Abstract
rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.
Introduction
Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a 1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos 3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) 4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos 5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem 7,8.
Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo 7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido 8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema 8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente 7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos 8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel 7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. 7.
Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica 'Sca le' (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados 14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) 'CÚBICAS "método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging 8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente 21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparações Solução
NOTA: O Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre 18 foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein College of Medicine 19. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono em uma câmara fechada durante pelo menos 60 segundos, seguido por meios físicos de verificação morte por toracotomia bilateral, decapitação ou deslocamento cervical.
- Prepare Tamoxifeno. Dissolve-se 10 mg de Tamoxifeno em 10 ml de semente de girassol oieu. Uma vez que esteja completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 ° C.
- Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dissolve-se Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20129 g) em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,4.
- Prepare PBST: 0,1% de Tween-20 em PBS solução por dissolução de 100 ul de Tween-20 em 100 ml de PBS.
- Preparar tampão de bloqueio. Adicione 3% de albumina de soro bovino a solução de bloqueio (BSA) por dissolução de 3 g de BSA em 100 mL de PBST contendo 0,2% de Tween-20.
- Prepare CUBIC-1 (reagente 1). Misturar 25% em peso de ureia, 25% em peso de N, N, N ', N'-tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 15% em peso de Triton X-100 em dH2O
- Prepare CUBIC-2 (reagente 2). Misturar 50% em peso de sacarose, 25% em peso de ureia, 10% em peso de 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol e 0,1% (v / v) de Triton X-100 em dH2O
- Prepare Sca le A2: 4 M de ureia, 10% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH 2 O. Ajustar o pH para 7,7.
- Prepare Sca le B4: ureia 8M e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O Ajustar o pH para 8,7.
- Prepare Sca le 70: 4 M ureia, 70% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O
2. O tamoxifeno indução, isolamento de embriões e Fixação
- Tamoxifeno Indução e isolamento de embriões
- Usando um protocolo tubo de alimentação curva aprovado (ACUP 13-12007), sonda as fêmeas ratos R26Cre ERT2 Confetti (conectado por camundongos machos R26Cre ERT2) com 10 ug / g de Tamoxifen em embrionária dia de desenvolvimento E7.75 33. No dia embrionário 9,5 (E9.5) ou E10.5, eutanásia os ratos do sexo feminino com CO 2 e deslocamento cervical.
- Após a verificação da morte do rato (ver secção 1 Nota), abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura e dissecar o corno uterino, remover as camadas de tubo uterino com a ajuda de tesouras e pinças, e relocar os embriões do 23,24 tuba uterina.
- Transferir os embriões para uma placa de Petri contendo PBS (pH 7,4). Sob o microscópio de dissecação, remover as camadas não-embrionárias (córion, saco vitelino e âmnio) com a ajuda da pinça.
- Com uma pinça e tesouras, recolher as amostras de mulheres do rato e da cauda do embrião para genotipagem conforme relatado anteriormente 22. Usando uma pipeta de plástico, transferir cada embrião para um poço de uma placa de 48 contendo 1 ml de PBS 1x.
- Sob um microscópio de fluorescência, identificar os embriões / RFP / PCP positivas GFP por meio de um microscópio invertido com uma câmara. Descascar o pericárdio, usando uma pinça e gire o coração / embrião com a ajuda de pinças curvas para determinar o número de clones fluorescentes em ambos os lados do coração com os filtros GFP / RFP / CFP. Sem cortes são necessários.
- Depois de identificar GFP / RFP / embriões PCP positivos, lavar rapidamente os embriões duas vezes (2 min cada) com 1x PBS em the 48 bem-placa num agitador de placas à temperatura ambiente (TA). Isto irá remover o excesso de sangue.
- Corrigir o coração do embrião / embrionário usando 4% de paraformaldeído (PFA) a TA. O tempo de fixação depende da idade e tamanho do tecido embrionário. Para corrigir o embrião E9.5 durante 2 h à TA. Os embriões estágio embrionário final exigem mais tempo de fixação, que pode até mesmo ser prolongada até 24 horas para o coração pós-natal.
CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, evitar o contacto com a pele, olhos e mucosas. - Após a fixação, lavar o embrião / coração no poço de placa 48 por duas vezes (10 minutos cada) com PBS 1x num agitador de placas à TA. Isto remove o excesso de PFA a partir do embrião / coração. Os embriões são então processadas para toda coloração montagem e desobstrução dos tecidos.
3. Whole Mount Coloração
NOTA: Depois de PFA fixação do embrião / coração é submetido a toda a coloração de montagem como segue.
- Permeabilizar o embrião / coração em um bem-placa de 48 usando 1 ml de PBST 0,1% durante 2 horas num agitador de placas à TA.
- Seguindo permeabilização, mergulhe o embrião / coração em 1 ml de tampão de bloqueio, por 2 horas ou durante a noite num agitador de placas a 4 ºC.
- Mergulha-se o embrião / coração ao endotelial PECAM anticorpo específico da célula (CD31), diluído (1: 100) em 0,3 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC.
- Lave o embrião / coração utilizando PBST 5 vezes, 30 minutos cada à temperatura ambiente num agitador de placas. Isto remove o excesso de anticorpo primário não ligado específico do tecido.
- Mergulha-se o embrião / coração em anticorpo secundário anti-rato de cabra Alexa Fluor 647, diluído (1: 1000) em 1 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC.
- Repetir o passo 3.4 para lavar o anticorpo secundário.
- Pós-fixar o embrião / coração com 4% de PFA durante 1 h à TA num agitador de placas e lava-se duas vezes com PBS, 5 minutos cada.
- Coloração do embrião / coração com o corante nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluído em PBST a uma concentração de 0,01 mg / mL) durante 10 min num agitador de placas à TA. Siga com duas lavagens com PBS de 5 minutos cada.
4. Embrião / Clearing coração com Sca l e ou Método CUBIC
NOTA: Depois de toda coloração montagem, o embrião / coração é submetido tanto ao Sca le ou método de compensação cúbica de tecido. A escolha do método depende do tamanho e idade do tecido embrionário. Para E11.5 ou embriões idade mais precoce, o uso Sca l e método de limpeza de tecidos, enquanto que para embriões mais velhos ou corações pós-natal é preferido o método de compensação cúbica de tecido.
- Escala de tecidos Método Clearing
- Incubar o embrião / coração com 1 ml de Sca l solução de e A2 em um frasco de cintilação (embrulhadas em papel de alumínio) com ocasionais agitação suave (à mão) durante 48 horas a 4 ° C.
- Após a incubação Sca l e A2, incubar o embrião / coração com 1 mL de Sca l solução de e B4 a 4 ° C no mesmo frasco com agitação suave ocasional para anot-lhe 48 h.
- Incubar o embrião / coração durante mais 48 h com 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C com agitação suave ocasional. Mount embrião usando 90% de glicerol (ver secção 5.1).
- Cúbica de tecido Método Clearing
- Para toda embrião / coração compensação cúbicos, mergulhe cada embrião / coração em 1 ml de CUBIC-1 com ocasional agitação suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Após 48 horas, substitui a solução com o mesmo volume de reagente fresco CUBIC 1, e incuba-se a amostra para uma 48 horas adicionais a 37 ° C com agitação ocasional com a mão.
- Lavar a cúbica-1 tratados coração / embrião com 1x PBS várias vezes à temperatura ambiente com agitação suave com a mão. Isso remove o excesso de solução CUBIC-1.
- Depois de lavar a CUBIC-1 com PBS, mergulhar os embriões / corações em CUBIC-2 solução (1 g por embrião / coração) por 48 horas a 37 ºC com agitação ocasional gentil com a mão. Isto segue de montagem usando glicerol embrião / coração (ver secção 50,2).
5. Montagem Sample and Imaging
NOTA: Os embriões desmatadas ou órgãos em Sca l e 70 ou cúbica-2 solução pode ser trabalhada diretamente com Escala 70 e cúbicas-2 solução como o meio de imagem, respectivamente. No entanto, considerando a vulnerabilidade das amostras embrionárias para reagentes de compensação, se as amostras não são imediatamente ser trabalhada, mas armazenada a longo prazo, armazenar as amostras em glicerol a 90%, seguindo o protocolo abaixo.
- Diretamente mergulhe o Sca le apuradas amostra em 1 ml de 90% de glicerol e armazenar a 4 ° C até imagiologia.
- Lava-se a amostra tratada cúbicos com 1x PBS, duas vezes, 5 min cada e sequencialmente incubar a amostra com 1 ml de 30%, 50%, 70% e solução de glicerol a 90% durante 30 min cada.
- Para imagiologia, transferir a amostra para uma placa de Petri de vidro de fundo com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e imagem clones com um microscópio confocal equipado com duas capacidades de fotões.
- Imagem do coração ou embrião no glicerol com um / 0.3 NA 10X, um 25X / 0.8 NA imersão, ou uma lente objetiva de corretiva 40X / 1.2 NA água. Imagem DAPI usando 2-fótons de excitação de um titânio coerente: a laser camaleão safira. A escolha do microscópio e a lente objectiva dependerá da finalidade das experiências, por exemplo, para super-resolução, um microscópio de fluorescência folha de luz poderia ser utilizado.
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Representative Results
Imaging o coração embrionário apuradas
Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes 1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir do segundo campo do coração, inicialmente residentes dorsomedially para o primeiro campo do coração, subsequentemente translocar para a faringe e esplânenico mesoderme, a partir de onde elas migram para o andaime pré-existente do tubo cardíaco linear. As células do segundo campo coração vai contribuir para o ventrículo direito, via de saída (OFT) do miocárdio e, em certa endocárdio 25-28. células da crista neural cardíacos (CNCC), proveniente rhombomeres postotic 6, 7 e 8, vai migrar para a faringe caudal e contribuir significativamente para a camada de músculo liso e coxins endocárdicos na OFT. Eles também contribuem para a formação do septo aorticopulmonary 29,30. O quarto da população consiste em células do epicárdio derivados do órgão pró-epicárdica (PEO), e contribui para fibroblastos, células musculares lisas e outros tipos de células potencialmente cardíaca 31. O epicárdio regula o desenvolvimento vascular coronariana, o crescimento cardíaco e morfogênese 21.
O conceito mais importante sobre a morfogênese cardíaca é que durante o desenvolvimento do coração, migração celular anormal / diferenciação das populações de células progenitoras de quatro irá resultar em malformações ou defeitos cardíacos congênitos 4,22,32, que é a causa número um de defeitos de nascimento no mundo . Determinar os mecanismos de morfogênese cardíaca a nível celular e molecular é um passo essencial para melhorar o diagnóstico e tratamentos potenciais para a DCC.Portanto, é fundamental para a imagem do processo de morfogênese cardíaca em todo o nível do coração com a resolução única célula. Para conseguir isso, os cardiomiócitos marcado por cruzamento da linha de Cre sob o controle de troponina T cardíaca específica (TnT), que é expressa especificamente em cardiomiócitos 18, com a linha mTmG repórter. Os embriões em E8.5 foram colhidas e coradas para PECAM para distinguir células do endocárdio e endoteliais de cardiomiócitos. Os embriões foram então afastada pelo Sca le eo coração foi fotografada. O miocárdio foi marcado por GFP devido à recombinação TnT-driven mediada por Cre do repórter mTmG, e o endocárdio foi marcado com PECAM (Figura 1A e Filme Suplementar 1). Os cardiomiócitos pode ser observada a uma resolução de célula única (Figura 1A). As estruturas do coração da parte trabalhada, como o ventrículo primitivo e OFT podem ser claramente identificados após a reconstrução 3D usando 3D resoftware de construção (Figura 1B e Suplementar Movie 2).
Imagiologia clones individuais do coração embrionário apuradas
Morfogénese cardíaca depende linhagem diferenciação cardíaca e organização de células individuais em toda a altura do coração 22, e, assim, é essencial para a imagem única diferenciação de células progenitoras cardíaco para diferentes tipos de células cardíacas e também a morfologia das células imagem com uma resolução de uma única célula. Para conseguir isso, Rosa26Cre ERT2 15 foi cruzado com R26R-Confetti 16, ea fêmea grávida foi tratadas por gavage com tamoxifeno em baixa concentração. Após 48 horas, o embrião foi colhido E9.5, e toda montagem corada para PECAM, em seguida, todo o coração foi fotografada. Descobrimos que havia apenas um aglomerado de células, localizada ao OFT, e este clone tinha o 8 células com basen a imagem reconstruída e secções consecutivas (Figuras 2A, 2B e 3) complementar do filme, indicando que estas células são derivadas de uma única célula progenitora. A morfologia celular e o comportamento celular, tais como a proliferação e migração celular pode ser inferida a partir da posição final das células (Figura 2A). Nós também aplicado o método cúbicos para limpar o coração embrionário em E9.5 e E10.5, e descobriu que, mesmo depois de apenas 24 horas de incubação com o reagente 1, os embriões foram subtilmente dissolvida e estrutura do tecido foi prejudicada (dados não apresentados ).
Imagiologia de pós-natal apagada e corações embrionárias final
Nós aplicado tanto Sca l e e cúbicos para limpar corações pós-natais. corações P2 com o genótipo de αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre é expressa especificamente em cardiomiócitos <sup> 17) foram apuradas com Sca l e para 48 horas, mas não exibir mais transparência do que os corações tratados com apenas PBS (dados não mostrados), indicando que Sca l e de compensação não é eficaz para corações pós-natais. Quando os corações P2 foram apuradas com reagente CUBIC 1 durante 48 horas, e reagente 2 durante 96 horas, eles eram muito mais transparente do que os corações compensados com o reagente de 1 para 48 horas e reagente 2 para 48 horas. A profundidade de imagem foi significativamente aumentada com 96 horas de reagente 2 de incubação (Filmes complementares 4 e 5), indicando que mais de incubação com os reagentes CÚBICAS promove a transparência e prevê um aumento da profundidade da imagem. A forma e o tamanho de cada um dos cardiomiócitos pode ser identificado pela membrana GFP localizada (Figura 3A), que pode ser usado para identificar a hipertrofia.
Nós também limpou NFATc1-Cre; Confetti (feminino Confetti conectado com Nfatc1Cre male) corações E17.5 (NFATc1-Cre é expressa em células cardíacas endocárdicos 19) com reagente de CUBIC 1 durante 48 horas e o reagente 2 durante 48 h. Os corações são transparentes, e esperava-se que as proteínas fluorescentes, incluindo GFP, YFP, PCP e RFP para rotular as células do endocárdio e suas células derivadas; No entanto, apenas GFP e YFP poderia ser trabalhada através de todo o coração (Figuras 3B, 3C e Filmes complementares 6 e 7), e o PCP e RFP não pôde ser detectada (dados não mostrados). A coloração para PECAM (Alexia Fluor 647) também não pôde ser detectada (dados não mostrados), sugerindo que o reagente CUBIC extingue o PCP, RFP e o anticorpo conjugado fluoróforo neste protocolo.
Figura 1:. Imaging o Sac / e limpou cardíaco embrionário (A) Uma opfatia tica de um coração E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) é mostrado. V: ventrículo; OFT: via de saída. (B) mostra a estrutura do coração reconstruído de 93 fatias consecutivos ópticos com uma profundidade total de 110,4 pM. Barra de escala = 20 um em A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A imagem latente clone único da SCA / e limpou cardíaco embrionário (A) Uma secção óptica de um clone de um coração E9.5 com o genótipo de ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. A seta aponta para uma protrusão celular de um cardiomiócito. (B) mostra o clone reconstruído na região do coração OFT E9.5 com 10 fatias ópticos e 36 uM profundidade total. Barra de escala = 20 um em A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3: Geração do pós-natal apuradas cúbica e corações embrionárias tardias (A) mostra uma secção óptica de um coração P2 com o genótipo de αMHC-Cre; mTmG; todas as secções ópticas são mostrados no filme suplementar 5. (B) mostra uma secção de um coração E17.5 com o genótipo de NFATc1-Cre; ROSA26-confetes. (C) Mostra a estrutura do coração reconstruído a partir de 106 fatias ópticos com uma profundidade total de 630 uM. A barra de escala = 20 mm em A e é 100 um de B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Filme Suplementar 1: Imaging o Sca le apuradas cardíaco embrionário (Clique direito a download) Filme 1 mostra secções ópticas de um Sca le tratada coração E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) a partir da superfície coração a luz do coração. A profundidade é 110,4 ^ m e há 93 fatias no total.
Filme Suplementar. 2: Imaging o Sca le apuradas cardíaco embrionário (Clique direito a download) Movie 2 mostra o retrato da superfície 3D do coração reconstruída no Movie 1, reconstruçâoted através do software de reconstrução 3D. marcas amarelas da expressão PECAM e etiquetas verdes todos os cardiomiócitos.
Filme Suplementar 3: Geração de um único clone do Sca le apuradas cardíaco embrionário (clique com o botão direito para baixar). Filme 3 mostra seções de um clone de um coração E9.5 com o genótipo de ROSA26-Cre ERT2.
Filme Suplementar 4: Imagiologia os corações pós-natal apuradas cúbicos (Clique direito a download). Filme 4 mostra seções de um coração CUBIC tratada P2 (& #945; MHC-Cre; mTmG) a partir da superfície do coração ao lúmen do coração. Este coração P2 foi liberado com o reagente CUBIC 1 durante 48 horas, e reagente CUBIC 2 durante 96 horas.
Filme Suplementar 5: imagiologia do coração pós-natal apuradas cúbicos (Clique direito a download). Filme 5 mostra um coração que foi liberado com o reagente CUBIC 1 para 48 horas e reagente CUBIC 2 para 48 horas. A profundidade é de 136 mm, com 6 mm por seção no filme 4 e a espessura é de 76 mm, com 6 mm por seção no filme 5.
Filme Suplementar 6: Imaging o CUBIC Embry tarde apuradascoração ONIC (Clique direito a download) Filme 6 mostra seções de um coração E17.5 tratada cúbicos (NFATc1-Cre; ROSA26-Confetti). a partir da superfície do coração a luz do coração. A profundidade é de 630 mm, com 6 mm por seção.
Filme Suplementar 7: Imaging o coração embrionário tarde apuradas cúbicos (Clique direito a download). Filme 7 mostra o retrato da superfície 3D do coração no filme 6, reconstruído através do software de reconstrução 3D.
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Discussion
O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remoção do sinal de fundo quando Imaging. Vários anticorpos, incluindo anticorpos contra PECAM, acetilado α-tubulina e β1 integrina foram examinados e todos foram detectados com sucesso (resultados não apresentados) 33. Isto demonstra que a integridade molecular, a integridade celular e compatibilidade antigénio não foram perturbados durante este processo de compensação.
Transferência do embrião / coração usando uma ampla pipeta de transferência boca (corte a ponta). Isto evita danos durante o manuseamento. A GFP / YFP / RFP / CFP padrão de expressão e número de clones devem ser cuidadosamente registadas no coração para determinar a dosagem apropriada para rotular um clone por coração ou quaisquer outros órgãos. Devido à baixa dose de tamoxifeno (10 ug / g), por vezes, o coração não contém quaisquer clones ou é difícil detectar quaisquer clones. Portanto, recomenda-se utilizar o saco vitelino para determinar se o embrião tem nenhum / YFP / RFP clones GFP / CFP.
O embrião ou do coração de fixação é uma etapa crítica, como o excesso de fixação irá resultar em um fundo alta, enquanto sub-fixação poderá resultar num fraco coloração. Recomenda-se para fixar todo o embrião E10.5-E8.5 durante 2 horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Enquanto que para embriões E11.5-E15.5, a recomendação é para isolar cuidadosamente o coração e corrigi-lo com PFA 4% durante 2 horas a RT. Depois de garantir a remover as camadas circunvizinhas o coração, se o processamento de todo o embrião, o embrião E13.5 E11.5- também pode ser fixada durante 3-4 horas à temperatura ambiente, mas que requer um maior tempo de eliminação nos tecidos. O E16.5-P1 (pós-natalDia 1) corações foram fixados durante 3-4 horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Ao fixar todo o embrião, o primeiro plano e membros posteriores devem ser removidos, pois prejudicam a imagem do coração.
As amostras devem ser tratados com cúbica e Sca le em frascos de cintilação para minimizar a secagem da amostra. Temos observado melhor compensação de amostras com o método de compensação cúbica de tecido, a 37 ° C, enquanto que a CEC le compensação é optimamente realizada a 4 ° C. Depois de imagem, as amostras podem ser armazenadas a curto prazo em CUBIC-2 ou Sca le 70. As amostras devem ser sempre coberto com papel alumínio para evitar o branqueamento de fluorescência.
tecidos e órgãos do embrião tem menos de lípidos e deposição de matriz extracelular, o que resulta em menos tempo de eliminação. Por outro lado, eles são mais vulneráveis aos reagentes de compensação. Os reagentes de compensação pode afectar a integridade da estrutura do tecido e antigénio, que resulta na têmpera do PCP, RFP e conju anticorpofluoróforo fechado. Portanto, períodos de fixação mais longos podem impedir a extinção. A extinção das proteínas fluorescentes pode ser também devido a sua sensibilidade a substâncias químicas e de pH tal como anteriormente relatado 34. Outras receitas químicas, pH, fixadores, eo comprimento de incubação devem ser exploradas para minimizar a extinção das proteínas fluorescentes.
O método de transparentizing órgão todo ou compensação de tecidos revolucionou imagens 3D volumétrica. O método de imagem anterior para a morfogénese cardíaca, que envolveu o manual 2D ou 3D a reconstrução de secções em série, é demorada e exigente instrumento 5,6. Microscopia episcopic alta resolução (HREM) em conjunto com a modelagem 3D pode ser aplicada ao estudo da morfogénese do coração do rato e proporciona excelente descrição anatómica da arquitectura trabecular no desenvolvimento de embrião de rato 35. No entanto, HREM não permite a identificação de fluorescélulas marcadas proteína ENT ou marcados com anticorpo de células do resto das células 35. Usando o protocolo atual, com o mínimo de esforço e eficácia de alto custo, que têm preservado com sucesso os sinais fluorescentes no coração embrionário usando Sca le ou métodos de compensação cúbica de tecido (Figuras 1 - 3). Combinado com uma dose baixa (10? G / g) de tamoxifeno para induzir a eventos de recombinação Cre e gerar alguns clones dentro de todo o embrião e no coração, este sistema pode ser usado para localizar e estudar diferenciação de células progenitoras cardíaca único e comportamentos celulares em in vivo (Figura 2A) 33. Além disso, combinado com deleção do gene Cre mediada ou a sobre-expressão e rotulagem única célula Cre mediada, este sistema de imagem pode ser aplicado para estudar a perda genética da função ou ganho de função na diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular, durante a morfogénese cardíaca, e, portanto, fornece uma robusta ferramenta para stUdy a etiologia de defeitos cardíacos congênitos.
Os dois tecidos sistemas de compensação Sca / e e cúbicas utilizado neste estudo mostrou eficiências diferentes de compensação, o que diferencia ainda mais os sistemas com base na idade embrionária, a espessura do tecido e da duração do tempo de compensação de tecidos. Para a fase inicial de embriões E9.5-E10.5, o Sca / e sistema não só rendeu o tecido claro, mas também protegia a morfologia do embrião e preservado os sinais fluorescentes, enquanto o tratamento CUBIC resultou em dissolução embrião. Este pode ser o resultado de aminoálcoois adicional e uma maior concentração de Triton X-100 nas soluções CÚBICAS 8. Para corações mais velhos, a Sca / e sistema falhou para limpar o tecido completamente, mesmo com um tempo de incubação. A solução compensação CUBIC tornou o mais velho tecido transparente (Figura 3). No entanto, o aumento do tempo de incubação resultou em sinais mais fracos e GFP endógena única protegida, enquanto RFP, CFP e sinais de anticorpo conjugadoperdidos. Por esta razão, uma receita mais optimizada dos reagentes compensadores e melhor tempo de incubação seria necessário para volumetricamente corações ou órgãos de imagem com um espectro maior de marcadores fluorescentes.
Este estudo demonstrou que se pode rotular, rastrear e imagens simples clones cardíacos em combinação com toda uma coloração montagem de endocárdio / endoteliais PECAM marcador de células do coração em desenvolvimento. Toda a montagem de coloração DAPI PECAM e neste sistema, não só ajuda a identificar os tipos de células e a morfologia das células de células marcadas dentro de um coração, mas também permite o estudo do padrão clonal, a migração e o comportamento durante a morfogénese cardíaca. Na Figura 2A observou-se um clone com 8 células em TCA. Utilizando o número de células presente neste clone com referência ao tempo de rotulagem, a taxa de proliferação de células pode ser facilmente calculada. Em outro estudo utilizando este mesmo sistema identificamos o padrão de divisão celular orientado e migrpadrão ção de um único cardiomiócitos durante o processo de trabeculação 33. A aplicação deste protocolo para estudar os efeitos da perda genética de função ou ganho de função espaço-temporalmente na diferenciação de células progenitoras cardíacas marcado, padrão clonal e comportamento celular é viável, e vai ajudar nos estudos sobre a etiologia de defeitos cardíacos congênitos em genética e nível molecular num contexto 3D. Além disso, este protocolo pode ser aplicada ao estudo de morfogénese em outros sistemas orgânicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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