Abstract
全心臓レベルで単一のクローン追跡および分析は、心臓の開発中に、心臓前駆細胞の挙動および分化を決定し、正常と異常な心臓の形態形成の細胞および分子基盤の研究を可能にすることができます。レトロスペクティブ単一クローン解析の最近の新技術は、実現可能な単一細胞の解像度で心臓の形態形成の研究を行います。しかし、撮像深さ、心臓の組織の不透明性と光散乱は単細胞解像度で妨げる全心臓イメージングを増加させます。これらの障害を克服するために、照明および検出の両方のための透明性の高い心をレンダリングすることができます全胚清算システムが開発されなければなりません。幸いなことに、ここ数年では、このようなCLARITYなどの全生物の決済システム、のSca ル 、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、DBE、BABBとPACTのための多くの方法が報告されています。このラボでは、カードの細胞および分子メカニズムに興味がありますIACの形態形成。最近、我々はROSA26-CreをERT2を経由してトレース単一細胞系統を確立し、ROSA26-紙吹雪システムまばらにラベル細胞に心臓の開発中に。私たちは、心の内の画像の単一クローンにホールマウント染色と組み合わせて胚をクリアするためのSca ルとCUBIC（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を含むいくつかの胚全体-クリアする方法論を適応しました。心臓が正常に単一細胞の解像度で画像化しました。私たちは、SCA ルは、胚の心をクリアすることができることを発見しましたが、組織を効果的に溶解することによって胚の心をCUBICは、生後の心をクリアすることができますが、生後の心をクリアしますが、損害賠償はできません。ここに記載される方法は、順番に、先天性心臓欠陥の細胞および分子基盤を明らかにすることができ、心臓の形態形成、間に単一クローンの解像度での遺伝子機能の研究を可能にします。
Introduction
心臓の形態形成は、心臓の別個のセクタに心臓前駆細胞の4つの異なるタイプの時空間組織を必要とし、また、機能的な心1,2を形成するために、このプロセスを調整するために、複数の遺伝子制御ネットワークを必要とするシーケンシャルイベントです。心臓の仕様、分化、パターニング、及びチャンバ成熟は心原性転写因子3によって規制されています。心臓前駆細胞の遺伝的変異またはこれらの因子の転写後収差は、胚性致死または先天性心臓欠陥（CHD）4のいずれかになる可能性があります。心臓の形態形成の研究では、3次元（3D）に固有の構造的な詳細を理解する必要がありますし、心臓の開発中にトレース単一ラベルされた心臓前駆細胞系譜は、心臓の形態形成の理解を促進します。高解像度の部分ベース断層撮影法の数が目に開発されています画像臓器構造5,6に数十年の過去の電子。しかしながら、これらの方法は高価で特殊な機器、広範な労働力を必要とし、最終的な体積再構成された画像7,8における単細胞解像度で詳細な構造組織を欠いています。
単一細胞レベルでの3Dボリュームイメージングは、 生体 7 に前駆細胞の分化および細胞の挙動を研究するための手段を提供します。しかし、組織の光散乱が深く、無傷の心の中の3Dでの細胞や構造を画像化する主要な障害となっています。脂質は、光散乱の主要な供給源であり、脂質および/または脂質およびその周辺地域との間の屈折率差の調整の除去は、組織透明8を高めるための潜在的なアプローチです。過去数年間で、組織のクリア方法の数は、組織の不透明度と光の散乱を低減しており、開発されたBABB（ベンジルアルコール、ベンジルbenzoatなどEの混合物）とDBE（テトラヒドロフラン、ジベンジル）;しかし、これらの方法では、蛍光消光が問題8-10まま。溶媒としては、例えばSeeDB（フルクトース/チオグリセロール）と3DISCO（ジクロロメタン/ジベンジル）などの親水性の方法を、ベースの蛍光シグナルを維持するが、7,8,11透明な臓器全体をレンダリングしません。比較では、CLARITY組織クリア方法は、透明な臓器をレンダリングするが、それはまた、7,13を埋め込むヒドロゲルを必要とする、PACT（パッシブ明確にする技術が）同じように、脂質8,12を除去するために、特殊な電気泳動装置を必要とします。利用可能なすべての組織クリアする方法に関する詳細情報については、 ら 、リチャードソンとリヒトマンの表1を参照してください。7。
2011年に、ハマらは偶然マウス脳と胚transparをレンダリングする親水性混合物」のSca ル 」（尿素、グリセロールおよびTriton X-100混合物）を発見しましたENT完全に標識されたクローン14からの蛍光シグナルを維持しながら。これは、無傷の数ミリメートルの深さで脳や細胞内の解像度でニューロン集団と突起の大規模な再構成の撮像を可能にします。須崎ら。さらにクリア時間を減少させ、リン脂質可溶化を増加し、多色蛍光イメージング8に許可された組織のクリア方法は、アミノアルコールを添加することにより、のSca ルを改善し、「CUBIC」（クリア、遮るもののない脳画像カクテルやコンピュータ解析）を開発しました。本研究では、心臓の間に心の中のSca ルの利点とCUBIC組織決済技術と高解像度の3D光学切片、個々のクローンを取ることはRosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、cTnTの-のCreを使用して追跡しました18、 NFATC1-Creを 19、とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウス系統。ホールマウント染色（WMS）メソッドの組み合わせは、以前に21,22、さらに標識されたクローン中の他のタンパク質の染色のためにと3Dボリュームコンテキストで彼らの行動の研究のために許可された組織のクリア方法とを開発しました。組織のクリア及びWMSの組合せは、心臓の開発中の異なる遺伝子およびタンパク質の役割のよりよい理解を可能にし、先天性心臓欠陥の病因。このプロトコルは、開発中に、他の前駆細胞の分化、細胞の挙動、および臓器形態形成事象を研究するために適用することができます。
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Protocol
全ての動物実験は、アルバニー医科大学で制度動物実験委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って行いました。
1.ソリューションの準備
注：Rosa26Cre ERT2 15、R26R-紙ふぶき 16、αMHC-Creを17、 とのRosa26-mTmG（mTmG）20マウスのラインが商業的に購入したcTnTの-Creを 18は、アラバマ大学の博士交通からの贈り物だったのNFATc1-Creを 。医学19のアルバートアインシュタイン大学の博士ビン周からの贈り物でした。マウスは、二国間の開胸、断頭または頸椎脱臼により死亡検証の物理的手段に続いて、少なくとも60秒間密閉チャンバーに二酸化炭素吸入によって安楽死させました。
- タモキシフェンを準備します。ヒマワリ種子大井の10ミリリットルにタモキシフェン10mgを溶かしリットル。 -20℃で完全に溶解したら、アリコートとストア。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 Na 2 HPO 4（1.41960グラム）、KH 2 PO 4（0.24496グラム）、塩化ナトリウム（8.0669グラム）及び蒸留水1L中のKCl（0.20129グラム）を溶解し、pHを7.4に調整します。
- PBSTを調製0.1％のTween-20溶液をPBS中でPBS 100mlのTween-20を100μlの溶解させることによって。
- ブロッキングバッファーを準備します。 0.2％のTween-20を含有するPBST 100mlにBSAを3gを溶解し、3％ウシ血清アルブミン（BSA）ブロッキング溶液を作ります。
- CUBIC-1（試薬1）を準備します。 25重量％の尿素、25重量％のN、N、N '、N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンとのdH 2 O中15重量％のTriton X-100を混合
- CUBIC-2（試薬2）を準備します。 50重量％のショ糖、25重量％の尿素、10重量％の2,2 '、2' 'ミックス- nitrilotriethanolおよび0.1％（Vし/ V）のdH 2 O中のトリトンX-100
- Sca ル A2を準備します。4 M尿素、w / vグリセロール10％および0.1％のw / vのトリトンX-10dH 2 O中0 7.7にpHを調整します。
- Sca ルの B4を準備しますのdH 2 Oで8 M尿素およびワット/ vのトリトンX-100を0.1％ 8.7にpHを調整します。
- 4 M尿素、70％のw / vのグリセロールおよび0.1％W / VトリトンX-100 の dH 2 O中：のSca ル 70を準備します
2.タモキシフェン誘導、胚の単離と固定
- タモキシフェン誘導および胚の単離
- （R26Cre ERT2雄マウスで塞が）女性R26Cre ERT2紙吹雪マウスは、胚の発達日E7.75 33でタモキシフェンを10μg/ gの湾曲した栄養管を使用して、承認されたプロトコル（ACUP 13から12007）、強制飼養。胎生9.5（E9.5）またはE10.5では、CO 2および頸椎脱臼と雌マウスを安楽死させます。
- マウスの死亡確認後（セクション1を参照してください。注）、はさみでマウス腹腔を開き、子宮角を解剖、ハサミやピンセットの助けを借りて卵管層を除去し、再子宮管23,24から胚をリース。
- PBS（pHは7.4）を含有するペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡下では、ピンセットの助けを借りて、非胚層（絨毛膜、卵黄嚢と羊膜）を削除。
- 以前に22を報告したようにピンセットやハサミを使用して、遺伝子型決定のための雌マウスと胚の尾のサンプルを収集します。プラスチックピペットを用いて、1×PBSの1ミリリットルを含む48ウェルプレートのウェルに各胚を移します。
- 蛍光顕微鏡下では、カメラ付き倒立顕微鏡を介して、GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別します。ピール離れてピンセットを用いて、心膜とGFP / RFP / CFPフィルターと心の両面上の蛍光クローンの数を決定するために、湾曲したピンセットの助けを借りて心/胚を回転させます。いいえカットは必要ありません。
- GFP / RFP / CFP陽性の胚を識別した後、すぐに目で1×PBSで2回（各2分）の胚を洗います室温（RT）でプレートシェーカー上で電子48ウェルプレート。これは、過剰な血液を除去します。
- RTで4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して、胚/胎児心を修正しました。定着時間は、胚の年齢や組織のサイズによって異なります。 E9.5室温で2時間の胚を修正。後期胚の段階の胚でも生後心臓のために24時間まで延長することができ、より長い定着時間を必要とします。
注意：パラホルムアルデヒドは毒性があり、皮膚、目や粘膜との接触を避けます。 - 固定後、室温でプレートシェーカー上で二回（各10分）1×PBSで48ウェルプレートに胚/心を洗います。これは、胚/心臓から過剰PFAを削除します。胚はその後さらにホールマウント染色および組織をクリアするために処理されます。
3.ホールマウント染色
注：次のようにPFA固定後胚/心臓が全体のマウント染色に供されます。
- 1メートルを使用して、48ウェルプレートに胚/心を透過性RTでプレートシェーカー上で2時間、0.1％PBSTのリットル。
- 透過処理に続いて、4ºCでプレートシェーカー上で2時間または一晩、ブロッキング緩衝液1mlに胚/心を浸します。
- 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液0.3ミリリットルで：（100 1）で希釈し、内皮細胞特異的抗体PECAM（CD31）に胚/心を浸し。
- プレートシェーカー上で室温でPBSTを5回、30分ごとを使用して胚/心を洗ってください。これは、組織からの過剰非特異的結合した一次抗体を除去します。
- 4ºCでプレートシェーカー上で48時間、ブロッキング緩衝液1ミリリットル中：（千1）で希釈し、アレクサフルオロ647ヤギ抗ラット二次抗体で胚/心を浸します。
- 二次抗体を洗浄する手順を繰り返し3.4。
- プレートシェーカー上で室温で1時間、4％PFAで胚/心を後固定し、PBSで5分間、それぞれで二回洗浄します。
- コンセントでPBSTで希釈した核染色4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（と胚/心を染色RTでプレートシェーカー上で10分間、0.01 mg / mlで）の比。それぞれ5分の2回のPBS洗浄に従ってください。
4.胚/のSCA リットルの eまたはキュービック法とハートのクリア
注：ホールマウント染色した後、胚/心臓がのSca ルまたはCUBIC組織のクリア方法のいずれかに供されます。方法の選択は、組織のサイズおよび胚の年齢に依存します。 E11.5以前の年齢の胚のための、のSCA リットル電子組織のクリア方法を使用して、古い胚または出生後の心のためにCUBIC組織クリア方法が好ましいが。
- 規模組織のクリア方法
- 時折穏やかに4℃で48時間（手で）振とうしながら（アルミホイルに包んで）シンチレーションバイアル中のSCA リットル電子 A2溶液1mlと胚/心をインキュベートします。
- Sca リットル電子のA2のインキュベーションの後、時折穏やかanot振とう同じバイアル中で4℃でのSCA リットル電子B4の溶液1 mLで胚/心をインキュベート彼女の48時間。
- 時折穏やかに振とうしながら4℃で1ミリリットルのSCA リットル電子 70と別の48時間胚/心をインキュベートします。 90％グリセロールを使用してマウント胚（セクション5.1を参照）。
- CUBIC組織のクリア方法
- 全胚/心CUBICクリアするため、時折穏やかに37ºC7で48時間振とうCUBIC-1の1ミリリットル中の各胚/心を浸します。 48時間後、新鮮なCUBIC試薬1の同じ体積で溶液を交換し、時折手で振盪しながら37℃でさらに48時間、サンプルをインキュベートします。
- 穏やかに手で振盪しながら室温で1×PBSで数回CUBIC-1処置した心臓/胚を洗ってください。これは、過剰CUBIC-1溶液を除去します。
- PBSでCUBIC-1を洗浄した後、時折穏やかに手で振盪しながら37ºCで48時間CUBIC-2溶液（胚/心あたり1グラム）で胚/心を浸します。これは、グリセロールを用いた実装胚/心を次の（第5節参照します0.2）。
5.サンプル取付け・イメージング
注：のSCA リットル電子 70またはCUBIC-2溶液中でクリア胚または器官がそれぞれ、イメージング媒体としてのスケール70とCUBIC-2溶液を用いて直接画像化することができます。しかし、試薬をクリアする胚サンプルの脆弱性を考慮すると、サンプルはすぐに画像化されたが、長期的に保存されていない場合、以下のプロトコルに従って、90％グリセロール中でサンプルを格納。
- 直接のSca LEが撮像されるまで4℃で90％グリセロール、店舗の1mlのサンプルをクリア浸します。
- 二回1×PBSで5分間ずつCUBIC処理サンプルを洗浄し、順次30分間、30％、50％、70％、90％グリセロール溶液をそれぞれ1 mlのサンプルをインキュベートします。
- イメージングのために、2光子機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて、90％のグリセロールおよび画像クローンの最小量のガラス底ペトリ皿に試料を移します。
- 10X / 0.3 NA、25X / 0.8 NAの浸漬、または40X / 1.2 NA水矯正対物レンズと画像グリセロールで心臓や胚を。サファイアカメレオンレーザー：コヒーレントチタンから2光子励起を用いた画像DAPI。顕微鏡対物レンズの選択は光学シート蛍光顕微鏡を利用することができ、超解像のために、例えば 、実験の目的に依存するであろう。
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Representative Results
クリア胚の心臓を画像化
脊椎動物の心臓の形成は時空間的に調節形態形成のプロセスであり、4つの異なるソース1からの組織および前駆細胞の分化に依存します。心臓三日月の最初の心臓領域からの細胞は、線形心管を形成するために、腹側正中線に向かって折ります。最初に最初の心臓領域にdorsomediallyに存在する第二の心臓フィールドからの細胞は、その後、彼らは線形心管の既存の足場に移行するところから、咽頭および内臓中胚葉に移行します。第二の心臓野の細胞は右心室、流出路（OFT）心筋に、いくつかの心内膜25-28に貢献していきます。心臓の神経堤細胞（CNCC）、postotic rhombomeres 6、図7、図8からの発信は、尾側咽頭に移行し、signifiに貢献しますOFTにおける平滑筋層と心内膜クッションにcantly。彼らはまた、大動脈肺動脈中隔29,30の形成に寄与しています。第四の人口は、プロ心外膜臓器（PEO）由来の心外膜の細胞で構成され、線維芽細胞、平滑筋細胞、および潜在的に他の心臓の細胞型31に寄与する。心外膜は、冠動脈血管の発達、心臓の成長と形態形成21を調節します 。
心臓の形態形成についての最も重要な概念は、心臓発生、異常な細胞移動の際に/ 4前駆細胞集団の分化が奇形や先天性心臓欠陥出生欠陥の数1原因は世界である4,22,32を 、をもたらすことがあります。細胞および分子レベルでの心臓の形態形成のメカニズムを決定することでCHDの診断および潜在的な治療法を改善に向けた必須の工程です。したがって、単一セルの分解能で心臓全体レベルでの心臓の形態形成のプロセスイメージに重要です。これを達成するために、我々は、特にmTmGレポーター線と心筋細胞18内で発現され、心臓特異的トロポニンT（cTnTの）の制御下のCreラインを交配することによって心筋細胞を標識しました。 E8.5での胚を心筋から心内膜および内皮細胞を区別するPECAMのために採取し、染色しました。胚はその後のSca ルでクリアし、心臓が画像化しました。心筋が原因mTmGレポーターのcTnTの主導のCre媒介組換えにGFPによって標識し、そして心内膜は、PECAM（ 図1Aおよび補足ムービー1）で標識しました。心筋細胞は、単細胞の解像度（ 図1A）で観察することができます。このような原始的な心室とOFTとして画像化された部分の心臓構造は、明らかに3D再使用して3D再構成した後に識別することができます建設ソフトウェア（ 図1Bおよび補足ムービー2）。
クリア胚心臓の単一のクローンをイメージング
心臓の形態形成は、心臓全体レベル22で心臓系譜分化および個々の細胞組織に依存し、従って、それは、異なる心臓細胞型への画像の単一の心臓前駆細胞の分化に必須であり、単細胞の解像度で、画像の細胞形態へ。それを達成するために、Rosa26Cre ERT2 15は、R26R- 紙吹雪 16と交配し、妊娠中の女性は、低濃度のタモキシフェンで強制経口投与しました。 48時間後、胚はE9.5で収穫し、全体PECAMについて染色マウントしてから、心臓全体を画像化しました。私たちは、OFTにローカライズされ、細胞の1つのクラスタのみがあったことが判明し、このクローンは、8個の細胞ベースのOを持っていました再構成された画像と、これらの細胞は、単一の前駆細胞に由来することを示す連続した切片（ 図2A、2Bおよび補足動画3）、N。このような細胞増殖や遊走などの細胞形態および細胞挙動は、細胞（ 図2A）の最終的なポジショニングから推測することができます。また、データは示されていない（E9.5とE10.5で胚の心をクリアするためにキュービック法を適用し、さらに試薬1とのインキュベーションのわずか24時間後に、胚が微妙に溶解し、組織構造に悪影響を与えることを見出しました）。
クリア生後後期胚の心のイメージング
私たちは、出生後の心をクリアするためのSCA リットルeおよびCUBICの両方を適用します。 αMHC-Creをの遺伝子型を持つP2の心。 mTmGは（αMHC-Creをを具体的に心筋細胞で発現されています<SUP> 17）は、48時間のSCA リットルeでクリアされたが、のSca リットル電子決済が出生後の心のために有効ではないことを示す、PBSで処置した心臓のみ（データは示していない）よりも、それ以上の透明性を示しませんでした。 P2の心臓を96時間CUBIC 48時間のための試薬1、及び試薬2でクリアしたところ、48時間、48時間および試薬2用試薬1でクリア心よりもはるかに透明でした。撮像深度が大きくキュービック試薬とより長いインキュベーションは、透明性を促進し、撮像深さの増加をもたらすことを示し、試薬2インキュベーションの96時間（ 補足映画4および5）で増加しました。各心筋細胞の形状と大きさが肥大を同定するために使用することができ、膜局在化GFP（ 図3A）によって同定することができます。
Nfので栓をコンフェッティ （紙吹雪の女性、我々はまた、NFATC1-Creをクリアatc1Cre男性）E17.5の心は（NFATC1-Creを48時間と48時間のための試薬2用CUBIC試薬の1心臓心内膜細胞19）で表現されます。心は透明であり、およびGFP、YFP、CFPおよびRFPを含む蛍光タンパク質は、心内膜細胞およびそれら由来の細胞を標識するために期待されました。しかしながら、GFPおよびYFPのみが心臓全体（ 図3B、3Cおよび補足映画6,7）を介して撮像することができ、CFPおよびRFP（データは図示せず）を検出することができませんでした。 PECAM（アレクシアフルーア647）のための染色もCUBIC試薬はCFP、RFPと、このプロトコルにおける抗体共役蛍光団を消光することを示唆している、（データは示していない）を検出することができませんでした。
図1： サック/ eは、胚の心をクリアイメージング （A）OneオペアンプE8.75ハート（cTnTの-Creを; mTmG）のticalスライスが示されています。 V：心室; OFT：流出路。 （B）は 110.4ミクロンの全深さを持つ93個の連続光学スライスの再構成された心臓の構造を表示します。 A.におけるスケールバー=20μmの この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：のSca / Eの単一のクローンをイメージングは、胚の心をクリア （A）ROSA26-CreをERT2の遺伝子型とE9.5の心からのクローンの一つ光学部;。 ROSA26-紙吹雪。心筋細胞の細胞突起に矢印ポイント。 （B）は 10光学スライスと36μmの全深さとE9.5心臓のOFT地域で再構成されたクローンを表示します。 A.におけるスケールバー=20μmの この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図3：CUBICクリア生後後期胚の心をイメージング （A）は αMHC-Creをの遺伝子型を持つP2の心の1光学部を示している。mTmGを。 ROSA26-紙吹雪、光学部が補足ムービー5（B）に示されているのは全てのNFATc1-Creをの遺伝子型を持つE17.5心臓の一つのセクションを表示します。 （C）は、630ミクロンの総深さ106光学スライスから再構成された心臓の構造を示しています。 Aにおける=20μmのスケールバーとBには100μmである。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。 補足ムービー1：のSca ルは、 胚の心をクリア イメージング （右クリックしてダウンロード） ;心臓内腔に心臓表面からムービー1は、SCA ルの光学切片はE8.75ハート（mTmG cTnTの-Creを）で処理を示しています。深さは110.4μmであり、合計で93のスライスがあります。
補足ムービー2：のSca ルの イメージングは、 胚の心をクリアし （右クリックしてダウンロード）ムービー2ムービー1で再構成された心臓の3D表面の画像を示し、reconstruc3D再構築ソフトウェアを介して、テッド。黄色はPECAMの発現と緑色のラベルのすべての心筋細胞をマークします。
補足ムービー3：のSca ル の単一のクローンをイメージングは、 胚の心をクリアし （右クリックしてダウンロード）。ムービー3は、ROSA26-CreをERT2の遺伝子型とE9.5の心臓からクローンのセクションを示しています。
補足ムービー4：CUBICクリア生後心 （右クリックしてダウンロードを） イメージングムービー4はCUBIC扱わP2ハート（＆＃のセクションを示しています945; MHC-Creを; mTmG）心臓表面から心臓内腔へ。このP2の心臓は48時間CUBIC試薬1、および96時間のためCUBIC試薬2でクリアしました。
補足ムービー5：CUBICクリア出生後の心のイメージング （右クリックしてダウンロード）ムービー5は、48時間および48時間2 CUBIC試薬について1 CUBIC試薬でクリアされた心を示しています。深さは、映画の4セクションごとに6ミクロンと136ミクロンであり、厚さは、映画5内のセクションごとに6ミクロンと76ミクロンです。
補足ムービー6：CUBICクリア後半エンブリーのイメージング。心臓表面から心臓内腔に、onic心臓（右クリックしてダウンロード）映画6はCUBIC扱わE17.5ハート（ROSA26-紙ふぶきNFATC1-CRE）のセクションを示しています。深さは、セクションごとに6ミクロンと630ミクロンです。
補足ムービー7：CUBICクリア後期胚の心臓のイメージング （右クリックしてダウンロード）。ムービー7は、3D再構築ソフトウェアを介して再構成されたムービー6における心臓の3D表面の画像を示しています。
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Discussion
胚の分離は非常に重要なステップです。 E9.5胚ので細心の注意が単離中の胚/心臓の構造に損傷を与えないように注意する必要があり、サイズは非常に壊れやすいと小さいです。胚全体を撮像する場合、胚/心臓を包む非胚余分な層は、特に慎重に除去しなければなりません。これは、胚組織の奥深く抗体および清算混合物の浸透を可能にし、また、撮像する際のバックグラウンド信号を除去するのに役立ちます。 PECAMに対する抗体を含む複数の抗体、アセチル化αチューブリン及びインテグリンβ1を試験し、すべてが正常に検出された（データは示していない）33。これは、分子の完全性は、細胞の完全性および抗原互換性がこの決済処理中に破壊されなかったことを示しています。
広口トランスファーピペット（先端をカット）を使用して、胚/心を転送します。これは、取り扱い中の損傷を避けることができます。 GFP / YFP / RFP / CFP発現パターンとnクローンのアンバーは、慎重に1心あたりのクローンまたは任意の他の臓器にラベルを付けるための適切な投与量を決定するために、心臓に記録されるべきです。タモキシフェン（10μgの/ g）での低用量に、時には心が任意のクローンが含まれているか、いずれかのクローンを検出することは困難であるしません。したがって、胚は、任意のGFP / YFP / RFP / CFPクローンを持っているかどうかを判断するために卵黄嚢を使用することをお勧めします。
胚や心臓の固定がover-固定アンダー固定貧しい染色になりながら高いバックグラウンドになりますように、重要なステップです。プレートシェーカー上で室温で2時間、E8.5-E10.5胚全体を修正することをお勧めします。 E11.5-E15.5胚のためのが、推奨は慎重に心を分離し、室温で2時間、4％PFAでそれを修正することです。全胚を処理した場合、心臓の周囲の層を除去するために確保した後、E11.5- E13.5胚はまた、室温で3-4時間、固定することができますが、それは増加した組織のクリア時間を必要とします。 E16.5-P1（生後1日目）の心は、プレートシェーカー上で室温で3-4時間、固定されています。全胚を固定する場合、彼らは心臓イメージングを妨げるとして、前部と後肢を削除する必要があります。
サンプルは、サンプルの乾燥を最小限にするためにシンチレーションバイアルにCUBICとのSca ルで処理する必要があります。 Sca ルクリアを最適に4°Cで行われている間私たちは、37℃でCUBIC組織クリア方法とサンプルのより良いクリアを観察しています。イメージング後、サンプルを、立方2のSca ル 70の短期的に格納することができます。試料は常に蛍光の退色を防止するためにアルミホイルで覆われるべきです。
胚の組織および器官が少なく、脂質とより少ないクリア時間をもたらす細胞外マトリックスの沈着を有します。一方、彼らはクリア試薬に対してより脆弱です。クリアリング試薬は、CFP、RFPおよび抗体conjuの消光をもたらし、組織構造と抗原の完全性に影響を与える可能性がありますゲーテッド蛍光団。したがって、より長い固定時間が消光を防ぐことがあります。以前に34を報告したように蛍光タンパク質の消光も化学物質及びpHに対する感受性が原因である可能性があります。他の化学レシピ、pHは、固定剤、およびインキュベーションの長さは、蛍光タンパク質の消光を最小限にするために検討されるべきです。
臓器全体の透明または組織のクリアリングの方法は、体積3Dイメージングに革命をもたらしました。連続切片の手動2Dまたは3D再構成を含んだ心臓の形態形成のための以前の画像化方法は、時間がかかり、機器5,6を要求しています。 3Dモデリングと一緒に高解像度落射顕微鏡（HREM）は、マウスの心臓の形態形成の研究に適用され、発展途上のマウス胚35における小柱アーキテクチャの優れた解剖学的な説明のために提供することができます。しかし、HREMはfluorescの識別を許可していません耳鼻咽喉科タンパク質標識された細胞または細胞35の残りの部分からの抗体染色された細胞。最小限の労力と高い費用対効果で、現在のプロトコルを使用して、我々は成功したSca ルまたはメソッド（ - 3 図1）をクリアCUBIC組織を用いて、胚中心に蛍光シグナルを保存しています。 Cre組換え事象を誘導し、全胚の内部と心のいくつかのクローンを生成するために、タモキシフェンの低用量（10μgの/グラム）と組み合わせることで、このシステムは、単一の心臓前駆細胞の分化と細胞の挙動を追跡し、研究するために使用することができます生体内 （ 図2A）33。さらに、Creを介した遺伝子欠失または過剰発現とのCre媒介単一細胞標識と組み合わせ、この撮像システムは、心臓の形態形成の間、前駆細胞の分化および細胞挙動の関数の関数または獲得の遺伝的損失を研究するために適用され、従って、堅牢を提供することができますセントへツール先天性心臓欠陥の病因をUDY。
本研究で使用される2つの組織決済システムのSca / eとキュービックは、組織のクリア時間の胚の年齢、組織の厚さおよび持続時間に基づいてシステムを区別する異なる決済効率を示しました。初期段階の胚のE9.5-E10.5については、のSca / Eシステムは、組織が明確でレンダリングされていないだけでなく、CUBIC治療は胚の溶解をもたらしながら、胚の形態を保護し、蛍光シグナルを保存しました。これは、追加のアミノアルコールとCUBICソリューション8におけるトリトンX-100のより高い濃度の結果である可能性があります。古い心のために、のSca / Eシステムは、さらに長いインキュベーション時間で組織を完全に消去することができませんでした。 CUBIC決済ソリューションは、（ 図3）古い組織が明確にレンダリング。しかし、増加したインキュベーション時間は、弱い信号のみ保護内在性GFPをもたらしたRFP、CFPおよび抗体コンジュゲート信号失われました。このため、透明試薬とより良好なインキュベーション時間のより最適化されたレシピは、蛍光標識の高いスペクトルと画像心臓または器官を体積するために必要とされます。
この研究では、一現像心臓の内皮/心内膜細胞マーカーPECAMのホールマウント染色と組み合わせて、トレースを標識し、画像の単一の心臓のクローンができることを実証しました。このシステムではPECAMおよびDAPIのホールマウント染色だけでなく、心の中標識細胞の細胞型および細胞形態を識別するのに役立ちますが、また心臓の形態形成の間にクローンパターン、移動および行動の研究を可能にします。 図2Aにおいて、我々は、OFTで8細胞とクローンを観察しました。標識時間を参照して、このクローン中の細胞に存在する数を使用して、細胞の増殖速度を容易に算出することができます。この同じシステムを使用して、別の研究では、配向細胞分裂パターンとMIGRを同定しました肉柱形成工程33の間に単一心筋細胞のエーションパターン。時空ラベルされた心臓前駆細胞の分化に機能または機能の獲得の遺伝的損失の影響を研究するために、このプロトコルのアプリケーションは、クローンパターンと細胞挙動が実現可能である、と遺伝的に先天性心臓欠陥の病因の研究に役立つだろうし、 3Dコンテキスト内の分子レベル。また、このプロトコルは、他の器官系において形態形成の研究に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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