Summary
الانقسام هو العملية التنموية التي تتشكل الأمشاج من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي، وهما جولات متعاقبة من العزل الصبغي. يمكن دراسة الانقسام الاختزالي الثدييات باستخدام تقنية لإعداد هوامش كروموسوم هو. هنا، علينا أن نظهر أسلوب إعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس.
Abstract
الانقسام الاختزالي الثدييات هو عملية دينامية التنمية التي تحدث في الخلايا الجرثومية ويمكن دراستها وتتميز. استخدام أسلوب الانتشار النوى على سطح الشرائح (بدلاً من إفلاتها من ارتفاع)، نبدي أسلوب أمثل على الماوس سبيرماتوسيتيس الذي كان أول من وصف في عام 1997. وتستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع في مختبرات لدراسة الانقسام الاختزالي الثدييات نظراً لأنه ينتج عدد كبير أنوية ذات جودة عالية تمر بالمراحل الفرعية للطور الأول "سيمينيفيروس أولاً" الأنابيب وتوضع أولاً في محلول ناقص التوتر إلى تضخم سبيرماتوسيتيس. ثم يتم إطلاق سبيرماتوسيتيس في حل سكروز لإنشاء تعليق خلية، وتنتشر الأنوية على الشرائح الزجاجية مثبت بالدماء. وعقب إيمونوستينينج، يمكن دراسة مجموعة متنوعة بروتينات ذات صلة وثيقة بالعمليات هو. على سبيل المثال، يمكن بسهولة تصور بروتينات المجمع سينابتونيمال، وهيكل ثلاثي الذي يربط بين المحاور/النوى كروموسوم من هومولوجس معا. هو جزئ البروتينات، التي تشارك في إصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل قبل اقترانها مثلى، يمكن أيضا أن تكون إيمونوستينيد لتقييم تطور الطور الأول أنا. هنا يمكننا وصف وتبين بالتفصيل أسلوب يستخدم على نطاق واسع لدراسة الانقسام الاختزالي الثدييات في سبيرماتوسيتيس من الفئران الذكور الأحداث أو الكبار.
Introduction
الفئران تستخدم على نطاق واسع ككائن نموذج لدراسة الانقسام الاختزالي في الثدييات. ويمكن تقييم كل العمليات التنموية العادية والعيوب التي تحدث أثناء الانقسام الاختزالي. يمكن وصف الجدول الزمني وتطور السمات البارزة التي تحدث أثناء الطور الأول والمراحل الفرعية، فضلا عن عدد وافر من البروتينات المحددة المشاركة في العمليات الحاسمة للتنظيم للانقسام في نوع البرية والفئران المسخ. العديد من العمليات المتخصصة التي تحدث خلال الانقسام الاختزالي درست بالتفصيل (استعرض في هاندل وشيمينتي1). وتشمل هذه الحمض النووي كسر مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات) تشكيل وإصلاح وممارسو وتشكيل مجمع سينابتونيمال والعزل الصبغي.
أحد جوانب هامة لدراسة العمليات هو هو القدرة على دراسة الأنوية تحتوي على الكروموزومات المتماثلة التي يتم حلها بشكل مرئي وبصريا على نحو أفضل التمييز وتحديد المراحل الفرعية للطور الأول "الطور الأول أولاً" أنا تتألف من المراحل الفرعية 5 التي تتسم بسمات محددة، بما في ذلك تشكيل مجمع سينابتونيمال (SC). اتفاقية استكهولم هي سقالة البروتين الثلاثية التي تمكن من المزاوجة وإصلاح كسر مزدوج-حبلا الحمض النووي من هومولوجس. أثناء ليبتونيما، محاذاة homologs كما تحدد العناصر المحورية لاتفاقية استكهولم. ثم إرفاق العناصر المركزية للمجمع سينابتونيمال أثناء زيجونيما يسهل اتصال الأقران والمادية (تشابك) بين أزواج من هومولوجس. أثناء باتشينيما، يصبح تشابك homologs كاملة ويتم تشكيل الحمض النووي عمليات الانتقال من إصلاح للسكان تحديد فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عن طريق جزئ مثلى. يفكك اتفاقية استكهولم خلال ديبلونيما، مما يتيح هومولوجس ديسينابسي ولكن لا تزال تعلق بها centromeres ومواقع لعمليات الانتقال الحمض النووي. وأخيراً أثناء دياكينيسيس، هومولوجس ريكوندينسي، ويحدث الانتقال إلى الطورية1.
تاريخيا، نشر سطح من الكروماتين هو أسفرت عن الأنوية القليلة، وبخاصة من المراحل المبكرة من الطور الأول أنا2. نتيجة لذلك تم تعديل هذه الأساليب لتحسين فصل الخلايا من الأنسجة (الخصية أو المبيض)، وهذا أسلوب الكروماتين هو نشر، وغلة عالية الجودة هو نواة للتقييم2،3، 4-وبالإضافة إلى ذلك، أثبت هذا الأسلوب أن يكون مفيداً في الحفاظ على النووي وملزمة الكروماتين البروتينات في نواة هو كما يتضح من إيمونولوكاليزيشن نشر تقنيات5،،من67. ولذلك، الأسلوب في البداية وصف بيترز2 وأثبت هنا غلة العديد من الأنوية spermatocyte انفجر منفصلة تحتوي على هومولوجس تمر المراحل الفرعية leptotene، زيجوتيني، باتشيتيني، وطور، ودياكينيسيس من الطور الأول أنا.
تقنية إعداد سطح الانتشار النوى (تسمى أيضا تحليل انتشار الكروماتين) يستخدم على نطاق واسع لدراسة الانقسام الاختزالي في ميادين البيولوجيا الإنجابية والخلية. الشرائح التي تحتوي على نويات السطح-انتشار يمكن فيما بعد إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة للبروتينات ذات الاهتمام أو تعرض لتلطيخ الفضة، وتحليلها ثم مع الفحص المجهري. الأسلوب مشابه للفئران الذكور والإناث على حد سواء، على الرغم من أن التعديلات قد وصفت للفئران الإناث2. من المهم عدم أوفيرمينسي الخصي. الأنوية يجب أيضا جيدا وتنشر ذلك بعد هومولوجس إيمونوستينينج والبروتينات المقترنة يتم رؤيتها بوضوح مع الفحص المجهري. يمكن إعداده في بضع ساعات فقط، وأما إيمونوستينيد فورا نويات السطح-انتشار أو المخزنة في-80 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 أسابيع قبل ذوبان الجليد وإيمونوستينينج. ومع ذلك، المثلى هي أفضل الحصول على نتائج لبعض البروتينات إذا أجرى immunostaining فورا أو في غضون أسبوعين لإعداد سطح الانتشار النوى. شرائح يمكن أن إيمونوستينيد مع بروتوكول قياسي باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات ذات الاهتمام، تليها الحضانة مع بروتينات الأجسام المضادة الثانوية مترافق الفلورسنت أو الأصباغ، ثم تصويرها بالأسفار مجهرية8. 15-21 يوم بعد الولادة هناك الأنسجة يكفي كل زوج من النوع المتوحش الخصيتين لإنتاج شرائح 6-10، والفئران الأكبر سنا (بما في ذلك الكبار) سوف تسفر عن المزيد من الشرائح. ومع ذلك، الفئران البرية نوع 6 أسابيع من العمر وكبار السن أيضا ستسفر عن خلايا أكثر هو ما بعد (أي لوحظت) على الشرائح بعد إيمونوستينينج. وبالإضافة إلى ذلك، جميع المراحل الفرعية للطور الأول أنا يمكن ملاحظتها في الفئران الأحداث والبالغين. الخصيتين من الذكور في الأيام التالية للولادة 10 إلى 15 سوف تسفر عن العديد من أكثر الخلايا leptotene وزيجوتيني. سوف تسفر عن الفئران الأقدم من يوم الولادة 14 إلى 15 نوى باتشيتيني وطور أكثر.
هنا يمكننا وصف وعرض أسلوب يستخدم على نطاق واسع لإعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الطرق التي أجريت على الفئران تستخدم معايير الرعاية الاجتماعية والأخلاقية العالية، ووافقت عليها لجنة الاستخدام في "جامعة دريكسيل كلية الطب" ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-إعداد الحلول والأدوات اللازمة
- إعداد المخزن المؤقت الاستخراج ناقص التوتر (عب) في 50 مل الماء الصف مختبر عالي النقاوة، pH 8.2-8.4 (الجدول 1). جعل الحل جديدة كل مرة، الحفاظ على الجليد، واستخدام ضمن ح 2 إعداد هوامش؛ وهذا ضروري لتحسين الحد وحوزتي تثبيط الأنشطة DTT وبمسف، على التوالي. استخدام 10 مل حب لكل زوج من الخصيتين الماوس.
- إعداد حل سكروز 100 مم (جديدة كل مرة) عن طريق إضافة ز 0.342 السكروز إلى 10 مل مختبر عالي النقاوة المياه الصف. ضبط درجة الحموضة إلى 8.2
- إعداد حل مثبت (0.15% 1% بارافورمالدهيد (PFA)، Triton X-100، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 9.2 مع 1 N HCl أو هيدروكسيد الصوديوم N 1) شهرية جديدة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. تمييع 16% متاحة تجارياً PFA انطلاق أسهم إلى 4 في المائة في برنامج تلفزيوني X 1 لاستخدامها كمخزون عامل، ومن ثم تخزين مختبرين 4% عند-20 درجة مئوية.
- لإعداد الحل مثبت، قم بإضافة 10 مل محلول منهاج العمل 4% و 600 ميليلتر من 10% X-100 تريتون إلى 30 مل من 1 X PBS، يخلط جيدا، وضبط درجة الحموضة إلى 9.2 مع 1 N HCl أو هيدروكسيد الصوديوم ن 1. تخزين الحل مثبت في أنبوب 50 مل مخروطية ملفوفة في رقائق الألومنيوم في درجة حرارة الغرفة (أي أكثر من 4 أسابيع).
- إعداد الحلول يغسل (حين يتم تجفيف الشرائح في الماضي 30 دقيقة) مع 200 صور-فلو: 0.4% صور-فلو 200/برنامج تلفزيوني (320 ميليلتر من 200 صور-فلو في 80 مل من 1 X PBS) و 0.4% صور-فلو 200/dH2س (160 ميليلتر من 200 صور-فلو في 40 مل مياه الصف مختبر عالي النقاوة). استخدام جرة كوبلين 50 مل مليئة 40 مل حلول ليغسل الشرائح 10 أو أقل في وقت واحد.
- إعداد الصكوك التالية: 1 زوج من مقص جراحي (جداً الجلد)، 1 زوج من تلميح جيد المقص الجراحي (جداً الصفاق)، 2 زوجاً من نصيحة مباشرة غرامة الملقط (تشريح خارج كل الخصية)، 1 شفرة حلاقة حافة مستقيمة (كل الخصية جداً)، 2 زوجاً من منحنى ملقط نصيحة (شل كل الخصية ويعصر الخصي)، 50 مل كوبلين الجرار، تفلون طباعة الشرائح خاتم 3، 1 مشرط مع بليد الحجم 11، دائرة هوميديفيد، أطباق بيتري 100 × 15 ملم، علامة دائمة تلميح جيد أو قلم رصاص، منصة شاكر الدورية.
- بريكلينيد قسط المكان دون توجيه تهم لهم نهاية متجمد الزجاج الشرائح تستقيم في جرة كوبلين 50 مل مليئة بحل مثبت حتى الاستخدام.
ملاحظة: قلم رصاص المفضل إذا كان سيتم استخدام الشرائح لاحقاً في الإجراءات التي تتطلب الإيثانول، مثل الأسفار في الموقع التهجين.
- بريكلينيد قسط المكان دون توجيه تهم لهم نهاية متجمد الزجاج الشرائح تستقيم في جرة كوبلين 50 مل مليئة بحل مثبت حتى الاستخدام.
2-سبيرماتوسيتي نوى نشر
- Euthanize ماوس ذكور وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (مثل التفكك عنق الرحم مع أو بدون الاختناق2 CO).
- استخدام P10-P20 الذكور تقييم الخلايا هو في الموجه الأولى من الحيوانات المنوية؛ نستخدم بشكل روتيني P15-P17 الذكور للحصول على خلايا من جميع المراحل الفرعية للطور الأول أولاً سوف توفر الخصيتين الكبار الخلايا من الطور الأول وأنا أيضا، ولكن أيضا أنها سوف تسفر عن الخلايا بوستميوتيك أكثر، مثل لوحظت.
- الحصاد ووزن الخصيتين (تسجيل الأوزان المزدوجة)؛ ثم وضعها في طبق بتري يحتوي على بضع قطرات من حب البارد للحفاظ على رطوبة.
- عقد في الخصية ضد الجزء السفلي من الطبق مع الملقط نصيحة منحنى واستخدام شفرة حلاقة حافة مستقيمة جعل شق خط الوسط عمودي صغيرة عن طريق الكبسولة الخصية. أثناء الضغط مع الاستمرار الخصية ضد الجزء السفلي من الطبق مع الملقط واحدة، استخدم مجموعة ثانية من طرف منحنى ملقط أو شفرة حلاقة حافة مستقيمة للضغط بلطف الخصي من الخصية.
- ضع الأنابيب في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل حب البرد، مع الحرص على تفادي وضع القطع كبسولة في الأنبوب. كرر هذه الخطوات مع الخصية الثانية.
- احتضان ديكابسولاتيد الخصي في أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على حب على الجليد مدة 30-60 دقيقة، تبعاً لحجم الخصيتين. احتضان الخصي من زوج من الخصيتين وزنها 30 ملغ أو أقل لمدة 30 دقيقة، الأنابيب من زوج من الخصيتين وزنها 31 إلى 50 ملغ لمدة 30-45 دقيقة، والخصيتين أكبر لمدة 60 دقيقة. لا تغير من الأوقات للخصية واحدة.
ملاحظة: قد تختلف فترة حضانة الأمثل اعتماداً على التجربة المجرب، والكواشف المستخدمة والفئران ويجري تحليلها. - بينما هي تفرخ الخصي في عب، استخدم علامة أو قلم رصاص لتسمية متجمد نهايات الشرائح بريكلينيد مع الماوس رقم ورقم الشريحة والتاريخ. ثم ضع الشرائح تنظيفها مسبقاً في جرة كوبلين يتضمن الحل مثبت.
- وبعد الحضانة، صب الأنابيب وحب في طبق بيتري نظيفة، والأنابيب منفصلة إلى ما يقرب من 3 مم القطر كتل. كل أجمة غلة الشرائح 2 وعدد الشرائح التي أسفرت عن يعتمد على حجم الخصيتين.
ملاحظة: نحن الحصول على 8 شرائح من نوع البرية و 6 شرائح من سوبفيرتيلي Chtf18-null الخصيتين P16 (التي أصغر بسبب انخفاض عدد الخلايا الجرثومية هو والانقسامية8). الخصية الكبار واحدة وزنها 100 مغ أو أكثر، يتوقع أن تسفر عن شرائح 16. - 23 مكان ميليلتر من محلول السكروز 100 ملم في حلقة واحدة من تفلون المطبوعة، وخاتم الشريحة 3 وإضافة أجمة واحد من الخصي إلى الحلبة. ثم استخدام منحنى ملقط تلميح عقد في أجمة، فرم الأنابيب مع شفرة حلاقة 11 حجم بلطف حتى يصبح الحل الملبدة بالغيوم.
ملاحظة: لا أوفيرمينسي كهذا سيؤدي إلى تجزئة الكروموسومات. ملاحظة أن الكروموسومات المجزأة يمكن أن تكون مؤشرا النمط الظاهري المسخ. - إزالة الحطام وإضافة آخر ميليلتر 23 من محلول السكروز واستخدامها ميكروبيبيتي بلطف "الماصة؛" الخليط صعودا وهبوطاً عدة مرات للمساعدة على فصل الخلايا في التعليق.
- إزالة شريحة مغطس في جرة كوبلين المحتوية على حل مثبت وآماله الشريحة على الجرة حيث أن الحبرية سخية واحد يجمع في الزاوية السفلي من الشريحة.
- بيبيت 20 متجمد ميليلتر تعليق خلية السكروز من الطوق الانزلاق الدائري 3 المطبوعة تفلون إلى الحبرية مثبت على قسط الشريحة الزجاجية، وبيبيت تعليق صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.
ملاحظة: الحبرية مثبت ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي في وحدة التخزين حيث أن إضافة 20 ميكروليتر من تعليق خلية السكروز لأنه يتيح التغطية عبر الشريحة بأكملها عندما ينتشر الخليط (انظر 2.11 أدناه).
- بيبيت 20 متجمد ميليلتر تعليق خلية السكروز من الطوق الانزلاق الدائري 3 المطبوعة تفلون إلى الحبرية مثبت على قسط الشريحة الزجاجية، وبيبيت تعليق صعودا وهبوطاً 2-3 مرات.
- إمالة ببطء الشريحة إلى الجانب المقابل الحبرية لنشر تعليق خلية على طول الشريحة. ثم ببطء إمالة الشريحة مرة أخرى إلى نشر تعليق خلية على طول عرض الشريحة لأنها تغطي تماما. تجنب نشر التعليق على نفس المنطقة من الشريحة أكثر من مرة إلا تداخل الخلايا مع بعضها البعض.
- فورا مكان الشريحة شقة في دائرة هوميديفيد وكرر الخطوات من 2.8 إلى 2.11 حتى جميع كتل من الخصي قد استخدمت لجعل الشرائح. من المهم عدم تحريك الدائرة هوميديفيد أثناء عملية التجفيف لتجنب تمزق وتداخل الخلايا.
- السماح للشرائح لاحتضان في دائرة هوميديفيد مغطاة في درجة حرارة الغرفة ل 2.5 ح ثت أن تجف ببطء وليس تماما. ارتفاع نسبة الرطوبة وتجفيف بطيء في هذه الخطوة هامة لضمان نشر كافية الكروماتين. ثم قم بإزالة الغطاء للدائرة والسماح للشرائح أيردري تماما 30 دقيقة إضافية.
- ضع الشرائح (العودة إلى الوراء أو في نمط متعرج) في جرة كوبلين يتضمن الحل برنامج تلفزيوني X صور-فلو 200/1 0.4% ويغسل الشرائح مرتين، كل 5 دقائق، بالتحريض بلطف كوبلين جرة على منصة دوارة شاكر. استخدام حل جديد لكل المياه والصرف الصحي والحفاظ على شرائح من الفئران مختلفة في عبوات منفصلة لكل من يغسل.
- يغسل الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 0.4% صور-فلو حل 200/dH2O لمدة 5 دقائق مرة واحدة أثناء التحريض.
- إزالة الشرائح من كوبلين جرة (يغسل الماضي)، بعناية القضاء على حواف القيعان للشرائح لإزالة السائل الزائد والفترة بين إنجاب طفل وآخر، ووضع الشرائح في وضع الزاوية، تستقيم-تقريبا لتجف. يمكن مجرب الذي يبرع في هذا الأسلوب عملية وإعداد سطح الانتشار النوى من الفئران 4 أو 5 في يوم واحد.
- مرة جاف (15-20 دقيقة)، وعملية الشرائح فورا لتلطيخ الفلورة أو مخزن في-80 درجة مئوية في مربع شريحة مغلقة بأحكام الحماية من الضوء لمدة أقصاها 3 أسابيع (اعتماداً على البروتينات الهدف الذي يجري تقييمه؛ النتائج المثلى يمكن الحصول على حالة الملون في نفس اليوم أو في غضون أسابيع 2).
- إذا كانت مخزنة في-80 درجة مئوية، ثم السماح للشرائح للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة ويغسل في جرة كوبلين تحتوي على 1 X برنامج تلفزيوني أو كتلة لمدة 5 دقائق قبل التلوين.
ملاحظة: سوف توفر العديد من البروتوكولات المصبوغة الفلورة المختلفة نتائج جيدة؛ الرجوع إلى بيركوفيتش وآخرون ل بروتوكول إيمونوستينينج8.
- إذا كانت مخزنة في-80 درجة مئوية، ثم السماح للشرائح للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة ويغسل في جرة كوبلين تحتوي على 1 X برنامج تلفزيوني أو كتلة لمدة 5 دقائق قبل التلوين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قدرة هذا الأسلوب على توفير إعداد كبيرة من سطح تنتشر الأنوية التي تحتوي على هومولوجس سليمة يعتمد على ثلاثة عوامل رئيسية: 1) وقت الحضانة المناسبة للخصي في المخزن المؤقت ناقص التوتر (أي حب) للحصول على صورة كافية تضخمت spermatocyte نوى أن تنفجر ولكنها لم تتفكك من إطالة أمد الحضانة في عب، 2) ميكروبيبيتينج قطرات السكروز من الخلايا للحصول على تعليق فصل الأنوية التي هي ليست تجمعت معا، و 3) إمالة كل مثبت معدني مغلف بالشريحة في اتجاه واحد في وقت واحد وعدم ذهابا وإيابا. وبمجرد إعداد، السطحية انتشار الأنوية يمكن أن إيمونوستاينيد مع المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة للبروتينات للفائدة وثم تصويرها بالفحص المجهري (الممثل أمثلة تظهر في الشكل 1 و الشكل 2. ويبين الشكل 1 أمثلة من نوى باتشيتيني نوع البرية التي تنتشر أيضا (A)، نواة تحتوي على شكل غير متساو إيمونوستينيد، هومولوجس الظهور ممزقة بسبب حضانة في حب طويلة جداً (ب)، ونشر سيئة متداخلة نوى (ج)، ونواة تحتوي على هومولوجس مجزأة بسبب "أوفيرمينسينج" للخصي (د). عندما يتم تنفيذ الأسلوب جيد، عدد كبير أنوية تمثل في المراحل الرئيسية الفرعية 5 من الطور الأول وأنا يمكن الحصول على. الشكل 2 يوضح مراحل الطور الأول leptotene، زيجوتيني، باتشيتيني، وطور، ودياكينيسيس في نويات spermatocytes البرية نوع من الأحداث الذكور.
الشكل 1: انتشار سطح نواة spermatocytes البرية نوع من الفئران الأحداث.
نوى سبيرماتوسيتي باتشيتيني كانت ملطخة بمكافحة--SYCP3 (الأخضر)، الذي أنوية العناصر المحورية/الجانبي مجمع سينابتونيمال (A) أيضا انتشار بقع. (ب) نوى من الخصي المحتضنة في حب طويلة جداً. (ج) ضعف انتشار نويات المتداخلة. (د) مجزأة هومولوجس بسبب "أوفيرمينسينج" للخصي (رؤوس الأسهم تشير إلى شظايا صغيرة homolog اثنين). شريط مقياس من 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: أمثلة على نواة من المراحل الفرعية للطور الأول أنا.
سبيرماتوسيتيس البرية نوع من الذكور الأحداث كانت ملطخة بالمصل كريست (أحمر)، الذي البقع centromeres، ومكافحة SYCP3 (الأخضر)، الذي بقع العناصر المحورية/الجانبي من مجمع سينابتونيمال. مراحل الطور الأول leptotene، زيجوتيني، باتشيتيني، وطور، ودياكينيسيس الأول، على التوالي، وترد. شريط مقياس من 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | الكمية | التركيز النهائي |
| 1 م تريس Cl (pH 8.2) | 1.5 مل | 30 مم |
| السكروز | ز 0.85575 | 50 مم |
| سترات صوديوم ثنائي هيدرات | ز 0.25 | 17 ملم |
| 0.5 يدتا م | 500 ميكروليتر | 5 مم |
| ديثيوثريتول (DTT) | ز 0.00385 | 0.5 مم |
| 0.2 M فينيميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف) | 25 ميكروليتر | 0.1 مم |
الجدول 1: وصفه لاستخراج ناقص التوتر المخزن المؤقت (عب).
إضافة الكواشف إلى مختبر عالي النقاوة 50 مل الصف المياه وضبط على درجة الحموضة 8.2-8.4 (في حالة الضرورة استخدام حل هيدروكسيد الصوديوم ن 1 أو 1 N HCl). إعداد حب جديدة كل مرة، والحفاظ على الجليد، وتستخدم داخل ح 2 من إعداد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحصول على إعداد كبيرة من نوعية جيدة، وانتشرت أيضا spermatocyte نوى، تشمل الخطوات الأكثر أهمية لهذا البروتوكول وقت الحضانة المناسبة للخصي في عب، مناسبة تنميق للخصي، والتقنية المستخدمة في تنتشر تعليق خلية السكروز slide(s) المغلفة مثبت. نحن احتضان الخصي من الخصيتين للذكور نوع البرية بدءاً من يوم الولادة 15 إلى سن البلوغ في حب لمدة 45 دقيقة، بينما الخصيتين من العمر نسبيا Chtf18-الفئران فارغة هي المحتضنة لمدة 30 دقيقة فقط لأن نصف حجم الخصيتين وتحتوي على إلى حد كبير أقل الخلايا الجرثومية8. في تجربتنا، حضانة Chtf18-null الخصيتين لفترة أطول من 30 دقيقة يعرض للخطر سلامة الخلايا، أسفر عن حل سوء homologs. هي مفروم الخصي فقط للحصول على تعليق خلية سكروز الملبدة بالغيوم، ويجب أن تحتوي كل شريحة على معالجة تجميعية سخية من مثبت قبل نشر (انظر 2.10). شرائح تميل في اتجاه واحد في وقت واحد وليس ذهابا وإيابا. الأسلوب المثالي لدراسة الانقسام الاختزالي أنا، ولكن ذلك محدودة إلى حد كبير إلى المراحل الفرعية للطور الأول أنا. ومع ذلك، أفادت الأنوية في مرحلة ثانية بريميوتيك، الطورية الأول والثاني يمكن ملاحظتها، وقد تم7،9.
هذا هو أسلوب مباشر يتطلب بعض الممارسة لاكتساب الكفاءة والحصول على أفضل النتائج. يمكن أن يحدث نتائج دون المستوى الأمثل لعدة أسباب مختلفة. الأنوية قد لا يكون جيدا انتشار، مما أدى إلى متفاوت المسافات أو تداخل الخلايا. يمكن أن يحدث هذا إذا لم يتم بيبيتيد تعليق خلية السكروز على نحو كاف أو لا يوجد ما يكفي مثبت على الشريحة لتنتشر الأنوية جيدا. إذا كانت الشرائح غير المغلفة مع مثبت المتبقية كافية أو تعليق خلية لا تنتشر عبر الشريحة في اتجاه واحد السلس أو انتشار مرارا وتكرارا ذهابا وإيابا، ثم الخلايا سوف تتداخل وتتجمع معا. إذا كان الخصي هي "أوفيرمينسيد" ثم هومولوجس قد تكون مجزأة أو تظهر تمزيقه إلى حد ما. لأنه قد يكون أصغر متحولة الخصيتين وتحتوي على سبيرماتوسيتيس أقل وتكون أكثر عرضه إلى "أوفيرمينسينج" أو تجزئة للخصي، نوصي ببضع مرات على الخصيتين التحكم (مثل نوع البرية) أولاً لتحسين هذا الأسلوب في ممارسة أيدي مبتدئ.
إعداد نواة انتشار السطحية تقنية أساسية تستخدم لدراسة الخطوات التنظيمية الرئيسية والتقدم للانقسام الاختزالي، فضلا عن تميز تعمل هو في الفئران. ولذلك، علينا استخدام هذا الأسلوب على نطاق واسع وتعليم جميع الأعضاء الجدد في مختبر كيفية القيام بذلك. حالما يتقن هذا الأسلوب، يمكن استخدام مجموعة متنوعة تقنيات أخرى في وقت لاحق بالتزامن مع ذلك. على سبيل المثال، عدة أنواع من إيمونوستينينج و/أو مجهرية بما في ذلك ويديفيلد أو [كنفوكل] مع ابيفلوريسسينسي، أو الإلكترون يمكن إجراء الفحص المجهري. بالإضافة إلى دراسة البروتينات الخاصة بالانقسام مثل مكونات مجمع سينابتونيمال، تلك التي تتفاعل مع اتفاقية استكهولم، مثل كوسينس، مولتيبروتين المجمعات التي تتوسط التماسك، يمكن تقييم (استعرض في 10،11 ،12). يمكن أن يكون تنظيم تكوين كروس الحمض النووي، وتجهيز، ونضج ودرسنا أيضا مع هذا الأسلوب13. In addition، هذا الأسلوب قد أنجز بعد استخدام أساليب للحصول على فئات معينة من السكان للماوس سبيرماتوسيتيس: 1) في أعقاب ثقافة سبيرماتوسيتيس في حمض أوكاديك للحث على التقدم للانتقال G2/مي، مما أسفر عن زيادة في إعداد طور، دياكينيسيس، والطوريه أنا ينتشر14،15 و 2) بعد الأساليب المستخدمة لعزل سكان بالتخصيب pachytene spermatocytes14.
وصف أسلوب إعداد نواة انتشار السطح من الماوس spermatocytes وأثبت هنا وتقنية مفيدة للغاية وواضحة. ومن الجوهري لكل مختبر الدراسات الانقسام الاختزالي استخدام الفئران ككائن نموذج، ولكن يتطلب بعض الممارسة والجودة لتحقيق أفضل النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بمساعدة تقنية من أبيغيل هاريس. أنهم أيضا أن نقر كوهين باولا وهولواي كيم للمساعدة على تحسين بروتوكول إعداد نواة انتشار السطح من الماوس سبيرماتوسيتيس. كما نقدر الكتاب قراءة نقدية من المخطوطة التي شندلر كارين.
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة R01 GM106262 إلى K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
