Summary
Her presenterer vi en protokoll for å undersøke genome wide DNA metylering i storskala klinisk pasientscreeningstudier ved hjelp av metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq eller MBD-seq) teknologi og påfølgende bioinformatikk analyse rørledning.
Abstract
Metylering er en av de essensielle epigenetiske modifikasjoner av DNA, som er ansvarlig for nøyaktig regulering av gener som er nødvendige for stabil utvikling og differensiering av forskjellige vevstyper. Dysregulering av denne prosessen er ofte kjennetegnet av forskjellige sykdommer som kreft. Her skisserer vi en av de siste sekvense teknikker, metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), som brukes for å kvantifisere metylering i ulike normale og sykdom vev for store pasient kohorter. Vi beskriver en detaljert protokoll av denne affinitet anrikning tilnærming sammen med en bioinformatikk rørledning for å oppnå optimal kvantifisering. Denne teknikken har blitt brukt for å sekvensere på flere hundre pasienter på tvers av ulike cancertyper som en del av den 1000 methylome prosjektet (Cancer Methylome System).
Introduction
Epigenetisk regulering av gener som gjennom DNA-metylering er en av de grunnleggende mekanismer som er nødvendige for å bestemme den celle skjebnen ved stabil differensiering av forskjellige typer vev i kroppen en. Dysregulering av denne prosessen har vært kjent for å forårsake forskjellige sykdommer, inkludert kreft 2.
Denne prosessen innebærer i hovedsak tilsetning av metylgrupper i cytosin resten i CPG-dinukleotider av DNA-3. Det finnes flere ulike teknikker som i dag brukes for å undersøke denne mekanismen, som hver har sine egne fordeler som skissert i mange studier 2-8. Her vil vi diskutere en av disse teknikkene kalles metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), hvor vi bruker en tilhørighet berikelse teknikk for å identifisere denaturert regioner av DNA. Denne teknikk bygger på den metyl-bindingsevnen av proteinet MBD2 for å anrike for de genomiske DNA-fragmenter inneholdende metylerte CpG-områder. Vi bruker en kommersiell metylert DNA berikelse kitfor isolering av disse metylert regionene. Vårt laboratorium har vist hundrevis av pasientprøver ved hjelp av denne teknikken, og her gir vi en omfattende optimalisert protokollen, som kan brukes til å undersøke store pasient kohorter.
Som tydelig med noen neste generasjons sekvenseringsteknologi, MBDCap-seq krever også en bestemt bioinformatikk tilnærming for å nøyaktig kvantifisere nivåene av metylering over prøvene. Det har vært mange nylige studier i et forsøk på å optimalisere normalisering og analyseprosessen av sekvenseringsdataene 9, 10. I denne protokollen, viser vi en av disse metodene implementere en unik lese utvinning tilnærming - LONUT - etterfulgt av lineær normalisering av hver prøve for å gjøre det mulig objektive sammenligninger mellom stort antall pasientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle vev oppnås etter godkjennelsen av Institutional Review Board komiteen og når alle deltakerne samtykket til både molekylære analyser og oppfølgingsstudier. Protokollene er godkjent av humane studier Utvalget ved University of Texas Health Science Center i San Antonio.
1. metyl-binding DNA Capture (MBDCap)
- Prøvetaking og DNA
- Samle bulk svulst eller prøver normale vev fra pasient parafin innebygd vevsprøver.
- Bruk en kommersiell DNA mini kit å isolere genomisk DNA fra parafininnebygd vevsprøver i henhold til produsentens protokoll.
- Bruk en metylert DNA berikelse kit med prosedyren som er beskrevet her i henhold til produsentens protokoll.
- Initial perle vask
Merk: Perlene blir anvendt for å koble med MBD-biotin protein, som detekterer DNA-metylering på genomet. Perler er vanligvis suspenderti en stamløsning. Bruk disse trinnene for å vaske av denne væsken.- Resuspender lager av streptavidin perler (Se Materials tabell) ved forsiktig pipettering opp og ned for å oppnå en homogen suspensjon. Ikke bland perlene ved virvling.
- For ett mikrogram av input DNA, ADD10 ul av perler på en tube med 90 mL av 1x Bind / vaskebuffer. Roter i 1 min. Ikke bland ved virvling.
- Plasser røret (e) på et magnetisk stativ i 1 min.
- Fjern væsken med en pipette og kast væsken.
- Tilsett 250 mL av 1x Bind / Wash Buffer til perlene og roter i 1 min.
- Gjenta trinn 1.2.3 - 1.2.5 to ganger.
- Kobling av MBD-Biotin-proteinet til kulene
- For 1,2 mikrogram av input DNA, tilsett 7 mL (3,5 mikrogram) av MBD-Biotin protein til hvert rør.
- Legg 93 ul av 1 x Bind / vaskebuffer til proteinet for å gjøre et sluttvolum på 100 ul.
- Bland perler-proteinblandingen på en rotasjonsblander ved romtemperatur i 1 time.
- Fragmentert DNA (input)
- Sonikere DNA ved tilsetning av 1,2 ug av totalt genomisk DNA i 96 pl TE-buffer og 24 pl 5x Bind / vaskebuffer for å lage en 120 ul løsning. Bruk 30 s strømmen PÅ og 30 s strømmen under ultralydbehandling, 20 - 25 ganger.
- Kjør 1 pl av sonikert DNA-oppløsningen ved hjelp av et Bioanalyzer system med en kommersiell høy følsomhet DNA-kit for å kontrollere størrelsen av fragmentene for å være i området fra 150 til 350 bp i henhold til produsentens protokoll.
- Vask MBD-perler
- Plasser røret som inneholder MBD-perler på en magnetisk stativ i 1 min.
- Fjern og kast væske med en pipette uten å berøre perlene.
- Suspender perlene med 250 mL av 1x Bind / vaskebuffer.
- Bland perlene på en roterende mikser ved RT i 5 min.
- Gjenta trinn 1.5.1 - 1.5.4 to ganger.
- Fragmentert DNA-fangst reaksjon (1 mikrogram inngang DNA)
- Overfør blandingen DNA / buffer til røret som inneholder MBD-perlene.
- Bland MBD-perler med DNA på en roterende mikser i 1 time ved RT. Alternativt, bland O / N ved 4 o C.
- Fjerning av ikke-fanget DNA fra Perler
- Etter blanding av DNA og MBD-perler, plasseres røret på magnetstativet i 1 min for å konsentrere alle av kulene på den indre veggen av røret.
- Fjern supernatanten med en pipette og lagre den i en ren DNase-fri mikrosentrifugerør som nonmethylated DNA. Oppbevar denne prøven på is.
- Tilsett 200 mL av 1x Bind / Wash Buffer til perlene å vaske perlene.
- Bland perlene på en roterende blander i 3 minutter.
- Plasser røret på en magnetisk stativ i 1 min.
- Fjern væsken med en pipette og lagre den i en mikro tube.
- for capture reaksjoner av ≤1 ug innspill DNA, gjenta trinn 1.7.3 - 1.7.6 for 2 mer vask fraksjoner totalt.
- Enkelt fraksjon eluering
- Blande lav-salt-buffer med høy saltbuffer (1: 1) for å få elueringsbuffer (1000 mM NaCl).
- Resuspender perler i 200 ul elueringsbuffer (1000 mM NaCl).
- Inkuber perler på en roterende blander i 3 minutter.
- Plasser røret på en magnetisk stativ i 1 min.
- Med røret på plass på magnetiske rack, fjerne væsken med en pipette uten å berøre perlene med pipettespissen, og lagre den i en ren DNase-free 1,5 ml mikrosentrifugerør. Oppbevar denne prøven på is.
- Gjenta trinn 1.8.1 - 1.8.4 gang, samle den andre prøven i samme rør (totalt volum blir 400 mL). Oppbevar samleprøve på is.
- Etanol nedbør (DNA opprydding)
- Til hver noncaptured, vask og eluering brøkdel from de foregående trinnene, tilsett 1 pl glykogen (20 ug / ul, som inngår i settet), 1/10 prøvevolum på 3 M natriumacetat, pH 5,2 (for eksempel, 40 ul per 400 ul av prøven) og 2 prøvevolumer på 100% etanol (f.eks 800 mL per 400 ul prøve). Det totale volumet er 1,241 mL.
- Bland godt og inkuber ved -80 ° C i minst 2 timer.
- Sentrifuger røret i 15 minutter ved 11 363 x g ved 4 o C.
- forkaste nøye supernatanten uten å forstyrre pelleten.
- Legge til 500 ul kald 70% etanol.
- Sentrifuger røret i 5 min ved 11363 x g ved 4 o C.
- forkaste nøye supernatanten uten å forstyrre pelleten.
- Gjenta trinn 1.9.6 - 1.9.7 gang og fjerne eventuelle gjenværende rester av supernatant.
- Air-tørke pellet for ~ 5 min. Ikke helt tørr pellet.
- Resuspender DNA-pelleten i 37,5 ul av DNase-fri vann eller annenpassende volum av buffer.
- Plasser DNA på is eller lagre DNA ved -20 ° C eller lavere inntil videre bruk.
- Sjekk at den totale mengden av DNA er over 20 ng, (for eksempel bruke fluorometrisk kvantifisering system, se Materialer tabell).
2. Sekvense
- Bruk DNA-fragmentene utvinnes fra MBDCap prosedyre for sekvensering. For hver prøve som skulle bli sekvensert, en total mengde på 20 - er 40 ng DNA som kreves for fremstilling av bibliotek.
- For DNA-seq bibliotek forberedelse bruker en helautomatisk bibliotek byggesystem (Se Materials Table) og følg standard protokoll fra produsenten. Velg DNA-fragmenter av størrelse 200-400 bp for bibliotek forberedelse. Automatisering bibliotek forberedelse systemet tillater standardisering biblioteket forberedelse prosedyre og minimere variasjon mellom prøvene på grunn av manuell forberedelse.
- Bruk adapter primers og fortynne til 100x konsentrasjon. Av dette bruker 10 mL for hver prøve.
- Etter trinn 2.2, ta reaksjonen, og kvantifisere DNA-seq biblioteket ved hjelp av en fluorometrisk kvantifisering system (se Materialer tabell).
- Sett opp PCR forsterkning prosedyre. Valget av PCR masterblanding er å forbedre effektiviteten av PCR GC anriket region av genomet. I en PCR rør, tilsett 15 mL DNA-seq bibliotek, 25 mL PCR Master Mix (Se Materials tabell), 2 mL PCR-primer mix (Se Materials tabell), og 8 mL H 2 O.
- Følge PCR anbefaling fra produsent av PCR masterblanding, forandre syklustider og temperaturer for forskjellige utgangsmaterialer: 98 ° C i 45 s, X sykluser av 98 ° C i 15 s, 65 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og deretter 72 ° C i 1 min. Hold ved 4 o C.
- Perform nok sykluser for å ende opp med 2-10 nM av biblioteket DNA (8 - 10 sykluser).
- Rydd opp PCR reaksjon med 1: 1-forhold av PCR-rensing perler i henhold til produsentens protokoll (Se Materials tabell).
- Elueres med 20 - 30 uL elueringsbuffer.
- Barcode hver prøve og basseng 4 prøver sammen til ett kjørefelt av en flyt celle. Bruk standard 50 bp enkelt lese protokollen for sekvensering (se Materialer tabell).
3. Bioinformatikk Analysis
Merk: Ytterligere behandle rå fastq filer hentet fra sekvensering for å utføre kvalitetskontroll og kartlegge de korte DNA-sekvenser (leser) til genomet.
- Bruk Bowtie kort lese aligner, genom kartleggingsverktøy på hver prøve fastq fil å kartlegge leser til referanse genomet. Mange lese kartleggingsverktøy er tilgjengelige for å utføre dette trinnet og kan brukes basert på individuelle preferanser.
- Det kan ta inntil 2 uoverensstemmelser i whole leser mens kartlegge til referanse genomet. Rapport opptil 20 beste justeringer for hver leser. For eksempel bruke bowtie -v 2 --best -K 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- Bruk LONUT 9 for å gjenvinne multiplisere tilordnet leser for å forbedre deteksjonen av de anrikede regionene. For hver lest, høyst en oppstilling vil bli gjenvunnet når den er nær nok til noen av de oven kalt topper. For eksempel bruke: perl lonut.pl -g hg19-w 250 -p 99 <alignFile> <outputPath>. LONUT vil utføre følgende trinn.
- Split justeringer i entydig kartlagt leser og formere kartlagt leser. Call peak på den unike kartlagt leser bruker peak innringer BELTE 11. Alternativet -w 250 og -p 99 i eksempelet kommandoen er for belte.
- Kombiner entydig tilordnet leser med den gjenvunnede lesninger oppnådd fra LONUT, og den kombinerte leser, i sengen format, vil bli brukt i videre analyser. Beregn antall som koed leser for fremtiden normalisering.
- Bin den leser. Extract leser i regionen av interesse å bruke perl script: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <oppstrøms utvide lengden> -dn <nedstrøms utvide lengden>. For hver seng fil oppført i sampleInfoFile, utfører perl script nedenfor oppgaver.
Merk: Se supplerende koding fil for perl script.- Bin den leser inn i faste bin størrelse, for eksempel 100 bp, for 24 kromosomer.
- For hvert gen som er angitt i refGeneFile, pakke ut hyller rundt transkripsjon start stedet (TSS), opp til å utvide lengden spesifisert av alternativet -up og -dn. For eksempel hente ut data i regionen som er opp og nedstrøms 4 kb av TSS. At bin størrelse 100 bp, dette hentet ut data har 81 binger, og senteret bin tilsvarer TSS.
- For genet på anti strand, snu den utpakkede regionen fra venstre til høyre, slik at oppstrøms skuffer er alltid plasert på igjen med perl script.
- Ytterligere dele TSS ± 4 kb region i tre under regioner: Venstre, oppstrøms 4 kb til oppstrøms 2 kb; Middle, opp og nedstrøms 2 kb; Høyre, nedstrøms 2 kb til 4 kb.
- For hver prøve, dele tellingen av lyder i hvert bin av det totale antall kombinert kartlagt leser regnes i 3.3.3. Normaliserings vil eliminere prøven spesifikke lese forskjeller og gjør det mulig å sammenligne leser på tvers av ulike prøver.
- Kjør bash skriptet (som angitt i skriptet fil) for å utføre statistisk test på den normaliserte leser oppnådd fra venstre regionen, for å detektere differensial metylering mellom normal og fall gruppe i regionene beskrevet som i flanken regionen.
Merk: Se tilleggskodefilen for bash script. Med utgangspunkt i de regionene som er differensielt metylert, er det syv kombinasjoner:
Hele regionen: differensial metylering hele TSS ± 4 kb region
middleLeft: differensial metylering i både midten og venstre region
MiddleRight: differensial metylering i både midtre og høyre region
Flanke: differensial metylering i både venstre og høyre region
Venstre: differensial metylering i venstre region bare
Høyre: differensial metylering i riktig region bare
Midten: differensial metylering i midtre del bare - Bruk samme bash skript for å visualisere differensial metylering i en tornado plot. Plotte hyper og hypo metylerte gener på et separat panel, og sortert i orden av regionen kombinasjonen som er beskrevet i 3.4, respektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har benyttet MBDCap-seq å studere DNA-metylering endringer hos et stort antall pasienter fra forskjellige krefttyper, inkludert bryst 12, endometrial 13, prostata 14, og lever kreft blant andre. Her viser vi litt informasjon fra brystkreft studie publisert nylig 12. I dette tilfellet brukte vi hele genomet sekvense tilnærming for å identifisere CpG-øyene som er differensielt metylert i tumor med hensyn til normalen på tvers av forskjellige genomiske regioner. Undersøkelsen viste at av totalt undersøkt CpG øyer som ligger i genet arrangører (n = 13,081), 19,5% viste differensial metylering i svulster i forhold til det normale. Tilsvarende ut av 6,959 intragenic CpG øyer, 55,2% viste differensial metylering. Intergeniske arrangører viste 28,1% av 4847 og for genet arrangører uten CpG øyer, 1,8% av 5,454 undersøkt regioner viste differensial DNA metylering (figur 1A). En visuell representasjon(Figur 1B) viser representative eksempler på de regionene som er omtalt ovenfor. Heatmap viser tydelig de denaturert regioner over 77 brystsvulster, 10 bryst normalt vev, og 38 bryst kreft cellelinjer. Kvantifisering av metylering som diskutert i bioinformatikk protokollen beskrevet i dette manuskriptet, gjør oss i stand til å utføre ulike statistiske tester på tvers av disse pasientprøver for å identifisere vesentlige metylering forskjeller i hele befolkningen eller en undergruppe. Denne analysen tilnærmingen gir oss med testbare mål å undersøke nærmere epigenetiske mekanismene i disse pasientprøver. Når disse målene er identifisert, kan nivåene av metylering bli ytterligere kvantifiseres og validert ved hjelp av pyrosekvensering. Den MBDCap-seq gir en genomisk oppløsning på ca 100-200 bp for målene. For å oppnå ytterligere oppløsning, kan enkelte CpG steder innenfor disse regionene velges for pyrosekvensering kvantifisering. Vi bruker denne tilnærmingen til Quansere og validere metylering forskjellene som ble observert i de MBDCap-seq data med en høyere oppløsning og for sammenligning mellom individuelle pasientgrupper. Figur 2 viser kvantifisering av metylering i 2 endometriecancer undergrupper nonrecurrent (NR) sammenlignet med tilbakevendende (R). Figuren viser nivået av DNA metylering for hver pasient i 2 grupper på forskjellige CpG steder i arrangøren CpG island av identifiserte målet genet SFRP1.
Fig. 1: hypermethylation DNA i brystkreft prøvene i forhold til det normale brystvev i promoter- og ikke-promotor CpG øyer Metyl-fangst sekvensering (MBD-seq) ble anvendt for å generere DNA-metylering profiler av genomene til bryst-tumorer (n = 77) og normalt brystvev (n = 10). (A) Pie diagrammer demonstrere differensial metylering i promoter, intragenic, og intergeniske CGIer så vel som ikke-CGI promoter regioner. (B) Eksempel loci viser promoter CGI, intragenic, intergeniske, og ikke-CGI promoter regioner. Stiplede torg markerer regioner tilsvarende brystkreft hypermethylation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantifisering av DNA metylering ved hjelp av pyrosekvensering av CpG sider i en identifisert målet genet DNA metylering av SFRP 5 promoter-regionen i tilbakevendende og ikke-tilbakevendende livmorkreft pasienter som oppdages av pyrosekvensering.. Hvert område representerer en CpG nettsted (R: Tilbakevendende, n = 21 og NR: engangs, n = 71). Tomtene visegjennomsnitts og feilSøylene viser standardfeil for gjennomsnittet eller SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MBDCap-seq teknikk er en tilhørighet berikelse tilnærming 3, regnes som et kostnadseffektivt alternativ når etterforsker kohorter med et stort antall pasienter 15. Rørledningen som presenteres her beskriver en helhetlig tilnærming fra prøve innkjøp til dataanalyse og tolkning. Et av de viktigste trinn er å sette opp en PCR-amplifisering fremgangsmåte for å forbedre effektiviteten av PCR GC anriket regioner i genomet som dette er hvor DNA-metylering inntreffer. Dessuten er det viktig å sikre at etter sekvensering, har hver prøve i alle fall mer enn 20 millioner entydig tilordnet leser til genomet. Denne dekningen forventes å tilveiebringe tilstrekkelig anrikning eller sekvens dybde for å kartlegge hele genomet 12. Hvis denne dekningen ikke er oppfylt i løpet av den første runden av sekvensering for et bestemt utvalg og mer DNA for at prøven fra del en er tilgjengelig, kan en ny runde med sekvensering i del to kjøres. Den resulterende leser kan bli slått sammen med rEADS fra første runde for å oppnå dekning. Den samlede eksperimenter bør være utformet for å inkludere noen biologiske kontroller (for eksempel normal vev) for å redegjøre for skjevhet basert på faktorer som kopinummervariasjoner 15.
Vår bioinformatikk tilnærming for å undersøke DNA-metylering observert i pasientprøvene gir mulige målgener som viser differensial metylering anrikning i kjerne-promotoren, promotoren strandsonen og også forskjellige kombinasjoner av disse. Til tross for at MBDCap-seq kan på de fleste nå oppløsningen ned bare opp til en 100 bp, æren av disse regionene i kjernen og kysten som beskrevet i protokollen gjør det mulig for oss å identifisere potensielle målområder for videre undersøkelser av de regulatoriske roller differensial metylering enrichments og gjennomføre fremtidige mekanistiske studier. Her beskriver vi også en måte å visualisere disse identifiserte områder bruker tornado tomter, noe som gir en oversikt over differensial berikelsemønstre.
Det finnes andre metoder som er basert på kjemisk omdannelse av unmethylated cytosin til uracil av natrium bisulfide gjennom deaminering, og tilveiebringe en mer omfattende dekning av DNA-metylering ved et enkelt nukleotid oppløsning. Vanligvis etter bisulfide omdannelse blir DNA sekvenseres ved hjelp av pyrosekvensering for target-baserte eksperimenter eller ved hele genomet hagle bisulfide sekvensering (BS-seq). Disse teknikkene adressere begrensning av teknikken beskrevet her som MBDCap-seq kan bare oppnå på det meste en oppløsning på opp til 100 bp. Men til tross for disse metodene er mer fullstendig, er de forholdsvis dyre og kan eksponentielt øke kostnadene som dybden av sekvensering eller antallet pasienter økes. På den annen side, som vanligvis brukes bisulfide microarray plattformer er kostnadseffektive, men gir relativt lav dekning med prober undersøke regioner som har genet promotorer i stedet for hele genomet. MBDCap-seq men giren balanse mellom disse høye kostnader sekvense teknikker og lavkost metylering arrays 16. Vi bruker denne protokollen for å undersøke DNA metylering i et stort antall pasient kohorter, som en del av Kreft Methylome System prosjekt 10 og kan brukes i fremtidige studier med store pasient kohorter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne protokollen er utviklet i laboratorier av Dr. Tim Huang og Dr. Victor Jin ved University of Texas Health Science Center i San Antonio.
Acknowledgments
Arbeidet er støttet av CPRIT Forskerutdannings Award RP140105, samt delvis støttet av amerikanske National Institutes of Health (NIH) innvilger R01 GM114142 og William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H.
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
