अर्धसूत्रीविभाजन विकास प्रक्रिया है जिसके द्वारा gametes डीएनए प्रतिकृति के एक दौर के माध्यम से और गुणसूत्र अलगाव के दो लगातार दौर के माध्यम से गठित कर रहे हैं । स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन meiotic गुणसूत्र फैलता तैयार करने के लिए एक तकनीक का उपयोग करके जांच की जा सकती है । यहां, हम माउस spermatocytes से सतह फैल नाभिक तैयार करने की एक विधि का प्रदर्शन ।
स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन एक गतिशील विकास प्रक्रिया है कि रोगाणु कोशिकाओं में होता है और अध्ययन किया जा सकता है और विशेषता है । एक विधि का उपयोग करने के लिए स्लाइड की सतह पर नाभिक प्रसार (बजाय उंहें एक ऊंचाई से छोड़ने), हम माउस spermatocytes है कि पहले १९९७ में वर्णित किया गया था पर एक अनुकूलित तकनीक का प्रदर्शन । यह विधि व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन क्योंकि यह उच्च गुणवत्ता के एक बहुतायत पैदावार नाभिक के दौर से गुजर सेमिनीफेरस नलिकाओं पहले एक hypotonic समाधान में रखा जाता है गज़ब spermatocytes । फिर spermatocytes एक सेल निलंबन बनाने के लिए एक सुक्रोज समाधान में जारी कर रहे हैं, और नाभिक निर्धारण लथपथ गिलास स्लाइड पर फैले हुए हैं । immunostaining के बाद, प्रोटीन की विविधता meiotic प्रक्रियाओं के लिए जर्मन की जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, synaptonemal कॉम्प्लेक्स के प्रोटीन, एक त्रिपक्षीय संरचना जो गुणसूत्र अक्षों को जोड़ता है/एक साथ homologs के कोर आसानी से visualized किया जा सकता है । Meiotic पुनर्संयोजन प्रोटीन, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा डीएनए डबल-किनारा टूटता की मरंमत में शामिल कर रहे हैं, भी immunostained जा सकता है के लिए दौर की प्रगति का मूल्यांकन मैं । यहां हम वर्णन और विस्तार से एक तकनीक व्यापक रूप से किशोर या वयस्क पुरुष चूहों से spermatocytes में स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रदर्शन ।
चूहों बड़े पैमाने पर एक मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया जाता है स्तनधारियों में अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन । अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होने वाली सामान्य विकासात्मक प्रक्रियाओं और दोषों दोनों का मूल्यांकन किया जा सकता है. समयरेखा और मुख्य विशेषताएं है कि मैं और उपचरण दौर के दौरान होते है की प्रगति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट अर्धसूत्रीविभाजन के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की एक भीड़ दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों में विशेषता हो सकती है । कई विशेष प्रक्रियाओं है कि अर्धसूत्रीविभाजन मैं विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है के दौरान हो (Handel और Schimenti1में समीक्षा की) । इनमें डीएनए डबल-किनारा तोड़ (DSB) गठन और मरंमत, पुनर्संयोजन, synaptonemal जटिल गठन, और गुणसूत्र अलगाव शामिल हैं ।
meiotic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू नाभिक की जांच करने की क्षमता है जो मुताबिक़ गुणसूत्रों से युक्त हैं जो नेत्रहीन और ऑप्टिकल रूप से बेहतर भेद करने के लिए हल किए गए हैं और मैं दौर के उपक्रमों की पहचान करता हूं । मैं 5 उपस्तर के शामिल है । कि synaptonemal परिसर (अनुसूचित जाति) के गठन सहित विशिष्ट सुविधाओं की विशेषता है । अनुसूचित जाति एक त्रिपक्षीय प्रोटीन पाड़ है कि बाँधना और डीएनए homologs के दोहरे-किनारा तोड़ने की मरंमत में सक्षम बनाता है । leptonema के दौरान, अनुसूचित जाति के अक्षीय तत्वों के रूप में homologs संरेखित रखी जाती है । तो zygonema के दौरान synaptonemal परिसर में केंद्रीय तत्वों की कुर्की पेयरिंग और homologs के जोड़े के बीच शारीरिक कनेक्शन (synapsis) की सुविधा. pachynema के दौरान, homologs के synapsis पूरा हो जाता है और डीएनए क्रॉसओवर डीएनए डबल-किनारा टूट मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से एक का चयन जनसंख्या की मरंमत से बनते हैं । अनुसूचित जाति diplonema के दौरान जुदा है, homologs desynapse के लिए अनुमति देता है लेकिन उनके centromeres में और डीएनए क्रॉसओवर की साइटों पर संलग्न रहते हैं । अंत में diakinesis के दौरान, homologs reसंघनित्र और metaphase के लिए संक्रमण होता है1।
ऐतिहासिक, सतह meiotic क्रोमेटिन के प्रसार कुछ नाभिक, विशेष रूप से दौर मैं2के प्रारंभिक दौर से उन उपज । नतीजतन, इन तरीकों के ऊतकों (यानी वृषण या अंडाशय), meiotic क्रोमेटिन के प्रसार की तकनीक, और मूल्यांकन के लिए उच्च गुणवत्ता meiotic नाभिक की उपज की जुदाई में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया2,3, 4. इसके अलावा, इस विधि के रूप में प्रकाशित immunolocalization तकनीक5,6,7द्वारा प्रदर्शन के रूप में meiotic नाभिक में परमाणु और क्रोमेटिन बंधे प्रोटीन के संरक्षण में उपयोगी साबित हुआ । इसलिए, विधि शुरू में पीटर्स2 द्वारा वर्णित है और यहां प्रदर्शन कई अलग फट spermatocyte नाभिक युक्त homologs leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, और diakinesis के दौर के दौर से गुजर रहा है ।
भूतल-प्रसार नाभिक (जिसे क्रोमेटिन स्प्रेड एनालिसिस भी कहा जाता है) तैयार करने की तकनीक का प्रयोग व्यापक रूप से प्रजनन और कोशिका जीवविज्ञान के क्षेत्रों में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है. सतह प्रसार नाभिक युक्त स्लाइड बाद में ब्याज के प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained जा सकता है या चांदी धुंधला के अधीन है, और फिर माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया । विधि दोनों पुरुष और मादा चूहों के लिए समान है, हालांकि संशोधन महिला चूहों के लिए वर्णित किया गया है2. यह महत्वपूर्ण है सेमिनीफेरस नलिकाओं को भरती नहीं है । नाभिक भी अच्छी तरह से फैल जाना चाहिए ताकि निंनलिखित immunostaining homologs और जुड़े प्रोटीन स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप के साथ देखा जाता है । सतह के प्रसार नाभिक बस कुछ ही घंटों में तैयार किया जा सकता है और या तो तुरंत immunostained या पर संग्रहित-८० ° c गल और immunostaining से पहले 3 सप्ताह की अधिकतम के लिए । हालांकि, इष्टतम परिणाम सबसे अच्छा कुछ प्रोटीन के लिए प्राप्त कर रहे है अगर immunostaining तुरंत या सतह फैल नाभिक तैयार करने के 2 सप्ताह के भीतर किया जाता है । स्लाइड्स एक मानक प्रोटोकॉल के साथ immunostained किया जा सकता है ब्याज के प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग, माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों के लिए संयुग्मित के साथ मशीन के बाद, तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged8. प्रसव दिवस पर 15-21 वहां जंगली प्रकार परीक्षण के प्रति जोड़ी के लिए पर्याप्त ऊतक है 6-10 स्लाइड उपज, और बड़े चूहों (वयस्कों सहित) और अधिक स्लाइड निकलेगा । हालांकि, जंगली प्रकार के चूहों 6 सप्ताह की आयु और पुराने भी immunostaining के बाद स्लाइड पर अधिक पोस्ट-meiotic कोशिकाओं (यानी spermatids) उपज होगी । इसके अलावा, मैं किशोर और वयस्क चूहों में मनाया जा सकता है चरण के सभी उपस्तर । प्रसव दिनों में 10 से 15 के माध्यम से पुरुषों से परीक्षण कई और अधिक leptotene और zygotene कोशिकाओं की उपज होगी । प्रसव दिन 14 से 15 से अधिक पुराने चूहों अधिक pachytene और diplotene नाभिक उपज होगी ।
यहाँ हम वर्णन और माउस spermatocytes से सतह प्रसार नाभिक की तैयारी का एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि का प्रदर्शन.
अच्छी तरह से फैल की उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए, अच्छी गुणवत्ता spermatocyte नाभिक, इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम HEB में सेमिनीफेरस नलिकाओं के उचित मशीन समय शामिल हैं, नख़रेबाज़ सेमिनीफेरस के उचित नल?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक अबीगैल हैरिस की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं । उंहोंने यह भी स्वीकार करते है पाउला कोहेन और किम होलोवे की मदद करने के लिए सतह की तैयारी के प्रोटोकॉल अनुकूलित माउस spermatocytes से फैल नाभिक । लेखक भी करेन शिंडलर्स द्वारा पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने की सराहना करते हैं ।
यह काम NIH R01 GM106262 ने K.M.B. को समर्थन दिया था
Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |