ממשלת מתאם השתמשrs ו לדלל את ריכוז 100x. מתוך זה, השתמש 10 μL עבור כל דגימה.
- בעקבות צעד 2.2, להוציא את התגובה, ולכמת את הספרייה seq-דנ"א באמצעות מערכת quantitation fluorometric (ראה לוח חומרים).
- הגדרת הליך הגברת PCR. הבחירה של שילוב הורים PCR היא לשפר את יעילות ה- PCR של אזור מועשר GC של הגנום. בתוך צינור PCR, להוסיף 15 μL הספרייה DNA-seq, 25 תמהיל מאסטר μL PCR (ראה לוח חומרים), 2 תערובת פריימר μL PCR (ראה לוח חומרים), ו -8 μL H 2 O.
- בהתאם להמלצת PCR מיצרן של מיקס מאסטר PCR, שינוי פעמי אופניים וטמפרטורות עבור חומרי מוצא אינם אחידים: 98 o C למשך 45 שניות, מחזורי X של 98 o צלזיוס למשך 15 שניות, 65 o C למשך 30 שניות, 72 o צלזיוס למשך 30 s ולאחר מכן 72 מעלות צלסיוס 1 דקות. חזק ב 4 מעלות צלסיוס
- PerfORM מספיק מחזורים כדי בסופו של דבר עם 2 - 10 ננומטר של ה- DNA ספריה (8 - 10 מחזורים).
- לנקות תגובת PCR עם 1: 1 יחס של חרוזי טיהור PCR על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה לוח חומרים).
- Elute עם 20 - חיץ elution 30 μL.
- ברקוד מדגם וברכת 4 דגימות יחד לנתיב אחד של תא זרימה. השתמש בפרוטוקול הקריא ליחיד 50 נ"ב עבור סידור (ראה לוח חומרים).
3. ביואינפורמטיקה ניתוח
הערה: תהליך נוסף קבצי fastq הגלם המתקבלים רצף לבצע בקרת איכות ומיפוי רצפי דנ"א הקצר (כניסות) לגנום.
- השתמש Bowtie קצר לקריאה aligner, כלי מיפוי הגנום על כל קובץ מדגם fastq למפות את מקריא הגנום התייחסות. כלי מיפוי קריאה רבים זמינים לבצע שלב זה וניתן להשתמש בו על בסיס העדפה אישית.
- אפשר עד 2 חוסר התאמה של וולדואר קורא תוך מיפוי הגנום ההתייחסות. דווח עד 20 המערכים טובים ביותר עבור כל אחד מהם קראו. לדוגמה, השתמש עניבת פרפר -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- השתמש LONUT 9 לשחזר את להכפיל ממופה קורא לשיפור זיהוי של האזורים המועשרים. עבור כל קריאה, לכל היותר יישור אחד יהיה התאושש כאשר היא קרובה מספיק לכל הפסגות בשם לעיל. לדוגמה, השתמש: perl lonut.pl -G hg19 -w 250 -p 99 <alignFile> <outputPath>. LONUT יבצע את הפעולות הבאות.
- מערכי פיצול ממופים באופן ייחודי קוראים להכפיל ממופה קורא. שיא על Call ממופה באופן ייחודי קורא באמצעות מתקשר שיא חגורת 11. האפשרות -w 250 -p 99 בפקודה למשל הם עבור חגורה.
- לשלב באופן ייחודי ממופה קורא עם התאושש קורא המתקבל LONUT, ואת בשילוב קורא, בפורמט BED, ישמש לניתוח נוסף. לחשב את מספר COMBINאד קורא לנורמליזציה בעתיד.
- סל קורא. חלץ קורא האזור של עניין באמצעות סקריפט perl: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <הזרם הארכת אורך> -dn <במורד אורך הארכת>. עבור כל קובץ מיטה המפורט sampleInfoFile, תסריט פרל מבצע את המשימות שלהלן.
הערה: ראה קובץ קידוד משלים סקריפט Perl.- סל קורא לתוך גודל סל קבוע, למשל, 100 נ"ב, עבור 24 כרומוזומים.
- עבור כל גן המפורט refGeneFile, לחלץ את הפחים סביב אתר תחילת שעתוק (TSS), עד אורך ההרחבה המתאים אפשרות -up ו -dn. לדוגמה, לחלץ את הנתונים באזור זה מלמעלה ועד למטה 4 kb של TSS. ב- BP סל גודל 100, זה חילוץ יש נתונים 81 פחים, ואת סל המרכז תואם את TSS.
- עבור הגן על גדיל antisense, להעיף באזור חילוץ משמאל לימין כך פחי הזרם הם תמיד PLACED בצד שמאל עם סקריפט Perl.
- בהמשך לפצל באזור TSS ± 4 kb לשלושה אזורים תת: שמאל, נגד הזרם 4 kb כדי במעלה הזרם 2 kb; התיכון, מעלה kb 2 במורד הזרם; נכון, זרם 2 kb עד 4 קילו.
- עבור כל דגימה, לחלק את הספירה של קורא כל סל במספר הכולל של משולב ממופה קורא מחושב ב 3.3.3. הנורמליזציה תבטל את ספציפיים המדגם לקרוא הבדלים ומאפשרת להשוות את הקורא ברחבי מדגמים שונים.
- להריץ את הסקריפט bash (כמצוין קובץ סקריפט) לבצע בדיקה סטטיסטית על מנורמל קורא המתקבל באזור שמאלה, כדי לזהות מתילציה הפרש בין קבוצה הנורמלית במקרה באזורים המתוארים באזור האגף.
הערה: עיין קובץ הקידוד משלים את תסריט bash. בהתבסס על אזורים כי הם מפוגל דיפרנציאלי, ישנם שבעה שילובים:
האזור כולו: מתילציה ההפרש ברחבי האזור kb ± 4 TSS
MiddleLeft: מתילציה ההפרש בשני באזור האמצעי ויצא
MiddleRight: מתילציה ההפרש בשני באזור באמצע וימינה
מתילציה הפרש בשני באזור על ימין ועל שמאל: צלע
מתילציה הפרש באזור נותר רק: שמאל
מתילציה הפרש באזור נכון יחיד: תקין
מתילציה הפרש באזור אמצעי יחיד: תיכון - השתמש באותו סקריפט bash כדי להמחיש את מתילציה דיפרנציאליים עלילת טורנדו. עלילת הגנים המפוגלים Hyper היפו בפנל נפרד, ולמיין לפי סדר שילוב באזור כמתואר 3.4, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו MBDCap-seq ללמוד שינויים מתילציה DNA במספר רב של חולים בסוגי סרטן שונים, כולל השד 12, רירית הרחם 13, הערמונית 14, וסרטן הכבד בין היתר. כאן אנו מדגימים כמה פרטים ממחקר סרטן השד פרסם 12 לאחרונה. במקרה זה, השתמשנו גישת רצף הגנום כולו לזהות איי CPG כי הם מפוגלים דיפרנציאלי גידול ביחס נורמלי על פני אזורים גנומית שונים. החקירה העלתה כי מתוך הסך נחקרת איי CPG ממוקמים יזמי גן (n = 13,081), 19.5% הראו מתילציה הפרש בגידולים לעומת רגיל. בדומה לכך, מתוך 6,959 איים intragenic CPG, 55.2% הראו מתילציה ההפרש. יזמי גניים הראו 28.1% של 4847 ועבור יזמים גן בלי איי CPG, 1.8% של 5454 אזורים נחקרים הראו מתילציה DNA הפרש (איור 1 א). ייצוג חזותי(איור 1 ב) מציג דוגמאות מייצגות של האזורים עמדו לעיל. מפת החום בבירור מתאר את האזורים המפוגלים פני 77 גידולים בשד, 10 רקמות שד רגילות, שורות תאי סרטן שד 38. כימות של מתילציה כפי שפורט בפרוטוקול ביואינפורמטיקה המפורטים בכתב היד הזה, מאפשרת לנו לבצע מבחנים סטטיסטיים שונים ברחבי דגימות החולות אלה לזהות הבדלים מתילציה משמעותיים באוכלוסיית כולה או תת-אוכלוסייה. גישת ניתוח זה מספקת לנו מטרות לבדיקה כדי לחקור את המנגנונים אפיגנטיים נוסף בדגימות מטופל אלה. לאחר מטרות אלה מזוהים, הרמות של מתילציה ניתן לכמת עוד ומאומתים באמצעות pyrosequencing. The-seq MBDCap מספק רזולוציה הגנומי של כ 100 - 200 נ"ב להשגת היעדים שנקבעו. כדי לקבל החלטה נוספת, במקומות CPG בודדים בתוך אזורים אלה ניתן לבחור עבור pyrosequencing כימות. אנו משתמשים בגישה זו כדי קוואןתצדיק ולאמת את הבדלי מתילציה שנצפו בנתוני MBDCap-seq ברזולוציה גדולה יותר להשוואה בין קבוצות חולות הבודדות. איור 2 מראה את כימות של מתילציה ב 2 סרטן רירית רחם קבוצות משנה חד פעמי (NR) לעומת חוזרים (R). הנתון מתאר את רמת המתילציה של הדנ"א לכל מטופל ב 2 הקבוצות באתרי CPG שונים באי CPG האמרגן של SFRP1 גן המטרה המזוהה.
איור 1:. היפר-מתילציה DNA בדגימות סרטן השד ביחס רקמה בריאה באיים CPG האמרגן והלא האמרגן רצף ללכוד מתיל (MBD-seq) שימש ליצור פרופילים מתילציה DNA של הגנום של גידולים בשד (n = 77) ו רקמה בריאה (n = 10). (א) Piתרשימי דואר להפגין מתילציה הפרש ב אמרגן, intragenic, ו CGIs גניים וכן אזורי אמרגן הלא CGI. (ב) דוגמא לוקוסים מראה CGI אמרגן, intragenic, גניים, ואזורי אמרגן הלא CGI. ריבועים מקווקווים לסמן אזורים המתאימים היפר-מתילציה סרטן השד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: כימות של מתילציה DNA באמצעות pyrosequencing אתרי CPG בתוך גן יעד מזוהה מתילציה DNA של אזור אמרגן SFRP 5 חוזרים חד-פעמיים חולים קרצינומה של רירית רחם זוהה על ידי pyrosequencing.. אתר מייצג אתר CPG אחד (R: חוזר ונשנה, n = 21 ו NR: חד-פעמי, n = 71). המגרשים להראותהסורגים הממוצעים והטעייה להראות סטיית התקן של הממוצע או SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת MBDCap-seq היא גישת העשרת זיקת 3, נחשבת כאלטרנטיבה חסכונית כאשר חוקרים מחזורים עם מספר רב של חולים 15. הצינור המובא כאן מתאר גישה מקיפה מן רכש מדגם ניתוח נתונים ופרשנות. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא הגדרת הליך הגברת PCR כדי לשפר את יעילות PCR של האזורים המועשרים GC בגנום כמו זה שבו מתילציה DNA מתרחשת. כמו כן, הוא חיוני כדי להבטיח כי לאחר רצף, כל דגימה יש לפחות יותר מ -20 מיליון ממופה באופן ייחודי מקריא הגנום. כיסוי זה צפוי לספק עומק העשרה או רצף מספיק כדי למפות את הגנום כולו 12. אם כיסוי זה אינו מתקיים במהלך הסיבוב הראשון של רצף למדגם מסוים ועוד DNA למדגם כי מחלק אחד זמין, לסיבוב נוסף של רצף בין השאר שני ניתן להפעיל. כתוצאה כך קוראת ניתן למזג עם rEADS מן הסיבוב הראשון כדי להשיג את הכיסוי. הניסויים הכולל צריכים להיות מתוכננים לכלול כמה פקדים ביולוגיים (למשל, רקמות בריאות) לתת דין וחשבון על הטיה בהתבסס על גורמים כמו וריאציות עותק-מספר 15.
הגישה ביואינפורמטיקה שלנו לחקור את המתילציה של הדנ"א שנצפתה הדגימות החולות מספקת גני מטרה אפשריים המראים עשר מתילציה הפרש ב אמרגן ליבה, אזורי חוף אמרגן שילוב שונה גם של אלה. למרות העובדה כי MBDCap-seq יכול לכל היותר להגיע ברזולוציה למטה רק עד 100 נ"ב, ההבחנה של אזורים אלה לתוך ליבת החוף כמתוארת בפרוטוקול מאפשרת לנו לזהות אזורי יעד פוטנציאליים לחקירה נוספת של התפקידים רגולטוריים של דיפרנציאלי enrichments מתילציה מחקרים מכניסטית בעתיד. כאן אנו מתארים גם דרך לחזות אזורים אלה שזוהו באמצעות טורנדו מגרש, אשר מספקת סקירה של העשרת ההפרשדפוסים.
קיימות טכניקות נוספות, המתבססות על המרה כימית של ציטוזין unmethylated כדי אורציל ידי נתרן bisulfide דרך דיאמינציה, ולספק כיסוי מקיף יותר של מתילציה DNA ברזולוציה נוקלאוטיד בודד. בדרך כלל לאחר ההמרה bisulfide, ה- DNA הוא רצף באמצעות pyrosequencing לניסויים מבוססי היעד או על ידי רובה הגנום כולו bisulfide רצף (BS-seq). טכניקות אלה מספקות תמונה ההגבלה של הטכניקה המתוארת כאן כמו-seq MBDCap יכול להשיג רק לכל היותר רזולוציה של עד 100 נ"ב. עם זאת, למרות הגישות הללו להיות מקיפות יותר, הם יקרים יחסית והוא יכול אקספוננציאלית להגדיל את העלות כמו עומק הרצף או מספר החולים גדלה. מצד השני, פלטפורמות microarray bisulfide נפוצות הם חסכוניות, אבל לספק כיסוי נמוך יחסית עם בדיקות חוקרות אזורים קרובים יזמי גן ולא הגנום כולו. MBDCap-seq עם זאת, מספקאיזון בין טכניקות רצף עלות גבוהה אלה ומערכים מתילציה בעלות נמוכה 16. אנחנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לחקור את מתילציה DNA במספר רב של קבוצות מטופל, כמו חלק מפרויקט סרטן Methylome מערכת 10 והוא יכולים לשמש במחקרים עתידיים המעורבים מחזורי מטופל גדולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
פרוטוקול זה פותח במעבדות של ד"ר טים הואנג וד"ר ויקטור ג'ין באוניברסיטת למדעי הבריאות מרכז טקסס בסן אנטוניו.
Acknowledgments
העבודה נתמכת על ידי CPRIT ומחקר הדרכה פרס RP140105, כמו גם נתמך בחלקו על ידי ארה"ב National Institutes of Health (NIH) מעניק R01 GM114142 ועל ידי ויליאם & Ella אוונס רפואי Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H.
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
