Summary
Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.
Abstract
A metilação é uma das modificações epigenética essenciais para o DNA, o qual é responsável pela regulação precisa dos genes necessários para o desenvolvimento e diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos. A desregulação deste processo é frequentemente a característica de diversas doenças como o cancro. Aqui, nós descrevemos uma das técnicas de sequenciação recentes, Metil-Binding sequenciação de ADN de captura (MBDCap-SEQ), usada para quantificar a metilação em vários tecidos normais e de doença para grandes grupos de pacientes. Descreve-se um protocolo detalhado desta abordagem de enriquecimento por afinidade ao longo de uma conduta bioinformática para alcançar quantificação ideal. Esta técnica tem sido utilizada para sequenciar centenas de pacientes em vários tipos de câncer, como parte do projeto methylome 1.000 (Sistema Methylome Câncer).
Introduction
Regulação epigenética de genes por meio de metilação do ADN é um dos mecanismos essenciais necessários para determinar o destino da célula por diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos do corpo 1. A desregulação deste processo tem sido conhecido por causar diversas doenças, incluindo o cancro 2.
Este processo envolve, principalmente, a adição de grupos metilo no resíduo de citosina nos dinucleótidos CpG de ADN 3. Existem algumas técnicas diferentes, actualmente utilizados para investigar este mecanismo, tendo cada um as suas próprias vantagens, conforme descrito em muitos estudos 2-8. Aqui vamos discutir uma destas técnicas chamados metil-Binding Captura de sequenciamento de DNA (MBDCap-seq), onde usamos uma técnica de enriquecimento de afinidade para identificar regiões metiladas do DNA. Esta técnica baseia-se na capacidade de ligação de metilo da proteína MBD2 para enriquecer os fragmentos de DNA genómico contendo locais CpG metilados. Nós utilizamos um kit de enriquecimento de DNA metilado comercialpara o isolamento destas regiões metiladas. O nosso laboratório fez a triagem centenas de amostras de pacientes, utilizando esta técnica e aqui nós fornecemos um protocolo optimizado abrangente, que pode ser usado para investigar grandes grupos de pacientes.
Como é evidente, com qualquer tecnologia de sequenciamento de próxima geração, MBDCap-seq também requer uma abordagem bioinformática específicos, a fim de quantificar com precisão os níveis de metilação através das amostras. Tem havido muitos estudos recentes em um esforço para otimizar o processo de normalização e análise dos dados de sequenciamento 9, 10. Neste protocolo, demonstramos um destes métodos de aplicação de uma abordagem única de recuperação de leitura - LONUT - seguido pela normalização linear de cada amostra, a fim de permitir comparações imparciais toda grande número de amostras de doentes.
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Protocol
Todos os tecidos são obtidos após a aprovação da comissão Institutional Review Board e quando todos os participantes consentiram em ambas as análises moleculares e estudos de acompanhamento. Os protocolos são aprovados pela Comissão de Estudos Humanos da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio.
1. Captação de ligação ao ADN de metilo (MBDCap)
- Coleta de amostras e isolamento de ADN
- Recolha tumor granel ou amostras de tecidos normais a partir de amostras de tecido embebidos em parafina de pacientes.
- Usar um DNA Mini Kit comercial para isolar o ADN genómico a partir das amostras de tecido embebidos em parafina de acordo com o protocolo do fabricante.
- Use um kit de enriquecimento de DNA metilado com o processo aqui descrito de acordo com o protocolo do fabricante.
- Lavagem talão inicial
Nota: Os grânulos são utilizados para acoplar com a proteína MBD-Biotina, que detecta a metilação de ADN no genoma. Grânulos são usualmente suspensoem uma solução de estoque. Use estas etapas para lavar este líquido.- Ressuspender o estoque de contas de estreptavidina (Veja a Tabela de Materiais) cuidado pipetando para cima e para baixo para obter uma suspensão homogénea. Não misture as contas em vórtice.
- Para um ug de ADN de entrada, ADD10 uL de esferas para um tubo com 90 ul de 1x Bind Buffer / lavagem. Gire durante 1 min. Não misturar em vórtice.
- Colocar o tubo (s) em uma cremalheira magnético durante 1 minuto.
- Remover o líquido com uma pipeta e eliminar o líquido.
- Adicionar 250 ul de 1x tampão de Bind / lavagem para os grânulos e girar durante 1 min.
- Repita os passos 1.2.3 - 1.2.5 duas vezes.
- O acoplamento da proteína MBD-Biotina para os grânulos
- Para 1,2 ug de ADN de entrada, adicionar 7 ul (3,5 ug) de proteína MBD-Biotina a cada tubo.
- Adicionar 93 ul de 1x Bind Buffer / lavagem à proteína para fazer um volume final de 100 uL.
- Misturar a proteína de grânulos-mistura em um misturador rotativo à temperatura ambiente durante 1 h.
- DNA fragmentado (entrada)
- Sonicar ADN pela adição de 1,2 ug de ADN genómico total em 96 uL de tampão TE e 24? L de 5x tampão de Bind / lavagem para fazer uma solução de 120 uL. Use 30 s ON poder e 30 s OFF energia durante sonicação, 20 - 25 vezes.
- Corra 1 uL de solução de ADN sonicada usando um sistema Bioanalyzer com um kit de ADN comercial de alta sensibilidade para verificar o tamanho dos fragmentos de estar na gama de 150-350 pb de acordo com o protocolo do fabricante.
- Lave as MBD-esferas
- Colocar o tubo contendo MBD-esferas em uma cremalheira magnético durante 1 minuto.
- Retirar e descartar o líquido com uma pipeta sem tocar as esferas.
- Ressuspender as esferas com 250 ul de 1x tampão de Bind / lavagem.
- Misturar os grânulos num misturador rotativo à temperatura ambiente durante 5 min.
- Repita os passos 1.5.1 - 1.5.4 duas vezes.
- Reação de captura de DNA fragmentado (1 ug de DNA de entrada)
- Transferir a mistura de ADN / tampão ao tubo contendo os MBD-grânulos.
- Misturar os grânulos com MBD-ADN em um misturador rotativo durante 1 h à TA. Como alternativa, misture O / N a 4 o C.
- A remoção de DNA não-capturado a partir das pérolas
- Depois de misturar o ADN e MBD-grânulos, colocar o tubo na cremalheira magnética durante 1 min a concentrar-se todas as esferas na parede interior do tubo.
- Remover o líquido sobrenadante com uma pipeta e salve-o em um tubo de microcentrífuga livre de DNase limpo como DNA não metilado. Armazenar esta amostra em gelo.
- Adicionar 200 ul de 1x tampão de Bind / lavagem para os grânulos para lavar as pérolas.
- Misturar os grânulos num misturador rotativo durante 3 min.
- Colocar o tubo na cremalheira magnético durante 1 minuto.
- Retirar o líquido com uma pipeta e salve-o em um tubo de microcentrífuga.
- para capture reações de ≤1 mg de DNA de entrada, repita os passos 1.7.3 - 1.7.6 para mais 2 frações de lavagem no total.
- Eluição em dose única
- Misture solução salina diluída com tampão de alto teor salino (1: 1) para obter tampão de eluição (NaCl 1,000 mM).
- Ressuspender as pérolas em 200 ul de tampão de eluição (NaCl 1,000 mM).
- Incubar os grânulos num misturador rotativo durante 3 min.
- Colocar o tubo na cremalheira magnético durante 1 minuto.
- Com o tubo no lugar na prateleira magnética, remover o líquido com uma pipeta sem tocar as contas com a ponta da pipeta, e guardá-lo em um tubo de microcentrífuga limpo livre de DNase de 1,5 mL. Armazenar esta amostra em gelo.
- Repita os passos 1.8.1 - 1.8.4 uma vez, a segunda coleta no mesmo tubo (volume total será de 400 mL). Armazenar a amostra colectiva no gelo.
- Precipitação com etanol (limpeza do ADN)
- Para cada noncaptured, lavagem e eluição fração from os passos anteriores, adicionar 1 ul de glicogénio (20 mg / mL, incluídos no kit), Volume 10/1 amostra de acetato de sódio 3M, pH 5,2 (por exemplo, 40 ul por 400 ul de amostra) e 2 volumes de amostra de 100% etanol (por exemplo, 800 mL por 400 mL de amostra). O volume total é de 1.241 mL.
- Misturar bem e incubar à temperatura de -80 ° C durante pelo menos 2 h.
- Centrifuga-se o tubo durante 15 minutos a 11363 xg, a 4 o C.
- Cuidadosamente descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Adicionar 500 uL de etanol frio a 70%.
- Centrifugue o tubo por 5 min a 11.363 xg a 4 o C.
- Cuidadosamente descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Repita os passos 1.9.6 - 1.9.7 uma vez e remover qualquer sobrenadante residual.
- Ar seco o sedimento para ~ 5 min. Não secar completamente o sedimento.
- Ressuspender o sedimento de DNA em 37,5 uL de água sem ADNase ou outravolume apropriado de tampão.
- Coloque o DNA em gelo ou armazenar o DNA a -20 ° C ou inferior até à sua utilização.
- Verifique se a quantidade total de DNA é superior a 20 ng, (por exemplo, usar o sistema de quantificação fluorimétrica, veja Materiais Tabela).
2. Sequencing
- Use os fragmentos de DNA recuperados de procedimento MBDCap para o sequenciamento. Para cada amostra a ser sequenciada, uma quantidade total de 20 - 40 ng de ADN é necessária para a preparação da biblioteca.
- Para a preparação da biblioteca de ADN-SEQ usar um sistema de construção da biblioteca totalmente automatizado (Ver Tabela Materiais) e seguir o protocolo padrão fornecido pelo fabricante. Seleccione fragmentos de DNA de tamanho 200-400 bp para a preparação da biblioteca. O sistema de preparação biblioteca de automação permite padronizar o procedimento de preparação da biblioteca e minimizar a variação entre as amostras devido à preparação manual.
- privilegiada uso do adaptadorrs e diluir a concentração de 100x. Deste, use 10 mL para cada amostra.
- Seguindo o passo 2.2, levar a cabo a reacção, e quantificar a biblioteca de ADN-SEQ usando um sistema de quantificação fluorométrico (Ver Tabela Materiais).
- Configurar o procedimento de amplificação PCR. A escolha de PCR Master Mix é melhorar a eficiência da PCR da região CG enriquecida do genoma. Num tubo de PCR, adicionar biblioteca 15? L DNA-SEQ, 25 pL de PCR mestre de mistura (Ver Tabela Materiais), 2 uL do iniciador de PCR mix (ver Materiais Tabela), e 8 mL de H 2 O.
- Seguir a recomendação PCR do fabricante da PCR Master Mix, alterando vezes ciclismo e temperaturas para diferentes matérias-primas: 98 o C durante 45 s, ciclos X de 98 o C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s, e em seguida 72 ° C durante 1 min. Segure a 4 o C.
- perform ciclos suficientes para acabar com 2-10 nM de DNA biblioteca (8 - 10 ciclos).
- Limpar reacção de PCR com 1: 1 de PCR grânulos de purificação de acordo com o protocolo do fabricante (Ver Tabela Materiais).
- Eluir com 20 - 30 ul de tampão de eluição.
- Código de barras de cada amostra e piscina 4 amostras juntos em uma pista de uma célula de fluxo. Use o protocolo de leitura padrão de 50 bp única para sequenciação (Ver Tabela de Materiais).
3. Análise Bioinformatics
Nota: Além disso processar os arquivos fastq brutos obtidos a partir do sequenciamento para realizar o controle de qualidade e mapear as sequências de DNA curtas (lê) para o genoma.
- Use Bowtie alinhador curto ler, ferramenta de mapeamento do genoma em cada arquivo de amostra fastq para mapear a lê para o genoma de referência. Muitas ferramentas de mapeamento de leitura estão disponíveis para realizar esta etapa e pode ser usado com base na preferência individual.
- Permitir até 2 inadequações no whole lê enquanto mapeamento para o genoma de referência. Relatar até 20 melhores alinhamentos para cada leitura. Por exemplo, usar gravata borboleta -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- Use LONUT 9 para recuperar a multiplicar lê mapeado para melhorar a detecção das regiões enriquecidas. Para cada leitura, no máximo, um alinhamento seria recuperado quando se está perto o suficiente para qualquer um dos picos acima chamada. Por exemplo, use: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 <alignFile> <OutputPath>. LONUT irá realizar os seguintes passos.
- alinhamentos dividido em mapeados exclusivamente lê e se multiplicam mapeados lê. Pico de chamadas na mapeados exclusivamente lê usando chamador pico CORREIA 11. A opção -w 250 e -p 99 no comando exemplo são para cinto.
- Combine exclusivamente mapeado lê com o recuperado leituras obtidas a partir de LONUT, e o combinado lê, em formato CAMA, vai ser utilizado em análises posteriores. Calcule o número de Combined lê para a normalização futuro.
- Bin as leituras. Extrato lê na região de interesse usando script perl: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <comprimento que se estende a montante> -dn <comprimento que se estende a jusante>. Para cada arquivo de cama listados na sampleInfoFile, o script perl executa as tarefas abaixo.
Nota: Ver o arquivo de codificação complementar para o script perl.- Bin as leituras em tamanho de posição fixa, por exemplo, de 100 pb, por 24 cromossomos.
- Para cada gene especificado em refGeneFile, extrair os recipientes em torno do local de início da transcrição (SST), até ao comprimento que se estende especificado por -up opção e -dn. Por exemplo, extrair os dados da região que é a montante ea jusante 4 KB de TSS. No bin tamanho de 100 pb, este extraíram os dados têm 81 caixas, ea bin centro corresponde ao TSS.
- Para o gene da cadeia anti-sentido, inverter a região extraído da esquerda para a direita, para que caixas de upstream são sempre placed na esquerda com o script perl.
- Além disso dividir TSS ± região de 4 kb em três sub-regiões: esquerda, a montante 4 kb a montante de 2 kb; Oriente, a montante ea jusante 2 kb; Direita, a jusante 2 kb a 4 kb.
- Para cada amostra, dividir a contagem de leituras em cada bin pelo número total de Combinado mapeados lê calculada em 3.3.3. A normalização vai eliminar a amostra específica ler diferenças e permite comparar as leituras entre amostras diferentes.
- Executar o script de festa (como indicado no ficheiro de script) para executar o teste estatístico na normalizada leituras obtidas a partir da região esquerda, para detectar a metilação diferencial entre o grupo normal e o caso nas regiões descritas como na região do flanco.
Nota: Consulte o arquivo de codificação complementar para o script bash. Com base nas regiões que são diferencialmente metilados, existem sete combinações:
Toda a região: metilação diferencial ao longo ± região 4 kb do TSS
middlmetilação diferencial tanto em região média e esquerda: eLeft
metilação diferencial tanto em meio e direita região: MiddleRight
metilação diferencial em ambas as regiões esquerda e direita: flanco
Esquerda: metilação diferencial na região deixou apenas
metilação diferencial na região direito só: Direito
metilação diferencial na região média apenas: Médio - Use o mesmo script bash para visualizar a metilação diferencial em uma trama tornado. Traçar os hiper e hipo genes metilados em um painel separado, e classificar na ordem da combinação região, conforme descrito em 3.4, respectivamente.
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Representative Results
Usámos MBDCap-SEQ de estudar as alterações de metilação do DNA em um grande número de pacientes de diversos tipos de cancro incluindo cancro da mama 12, 13 do endométrio, próstata 14, e cancros do fígado, entre outros. Aqui demonstramos algumas informações a partir do estudo do cancro da mama publicou recentemente 12. Neste exemplo, utilizou-se toda a abordagem de sequenciação do genoma para identificar ilhas CpG que são diferencialmente metilados no tumor em relação à perpendicular entre diferentes regiões genómicas. O inquérito revelou que, do total investigado ilhas CpG localizadas em promotores de genes (n = 13,081), 19,5% apresentaram metilação diferencial em tumores em relação ao normal. Da mesma forma, fora de 6.959 ilhas intragênicos CpG, 55,2% apresentaram metilação diferencial. Promotores intergênicas mostrou 28,1% de 4847 e para os promotores de genes sem ilhas CpG, 1,8% dos 5.454 regiões investigadas mostraram metilação do DNA diferencial (Figura 1A). Uma representação visual(Figura 1B) mostra exemplos representativos das regiões acima discutidos. O mapa de calor descreve claramente as regiões metiladas entre 77 tumores da mama, tecido normal da mama, e 10 linhas celulares de cancro da mama 38. A quantificação da metilação tal como discutido no protocolo bioinformática detalhado neste manuscrito, permite-nos realizar vários testes estatísticos entre estas amostras de pacientes para identificar diferenças significativas de metilação em toda a população ou subpopulação. Esta abordagem de análise fornece-nos com metas verificáveis para investigar os mecanismos epigenéticos nestas amostras de pacientes. Uma vez que estes objectivos sejam identificados, os níveis de metilação pode ser ainda quantificado e validado usando pyrosequencing. O MBDCap-seq fornece uma resolução genômico de cerca de 100-200 pb para os alvos. Para obter mais resolução, locais de CpG dentro destas regiões individuais podem ser selecionados para pirossequenciao quantificação. Nós usar essa abordagem para Quantificar e validar as diferenças de metilação observadas nos dados MBDCap-seq a uma maior resolução e, para comparação entre os grupos de pacientes individuais. A Figura 2 mostra a quantificação de metilação em dois subgrupos não recorrente do cancro endometrial (NR) em comparação com recorrente (R). A figura ilustra o nível de metilação do DNA para cada paciente nos 2 grupos em diferentes locais CpG no promotor ilha CpG do gene alvo SFRP1 identificado.
Figura 1:. Hipermetilação do ADN em amostras de cancro da mama em relação ao tecido da mama normal no promotor e não promotoras ilhas CpG captura Metil sequenciação (MBD-SEQ) foi utilizado para gerar perfis de metilação do DNA de genomas de tumores da mama (n = 77) e tecido da mama normal (n = 10). (A) Pie gráficos demonstram metilação diferencial no promotor, intragenic e intergênico CGIs, bem como regiões promotoras non-CGI. (B) Exemplo loci mostrando CGI promotor, intragenic, intergênico e regiões promotoras non-CGI. Praças tracejadas destacar regiões correspondentes ao hipermetilação câncer de mama. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação de metilação do DNA usando pyrosequencing de locais CpG em um gene alvo identificado metilação do DNA da região promotora SFRP 5 em pacientes com carcinoma endometrial recorrentes e não-recorrentes detectados pelo pyrosequencing.. Cada local representa um site de CpG (R: Recurrent, n = 21 e NR: Não Recorrente, n = 71). Os gráficos mostramA média eo erro barras mostram o erro padrão da média ou SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A técnica MBDCap-seq é uma abordagem de enriquecimento de afinidade 3, considerada como uma alternativa de custo eficaz quando se investiga coortes com um grande número de pacientes 15. O gasoduto apresentado aqui descreve uma abordagem abrangente, desde a colheita de amostra para análise de dados e interpretação. Um dos passos mais importantes é a criação de um procedimento de amplificação por PCR para melhorar a eficiência da PCR das regiões GC enriquecido no genoma como este é onde ocorre a metilação do DNA. Além disso, é essencial para assegurar que, após sequenciação, cada amostra tem, pelo menos, mais do que 20 milhões mapeados exclusivamente lê ao genoma. Esta cobertura é esperado para dar profundidade enriquecimento ou sequência suficientes para mapear todo o genoma 12. Se esta cobertura não for cumprida durante a primeira rodada de sequenciamento para uma determinada amostra e mais de DNA para que a amostra da parte uma está disponível, uma nova rodada de sequenciamento na segunda parte pode ser executado. A resultante leituras podem ser mesclado com o rEADS da primeira rodada para alcançar a cobertura. Os experimentos globais devem ser projetados para incluir alguns controles biológicos (por exemplo, tecido normal) para contabilizar viés base em fatores como variações no número de cópias 15.
A nossa abordagem bioinformática para investigar a metilação do DNA observado nas amostras do paciente fornece possíveis genes alvo que mostram o enriquecimento diferencial metilação no promotor-núcleo, regiões promotor costa e também diversas combinações destes. Apesar do fato de que MBDCap-seq pode, no máximo, chegar a resolução para baixo apenas até um de 100 pb, a distinção destas regiões no núcleo e em terra, conforme descrito no protocolo nos permite identificar as regiões alvo potencial para uma investigação mais aprofundada das funções reguladoras de diferencial enriquecimentos de metilação e conduzir estudos mecanicistas futuros. Aqui nós também descrevem uma forma de visualizar estas regiões identificadas usando tornado parcelas, que fornece uma visão geral do enriquecimento diferencialpadrões.
Há outras técnicas que se baseiam na conversão química de citosina não metilada em uracilo por bissulfureto de sódio através de desaminação, e proporcionar uma cobertura mais completa da metilação do DNA com uma resolução de um único nucleótido. Normalmente, após a conversão bissulfureto, o ADN é sequenciado utilizando pyrosequencing para experiências por objectivo ou por toda espingarda genoma bissulfureto de sequenciação (BS-SEQ). Estas técnicas de abordar a limitação da técnica aqui descrita como SEQ MBDCap-só pode atingir, no máximo, uma resolução de até 100 pb. No entanto, apesar destas abordagens sendo mais abrangente, eles são relativamente caros e podem aumentar exponencialmente o custo como a profundidade de sequenciação ou o número de pacientes é aumentada. Por outro lado, as plataformas de microarray bisulfide comumente utilizados são rentáveis, mas fornecem relativamente baixa cobertura com sondas de regiões próximas aos promotores de genes em vez de todo o genoma investigando. MBDCap-seq no entanto, forneceum equilíbrio entre estas técnicas de sequenciamento de alto custo e matrizes de metilação de baixo custo 16. Nós estamos usando esse protocolo para investigar a metilação do DNA em um grande número de grupos de pacientes, como parte do projeto do cancro do Sistema Methylome 10 e pode ser usado para outros estudos envolvendo grandes coortes de pacientes.
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Disclosures
Este protocolo é desenvolvido nos laboratórios do Dr. Tim Huang e Dr. Victor Jin da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio.
Acknowledgments
O trabalho é apoiado pelo CPRIT Research Training Award RP140105, bem como parcialmente suportado pelo US National Institutes of Health (NIH) concede R01 GM114142 e por William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
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