Summary
Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.
Abstract
Memeli mayoz germ hücrelerinde oluşur ve okudu ve karakterize dinamik bir gelişim işlemidir. Çekirdeği üzerinde slaytlar yüzeyine yaymak için bir yöntem kullanarak (onları bir yükseklikten atılan yerine), biz ilk olarak 1997 yılında açıklanmıştır bir en iyi duruma getirilmiş tekniği üzerinde fare spermatocytes göstermek. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan yüksek kaliteli çekirdekleri profaz ı. seminifer substages geçiren bir bolluk verimleri çünkü memeli mayoz çalışma laboratuvarlarda tübüllerin ilk spermatocytes şişmeye Hipotonik çözeltilerine yerleştirilir. O zaman spermatocytes bir hücre süspansiyon oluşturmak için bir Sükroz çözümde serbest bırakılır ve çekirdekleri sabitleştirici bulanmış cam slaytlar yayılır. İmmunostaining, proteinler segregasyonun işlemlere konu ile ilgili bir çeşitlilik incelenebilir. Örneğin, protein synaptonemal kompleks kromozom eksen/çekirdek homologs, birlikte bağlayan bir üçlü yapı kolayca görselleştirildiği. DNA çift iplikli kırılmalara tamirde homolog rekombinasyon tarafından söz konusu, segregasyonun rekombinasyon proteinler de profaz ilerlemesini değerlendirmek için immunostained olabilir ben. Burada biz tanımlamak ve ayrıntılı olarak spermatocytes gelen çocuk ya da yetişkin erkek fareler içinde memeli mayoz çalışma için yaygın olarak kullanılan bir tekniği göstermek.
Introduction
Fareler yaygın olarak mayoz memelilerde çalışma için bir model organizma olarak kullanılır. Normal gelişim süreçleri ve mayoz sırasında oluşan hataları değerlendirilebilir. Zaman çizelgesi ve profaz sırasında ben ve substages oluşan belirgin özellikleri ilerlemesini yanı sıra çok sayıda belirli proteinlerin süreçleri mayoz düzenlenmesi için çok önemli yer vahşi türü ve mutasyona uğramış fareler karakterize edilebilir. Ben (Handel ve Schimenti1' gözden) ayrıntılı okudu mayoz sırasında oluşan birkaç özel işlemler. Bunlar DNA iki iplikçikli (DSB) formasyonu ve tamir, Rekombinasyon, synaptonemal kompleks oluşumu ve kromozom ayrımı içerir.
Segregasyonun süreçleri eğitimi önemli bir yönü optik ve görsel olarak daha iyi çözümlenir içeren homolog kromozomlar ayırt etmek ve profaz ı. profaz 5 substages oluşur substages tanımlamak çekirdeği incelemek için yeteneğidir Bu synaptonemal kompleksi (SC) oluşumu dahil olmak üzere belirli özellikleri ile karakterizedir. SC bir eşleştirme sağlar üçlü protein iskele ve DNA iki iplikçikli sonu tamiri homologs olduğunu. SC Aksiyel unsurları belirlenmiştir gibi leptonema sırasında homologs hizalayın. O zaman zygonema sırasında synaptonemal kompleks Merkezi elemanları ek eşleştirme ve fiziksel bağlantı (synapsis) homologs çiftleri arasındaki kolaylaştırır. Pachynema sırasında homologs synapsis tam olur ve DNA kesişim üzerinden homolog rekombinasyon DNA çift iplikli kırılmalara select nüfusu tamiri dan oluşur. SC diplonema sırasında homologs desynapse ama onların sentromerler ve DNA kesişim sitelerdeki bağlı kalır izin ayrıştırır. Son olarak homologs diakinesis sırasında recondense ve metafaz geçiş1oluşur.
Tarihsel olarak, yüzey saçan segregasyonun Kromatin, kaç hücre çekirdeği, özellikle de profaz erken dönemlerinde üzerinden vermiştir ben2. Sonuç olarak, bu yöntemleri dokuları (yani testis ya da yumurtalık) hücrelerden ayrılması, Yayilim segregasyonun Kromatin tekniği ve değerlendirme2,3, için yüksek kaliteli segregasyonun çekirdeği verimini artırmak için modifiye edilmiştir 4. buna ek olarak, bu yöntem nükleer koruyarak yararlı kanıtladı ve Kromatin bağlı proteinler segregasyonun çekirdekleri tarafından yayımlanan immunolocalization teknikleri5,6,7gösterildiği gibi. Bu nedenle, bu yöntem başlangıçta Engin2 tarafından açıklanan ve verimleri profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis substages geçiren homologs içeren birçok ayrı patlama spermatocyte çekirdeği aşağıda gösterildiği ben.
Yüzey-yayılım çekirdeği (Kromatin yayılmış analiz olarak da bilinir) hazırlama tekniği mayoz üreme ve hücre biyolojisi alanlarında çalışma için yaygın olarak kullanılır. Yüzey-yayılım çekirdek içeren slaytlar immunostained antikorlar proteinlere ilgi ile daha sonra olabilir veya gümüş boyama için tabi ve mikroskobu ile analiz. Yöntem hem erkek hem de dişi fareler için benzer olsa da değişiklikler için dişi fareler2tarif edilmistir. Seminifer tübüllerin overmince değil çok önemlidir. Çekirdeklerin da de immunostaining homologs takip böylece yaymak gerekir ve ilişkili proteinler mikroskobu ile açıkça görülmektedir. Yüzey-yayılım çekirdek sadece birkaç saat ve her iki immunostained hemen hazırlanmış veya en fazla 3 hafta önce çözdürme ve immunostaining-80 ° C'de depolanan. Ancak, en iyi sonuçları en iyi immunostaining hemen veya yüzey-yayılım çekirdeği hazırlama 2 hafta içinde gerçekleştirilirse bazı proteinler için elde edilir. Slaytlar-ebilmek var olmak immunostained karşı antikorlar için faiz, proteinlerin kullanarak standart bir protokol ile kuluçka ikincil antikorlar floresan için konjuge proteinler veya boya ile izledi, sonra Floresans mikroskobu8ile görüntüsü. Doğum sonrası gün 15-21, 6-10 slaytlar vermeye vahşi türü testisler çift başına yeterli doku işte ve büyük fareler (yetişkin dahil) daha fazla slayt verecektir. Ancak, farelerde vahşi tip 6 hafta yaş ve üstü de immunostaining takip slaytlara daha sonrası segregasyonun hücreleri (yani spermatids) ortaya çıkarır. Buna ek olarak, tüm substages profaz, ben çocuk ve yetişkin fareler görülebilmektedir. Testis erkek, doğum sonrası gün 10 ile 15 dan çok daha fazla leptotene ve zygotene hücre ortaya çıkarır. Doğum sonrası gün 14-15 büyük fareler daha fazla pachytene ve diplotene çekirdekleri ortaya çıkarır.
Burada biz tanımlamak ve yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama bir yaygın kullanılan yöntem göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntemleri fareler içeren yüksek etik ve sosyal standartları kullanılmaktadır ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlık çözümler ve gerekli aletleri
- Hipotonik ayıklama arabellek (HEB) 50 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su, pH 8.2-8.4 (tablo 1) hazırlayın. Taze her zaman buz üzerinde saklayın ve yayılır hazırlama 2 h içinde çözüm olun; Bu azaltmak ve DTT ve PMSF, faaliyetleri sırasıyla inhibe proteaz optimize etmek gereklidir. HEB 10 mL fare testis her çifti için kullanın.
- 100 mM Sükroz çözüm (taze her zaman) ultrasaf laboratuvar için 10 mL sukroz 0.342 g ekleyerek sınıf su hazırlamak. 8.2 için pH ayarlama
- Sabitleştirici çözüm hazırlamak (%1 paraformaldehyde (PFA), % 0.15 Triton X-100, 9,2 1 N HCl veya 1 N NaOH ile ayarlanır pH) taze aylık ve mağaza oda sıcaklığında korumalı gelen ışık. Bir % 16 piyasada bulunan İngiltere'de yılın başlangıç hisse senedi 1 X PBS bir çalışma hisse senedi olarak kullanmak için % 4 oranında seyreltin ve % 4 aliquots-20 ° C'de depolayın
- Sabitleştirici çözüm hazırlamak için 10 mL % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ve 600 µL % 10 ekleyin Triton X-100 30 ml 1 X PBS, iyice karıştırın ve pH 1 N HCl veya 1 N NaOH ile 9.2 için ayarlayın. Sabitleştirici çözüm 50 mL konik tüp (en fazla 4 hafta boyunca) oda sıcaklığında alüminyum folyo sarılı saklayın.
- Fotoğraf-Flo 200 (slaytlar son 30 dk kurutma iken) yıkama çözümlerle hazırlamak: %0.4 fotoğraf-Flo 200/PBS (80 ml 1 X PBS fotoğraf-Flo 200 320 µL) ve % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O (40 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su içinde fotoğraf-Flo 200 160 µL). 10 veya daha az slaytlar teker teker yıkamak için çözümler 40 mL ile dolu bir 50 mL Coplin kavanoz kullanın.
- Cihazlar hazırlamak: Cerrahi makas (Cilt deşmek için), 1 Çift 1 Çift iyi ipucu Cerrahi makas (karın zarını deşmek için), düz ince uç forseps, (her sınav incelemek için) 2 Çift 1 düz kenarlı (her testis deşmek için) jilet, 2 çift eğri (her testis hareketsiz ve seminifer tübüllerin sıkmak için) ipucu forseps, 50 mL Coplin kavanozlar, Teflon basılı 3 halka slaytlar, boyutu 11 bıçak, oksijen odası, 100 x 15 mm Petri yemekler, iyi ipucu kalıcı kalem veya kurşun kalem, 1 neşter ve bir Platform dönen shaker.
- Yer sigorta primi doldurulmamış buzlu sonunda cam slaytlar dik kavanozda kadar kullanmak sabitleştirici çözüm ile dolu 50 mL Coplin precleaned.
Not: slaytlar etanol, Floresans in situ hibridizasyon gibi gerektiren işlemler daha sonra kullanılacaksa, kalem tercih edilir.
- Yer sigorta primi doldurulmamış buzlu sonunda cam slaytlar dik kavanozda kadar kullanmak sabitleştirici çözüm ile dolu 50 mL Coplin precleaned.
2. spermatocyte çekirdeği Yayilim
- Bir erkek fare (örneğin servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma olmadan) kurumsal yönergelere ötenazi.
- P10 - P20 erkek segregasyonun hücrelere sperma ilk dalga değerlendirmek için kullanın; P15 rutin olarak kullandığımız - hücreleri profaz ı. yetişkin testis sağlayacak tüm substages elde etmek için P17 erkek hücreleri profaz ben de, ama onlar da daha postmeiotic hücreleri, spermatids gibi ortaya çıkarır.
- Hasat ve (eşleştirilmiş ağırlıkları kaydetmek) testis tartmak; o zaman onları nemli tutmak için soğuk HEB birkaç damla içeren bir Petri kabına koyun.
- Testis çanak alt karşı eğri ipucu Forseps ile tutun ve küçük dikey Ensizyon testis kapsül yapmak için düz kenarlı jilet kullanın. Testis çanak alt karşı bir Forseps ile süre hareketsiz tutmak, testislerden seminifer tübüllerin hafifçe sıkmak için eğri ipucu forseps ve düz kenarlı jilet ikinci kümesi kullanın.
- Tübüllerin soğuk HEB, adet kapsül tüpün içine koyarak önlemek için dikkat çekici 10 mL içeren bir 15 mL konik tüp içine koyun. İkinci testis ile bu adımları yineleyin.
- HEB testis büyüklüğüne bağlı olarak 30-60 dakika buzda içeren konik tüp decapsulated seminifer tübüllerin kuluçkaya. 30 mg tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden seminifer tübüllerin kuluçkaya veya 30 dk, 31-50 mg 60 dakika 30-45 dakika ve daha büyük testis için tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden tübüllerin için daha az. Bir tek testis için kez değiştirmeyin.
Not: En iyi kuluçka süresi deneyci, kullanılan reaktifler ve analiz ediliyor fareler tecrübesine bağlı olarak değişebilir. - Seminifer tübüllerin HEB içinde kuluçka iken, bir işaret veya kalem numarası, slayt numarası ve Tarih precleaned kaymak fare ile buzlu uçları etiketlemek için kullanın. O zaman önceden temizlenmiş slaytlar sabitleştirici solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin.
- Kuluçka tübüllerin ve HEB temiz bir Petri ve yaklaşık 3 mm çap kümeleri içine ayrı tübüllerin içine dökün. Her yığın 2 slayt verimleri ve vermiştir slayt sayısını testis boyutuna bağlıdır.
Not: Biz vahşi türü ve subfertile Chtf18üzerinden 6 slayt 8 slaytlar elde-P16 testisler (segregasyonun ve Mitotik germ hücreleri8azalan sayıda nedeniyle daha küçük olan) null. 100 mg veya daha ağırlığında bir yetişkin testis 16 slaytlar verim beklenir. - 100 mM Sükroz çözüm bir Teflon bir halka içine yer 23 µL baskılı, 3 slayt halka ve bir yığın seminifer tübüllerin Yüzük'e ekleyin. Sonra kullanarak yığın tutun, çözüm bulutlu hale gelinceye kadar yavaşça tübüllerin boyutu 11 jilet ile bin dereden su getirmek için ipucu forseps kavisli.
Not: Bu parçalanmış kromozomlar yol açar gibi overmince değil. Parçalanmış kromozomlar da mutasyona uğramış bir fenotip göstergesi olabilir unutmayın. - Enkaz kaldırma Sükroz çözüm başka bir 23 µL ekleyip hafifçe karışım yukarı ve aşağı için birkaç kez pipette için bir micropipette kullanabilirsiniz süspansiyon hücrelerde ayrı yardım.
- Sabitleştirici solüsyon içeren Coplin kavanoza iliklerine kadar bir slayt kaldırmak ve o bir cömert damlacık slayt alt köşesinde toplar böylece slayt kavanoz içinde tilt.
- Damlalıklı 20 µL Sükroz hücre süspansiyon üzerinden prim Teflon yazdırılan 3 yüzük slaytta sabitleştirici damlacık içine yüzük, buzlu cam slayt ve damlalıklı süspansiyon aşağı yukarı 2 - 3 kez.
Not: (2,11 aşağıya bakınız) karışımı spread zaman Sükroz hücre süspansiyon bunu 20 μL eklenmesi kapsama tüm slayt sağlar böylece sabitleştirici damlacık hacmindeki yeterince büyük olmalıdır.
- Damlalıklı 20 µL Sükroz hücre süspansiyon üzerinden prim Teflon yazdırılan 3 yüzük slaytta sabitleştirici damlacık içine yüzük, buzlu cam slayt ve damlalıklı süspansiyon aşağı yukarı 2 - 3 kez.
- Yavaş yavaş Slayt Slayt boyunca hücre süspansiyon yaymak için damlacık karşısında tarafa eğin. Sonra yavaş yavaş eğimli slayt arka tamamen karşılayacak slaydın genişliği boyunca hücre süspansiyon yaymak için. Aynı alanı hücreleri birbiriyle çakışır daha--dan bir kez aksi takdirde slaydın üzerinde süspansiyon yayılmasını önlemek.
- Hemen düz bir oksijen odasında slayt yerleştirin ve slaytlar yapmak için kullanılan seminifer tübüllerin adımlardan 2.8-2,11 tüm kümeleri kadar yineleyin. Yırtılma ve hücreleri örtüşen önlemek için kurutma işlemi sırasında oksijen odası oynatmamaya önemlidir.
- Böylece yavaş yavaş ve tamamen kuru 2,5 h için oda sıcaklığında kapalı bir oksijen odasında kuluçkaya slaytların izin. Yüksek nem ve yavaş bu adımda kurutma yeterli Kromatin yayılmasını sağlamak önemlidir. O zaman odası kapağını çıkarın ve slaytlar tamamen ek bir 30 dk kurumasını sağlar.
- Slaytlar (arkaya veya bir zikzak desen) % 0,4 fotoğraf-Flo 200/1 X PBS solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin ve slaytlar iki kez, 5 min yıka, yavaşça Coplin Tantanacı tarafından shaker dönen bir platform üzerinde kavanoz. Taze çözüm her yıkama için kullanın ve slaytlar her yıkama için farklı fareler ayrı kavanoz gelen tutmak.
- Coplin kavanozda % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O solüsyon 5 min için bir kez süre Tantanacı içeren slaytlar yıkayın.
- Coplin slaytlardan Kaldır (son yıkama) kavanoz, dikkatle kenarları ve dipleri aşırı sıvı kaldırmak için slaytları silin ve slaytlar kurumasını bir açılı, neredeyse dik konumda yer. Bu teknikte yetkin bir deneyci işlemek ve yüzey-yayılım çekirdeklerin 4 veya 5 fare--dan bir günde hazırlamak.
- Bir kez kuru (15-20 dk), işlem ayirt boyama veya mağaza-80 ° c ışık en fazla 2 hafta için korumalı bir sıkıca kapalı slayt kutusunda hemen slaytlarını (değerlendirilmekte; hedef proteinler bağlı olarak en iyi sonuçları elde aynı gün ya da 2 hafta içinde lekeli).
- -80 ° C'de depolanan, oda sıcaklığına kadar gelip 1 içeren bir Coplin kavanoza boyama önce 5 min için X PBS veya blok yıkayın slayt izin.
Not: Birçok farklı ayirt boyama protokolleri iyi sonuçlar sağlayacaktır; Berkowitz vd immunostaining Protokolü ' li8bakın.
- -80 ° C'de depolanan, oda sıcaklığına kadar gelip 1 içeren bir Coplin kavanoza boyama önce 5 min için X PBS veya blok yıkayın slayt izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem yüzey çok sayıda yayılmış olduğu gibi homologs içeren çekirdeklerin sağlama yeteneği üç ana faktöre bağlıdır: 1) seminifer tübüllerin Hipotonik arabelleği yeterince elde etmek için (yani HEB) uygun kuluçka süresi arttı spermatocyte patladı ama üzerinden parçalanmaya değil çekirdek kuluçka HEB, 2 içinde uzun süreli) micropipetting birlikte clumped değil çekirdek ve 3 ayrı bir askıya almak için hücreleri Sükroz damlacıkları) her sabitleştirici devirme kaplı bir defada tek bir yönde slayt ve ileri geri değil. Bir kez hazır, yüzey yayılmış çekirdeği immunostained proteinlere ilgi fluorescently etiketli antikorlar ile olabilir ve mikroskobu (temsilcisi örnek Resim 1 ve Şekil 2gösterilir. ile görüntülü Şekil 1 de (A), düzensiz immunostained, lime lime görünen homologs kuluçka gelen HEB çok uzun (B) nedeniyle içeren çekirdeklerin yayılır vahşi türü pachytene çekirdek örnekleri gösterir, kötü örtüşen çekirdeği (C) ve çekirdek içeren yayıldı "seminifer tübüllerin (D) overmincing" nedeniyle parçalanmış homologs. Çekirdeklerin profaz ana 5 substages temsil eden bir bolluk tekniği de gerçekleştirildiğinde, ben elde edilebilir. Şekil 2 profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis aşamaları gösterir ben vahşi türü spermatocytes gelen çocuk erkek çekirdekleri içinde.
Resim 1: Yüzey Juvenil fareler gelen vahşi türü spermatocytes çekirdekleri yayıldı.
Pachytene spermatocyte çekirdeği anti-hangi Aksiyel/lateral unsurları de yayılmış synaptonemal kompleksi (A) çekirdeği lekeleri SYCP3 ile (yeşil), lekeli. (B) çekirdeği seminifer tübüllerin üzerinden HEB çok uzun inkübe. (C) kötü örtüşen çekirdeği yayıldı. (D) parçalanmış homologs "(ok uçları iki küçük homolog parçaları belirtiniz) seminifer tübüllerin overmincing" nedeniyle. Ölçek çubuğu 5 mikron olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Örnek çekirdeği profaz substages ben.
Vahşi türü spermatocytes gelen çocuk erkek sentromerler lekeleri, CREST serum (kırmızı) ve anti-SYCP3 (yeşil), hangi synaptonemal kompleks Aksiyel/lateral unsurları lekeleri ile lekeli. Profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis aşamaları, sırasıyla, gösterilir. Ölçek çubuğu 5 mikron olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | Miktar | Son konsantrasyonu |
| 1 M Tris-Cl (pH 8.2) | 1,5 mL | 30 mM |
| Sükroz | 0.85575 g | 50 mM |
| TRISODYUM sitrat dihydrate | 0, 25 g | 17 mM |
| 0,5 M EDTA | 500 μL | 5 mM |
| Dithiothreitol (DTT) | 0.00385 g | 0,5 mM |
| 0,2 M Phenymethylsulfonyl florür (PMSF) | 25 μL | 0,1 mM |
Tablo 1: Tarifi Hipotonik ayıklama arabellek (HEB) için.
Reaktifler 50 mL ultrasaf laboratuvara su sınıf ve (gerekli 1 N NaOH çözüm veya 1 N HCl kullanıyorsanız) pH 8.2-8.4 ayarlamak ekleyin. Taze HEB hazır olun her zaman, buz üstünde tutmak ve hazırlık içinde 2 h kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralının en kritik adımlar de yaymak, iyi kalite spermatocyte çekirdek sayısının fazlalığı elde etmek için HEB, seminifer tübüllerin kıyma uygun seminifer tübüllerin uygun kuluçka süresi içerir ve tekniği istihdam Sükroz hücre süspansiyon sabitleştirici kaplamalı slaytları arasında yayıldı. Biz vahşi türü erkeklerin testis dan kıyaslanabilir yaşlı Chtf18iken HEB yetişkinlikte 45 dk için için doğum sonrası gün 15 arasında değişen testislerde tanısal yaklaşım üzerinden seminifer tübüllerin kuluçkaya-çünkü testis yarım boy ve içeren null fareler için sadece 30 dakika inkübe önemli ölçüde daha az germ hücreleri8. Bizim deneyim, kuluçka Chtf18-30 dk daha uzun kötü çözülmüş homologs kaynaklanan hücre bütünlüğünü tavizler için testis null. Seminifer tübüllerin sadece bir bulutlu Sükroz hücre süspansiyon elde etmek için kıyılmış ve her slayt (bkz: 2.10) yayılan önce sabitleştirici cömert bir damlacık içermesi gerekir. Slaytlar tek yönde vasıl a zaman ve değil ileri geri hareket ettirildiğinde. İdeal yöntemdir mayoz ben, ama bu büyük ölçüde profaz substages için sınırlı incelemektir ben. Ancak, çekirdek premeiotic S aşamasında, ı ve II gözlenen ve olmuştur metafaz7,9bildirdi.
Bu yetkinlik ve en iyi sonuçları elde etmek için biraz pratik gerektiren basit bir yöntemdir. Suboptimal sonuçlar birkaç farklı nedenlerle meydana gelebilir. Çekirdekleri de, kümelenmiş sonuçlanan veya hücreleri örtüşen yayılması değil. Bu Sükroz hücre süspansiyon değil yeterince pipetted veya çekirdekleri de yaymak için slayt üzerinde yeterli sabitleştirici değil oluşabilir. Slaytlar artık yeterli sabitleştirici ile kaplı değil veya hücre süspansiyon değil bir düz yönde slayt yayılmış veya sürekli olarak ileri geri yaymak, hücreler üst üste ve birlikte yığın. Seminifer tübüllerin "overminced" homologs parçalanmış veya biraz rendelenmiş görünür. Mutant testis daha küçük olabilir, daha az spermatocytes içeren ve "overmincing" veya seminifer tübüllerin parçalanma için daha duyarlı, çünkü ilk teknikte optimize etmek için denetim (örneğin vahşi türü) testis üzerinde birkaç kez uygulamak öneririz bir acemi elleri.
Yüzey yayılmış çekirdek anahtar yasal adımlar ve mayoz ilerleme incelemek için aynı zamanda farelerde segregasyonun fenotipleri karakterize etmek için kullanılan bir temel teknik hazırlanıyor. Bu nedenle, bu yöntemi yaygın olarak kullanın ve tüm yeni laboratuvar üyeler gerçekleştirmek nasıl öğretmek. Bu teknik hakim sonra sayısız diğer tekniklerin daha sonra ve o ile birlikte kullanılabilir. Örneğin, çeşitli immunostaining ve/veya mikroskopi widefield dahil veya confocal epifluorescence veya elektron mikroskopi gerçekleştirilebilir. Mayoz özel protein bileşenleri synaptonemal kompleks gibi eğitim ek olarak, bu gibi cohesins, SC ile uyum, aracılık multiprotein kompleksleri etkileşim ( 10,11 ' gözden değerlendirilebilir 12). DNA crossover oluşumu, işleme ve olgunlaşma olabilir ve ayrıca bu tekniği13ile okudu. İn addition, bu teknik yöntemleri belirli fare nüfusu spermatocytes elde etmek için takip yapılmıştır: 1) G2/MI geçiş ilerleme ikna etmek için okadaic asit spermatocytes kültürünü, artan sayıda verimli diplotene, diakinesis ve metafaz yayılır14,15 ve 2) sonra pachytene spermatocytes14zenginleştirilmiş bir nüfusu ayırmak için kullanılan bir yöntem.
Yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama tekniği tarif ve işte bir son derece kullanışlı ve basit tekniği gösterdi. Fareler bir model organizma kullanarak mayoz çalışmalar, ancak bazı uygulama ve en iyi sonuçları elde etmek için incelik gerektirir her laboratuvara özetin özeti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Abigail Harris teknik yardım kabul. Onlar da Paula Cohen ve Kim Holloway yüzeyine yayılmış çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama Protokolü optimize etmek için yardımcı olduğunuz için kabul. Yazarlar ayrıca el yazması Karen Schindler tarafından eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH R01 GM106262 için K.M.B. tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
