Summary
Мейоз является процесс развития, в которой формируются гамет через один раунд репликации ДНК и двух раундов хромосома сегрегации. Используя технику для подготовки meiotic хромосома спреды могут рассматриваться млекопитающих мейоз. Здесь мы демонстрируем способ подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Abstract
Млекопитающих мейоз представляет собой динамичный процесс развития, который происходит в зародышевых клеток и могут быть изучены и характеризуется. С помощью метода распространения ядер на поверхности слайдов (а не снижается их с высоты), мы показываем оптимизированный технику на мыши сперматоцитах, который был впервые описан в 1997 году. Этот метод широко используется в лабораториях для изучения млекопитающих мейоз, потому что он дает множество высокого качества ядер претерпевает подэтажи профаза I. семенных канальцев, сначала помещаются в гипотонический раствор к набуханию сперматоцитах. Затем сперматоцитах выпускаются в раствор сахарозы для создания суспензии клеток, ядер распространяются на фиксатор пропитанной стеклянных скольжениях. После иммуноокрашивания разнообразия белков уместны meiotic процессов может быть проверен. Например можно легко визуализировать белков синаптонемного комплекса, трехстороннюю структуру, которая соединяет хромосомы осей/ядер гомолог вместе. Meiotic рекомбинации белки, которые участвуют в ремонте двухнитевые разрывы ДНК, гомологичная рекомбинация, также может быть immunostained для оценки прогрессирования профазе I. Здесь мы опишем и продемонстрировать в деталях техника широко используется для изучения млекопитающих мейоза в сперматоцитах от несовершеннолетних или взрослых самцов мышей.
Introduction
Мышей широко используются как организм модель для изучения мейоза у млекопитающих. Можно оценить как нормальные процессы развития, так и дефекты, которые происходят во время мейоза. Сроки и прогрессии характерных особенностей, которые происходят в профазе I и подэтажи, а также множество специфических белков, участвующих в процессах решающее значение для регулирования мейоз можно охарактеризовать в дикого типа и мутантов мышей. Несколько специализированных процессов, которые происходят во время мейоза, который учился в деталях (обзор в Генделя и Schimenti1). К ним относятся формирование ДНК двухручьевой перерыв (DSB) и ремонт, рекомбинации, формировании синаптонемного комплекса и хромосомы сегрегации.
Важным аспектом изучения meiotic процессов является возможность изучения ядер, содержащий гомологичных хромосом, которые разрешаются визуально и оптически лучше различать и идентифицировать подэтажи профаза I. профазе I состоит из 5 подэтажи которые характеризуются конкретные функции, включая формировании синаптонемного комплекса (SC). СК является трехсторонняя белка эшафот, что позволяет сопряжения и ДНК двухручьевой перерыв ремонт гомолог. Во время leptonema гомолог выровнять изложенные осевой элементы СК. Затем вложения центральных элементов синаптонемного комплекса во время zygonema облегчает спаривания и физической связи (Синапсис) между парами гомолог. Во время pachynema Синапсис гомолог становится полным и ДНК кроссоверы формируются из ремонта выберите населения двухнитевые разрывы ДНК через гомологичная рекомбинация. SC дизассемблирует во время diplonema, позволяя гомолог desynapse, но остаются прикрепленными на их центромеры и на участках ДНК кроссоверы. Наконец, во время diakinesis, гомолог recondense и происходит переход к метафазы1.
Исторически, поверхность распространение meiotic хроматина принесли несколько ядер, особенно тех, кто с ранних стадиях профазе I2. В результате эти методы были изменены для улучшения разделения клеток тканей (то есть яички или яичников), методика распространения meiotic хроматина, а доходность meiotic ядер высокого качества для оценки2,3, 4. Кроме того, этот метод оказался полезным в сохранении ядерного и хроматина связаны белков в ядрах meiotic как свидетельствуют опубликованные immunolocalization методы5,6,7. Таким образом, метод первоначально описано Питерс2 и продемонстрировали здесь урожайности многих отдельных взрыв Сперматоцит ядер, содержащие гомолог переживает leptotene, zygotene, pachytene, diplotene и diakinesis подэтажи профаза я.
Методика подготовки поверхности распространение ядер (также называется хроматином распространение анализ) широко используется для изучения мейоза в областях репродуктивного здоровья и ячейки биологии. Слайды, содержащие поверхности распространение ядер может быть впоследствии immunostained с антителами к протеинов интереса или подвергнут Серебряный пятнать и затем анализируются с помощью микроскопии. Метод аналогичен для мужчин и женщин мышей, хотя для самок мышей2были описаны изменения. Важно, чтобы не overmince семенных канальцев. Ядра должны также распространяться таким образом, чтобы после гомолог иммуноокрашивания и связанные протеины отчетливо видны с микроскопией. Поверхность распространение ядра может быть подготовлен в течение нескольких часов и либо immunostained немедленно или температуре-80 ° C для максимум 3 недели до оттаивания и иммуноокрашивания. Однако оптимальные результаты получаются лучше всего для некоторых белков если иммуноокрашивания выполняется немедленно или в течение 2 недель подготовки поверхности распространение ядер. Слайды можно immunostained с стандартным протоколом, с использованием антител для протеинов интереса, следуют инкубации с конъюгированные для флуоресцентных белков вторичные антитела или красители, а затем образ с флуоресцентной микроскопии8. На послеродовом день 15-21 существует достаточно ткани на пару семенников дикого типа приносить слайды 6-10, и старых мышей (включая взрослых) даст больше слайдов. Однако мышей дикого типа 6 недель и старше также даст более пост meiotic клетки (то есть сперматид) на слайдах, после иммуноокрашивания. Кроме того все подэтажи профаза я можно наблюдать в отношении несовершеннолетних и взрослых мышей. Яички от мужчины на послеродовых дней 10 до 15 принесет много больше leptotene и zygotene клеток. Мышей старше послеродовой дня 14-15 принесет больше pachytene и diplotene ядер.
Здесь мы опишем и продемонстрировать широко используется метод подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, связанные с мышей использовать высокие этические и благополучия и были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на колледж медицины университета Дрексел.
1. Подготовка решений и инструментов, необходимых
- Подготовьте гипотонический извлечения буфер (иврит) в 50 мл сверхчистого лаборатория качества воды, рН 8,2-8.4 (таблица 1). Сделать решение свежий каждый раз, держать на льду и использовать в течение 2 ч подготовки спреды; Это необходимо для оптимизации сокращения и протеазы, препятствующих деятельности DTT и PMSF, соответственно. Для каждой пары яичках мыши используйте 10 мл Евр.
- Приготовляют раствор сахарозы 100 мм (свежий каждый раз), добавив 0,342 г сахарозы в 10 мл сверхчистого лаборатории класс воды. Отрегулируйте пэ-аш до 8.2
- Приготовляют раствор фиксаторные (1% параформальдегида (PFA), 0,15% Тритон X-100, рН, скорректированы 9.2 с 1 N HCl или N 1 NaOH) свежие ежемесячно и хранить его при комнатной температуре в защищенном от света. Разбавить 16% коммерчески доступных PFA начальный запас до 4% в 1 X PBS для использования в качестве рабочей, а затем хранить аликвоты 4% при температуре-20 ° C.
- Чтобы подготовить фиксирующие решение, добавить 10 мл 4% раствора PFA и 600 мкл 10% Тритон X-100 до 30 мл ПБС, хорошо перемешать и скорректировать рН 9.2 с 1 N HCl или N 1 NaOH. Фиксаторные решение Храните в 50-мл Конические трубки, завернутые в фольгу при комнатной температуре (для не более чем 4 недели).
- Подготовить Вымойте решения (в то время, как слайды сушки последние 30 минут) с фото-Flo 200: 0.4% фото-Flo 200/PBS (320 мкл фото-Flo 200 в 80 мл ПБС) и 0,4% фото-Flo 200/dH2O (160 мкл фото-Flo 200 в 40 мл воды класса сверхчистого лаборатории). Используйте опарник Coplin 50 мл, заполнены с 40 мл растворов для стирки 10 или меньше слайды одновременно.
- Подготовьте следующие документы: 1 пара хирургические ножницы (надрезать кожу), 1 пара штрафа отзыв хирургические ножницы (надрезать брюшины), 2 пары прямо штрафа отзыв щипцов (чтобы вскрыть из каждого яичка), 1 прямой край лезвия (для надрезать каждого яичка), 2 пары Изогнутый пинцет наконечник (для иммобилизации каждого яичка и выжать из семенных канальцев), баночки по 50 мл Coplin, тефлон печатных 3 кольцо слайды, 1 скальпеля с размер 11 лезвия, увлажненные камеры, Петри 100 x 15 мм, Постоянный маркер штрафа отзыв или карандаш и Шейкер вращающейся платформе.
- Место премиум незаряженных precleaned матовым конец стеклянных скольжениях вертикально в 50 мл Coplin кувшин наполнен фиксирующие решения до использования.
Примечание: Карандаш является предпочтительным, если слайды будут использоваться впоследствии в процедуры, требующие этанола, например флуоресценции в situ гибридизация.
- Место премиум незаряженных precleaned матовым конец стеклянных скольжениях вертикально в 50 мл Coplin кувшин наполнен фиксирующие решения до использования.
2. Сперматоцит ядер распространения
- Усыпить мужчины мыши согласно институциональных руководящих принципов (например, шейки матки дислокации с или без CO2 удушья).
- Использование P10 - P20 мужчины для оценки meiotic клетки в первой волне сперматогенеза; Мы постоянно используем P15 - P17 мужчин для получения клеток от всех подэтажи профаза I. предоставляемые взрослых яичек клетки от профаза, я тоже, но они также принесут более postmeiotic клеток, таких как сперматид.
- Урожай и весят семенников (запись парных весов); затем поместите их в чашку Петри, содержащие несколько капель холодной HEB, чтобы держать их влажными.
- Держите яички против нижней части блюдо с щипцы изогнутые наконечник и использовать прямой край лезвия бритвы, чтобы сделать небольшой вертикальной средней линии разреза через капсула яички. Пока все еще держащ яички против нижней части блюдо с одной щипцами, используйте второй набор изогнутый кончик щипцами или прямой край лезвия Осторожно выжать семенных канальцев от семенников.
- Поместите трубочки в 15 мл Конические трубки, содержащие 10 мл холодного HEB, заботясь, чтобы избежать положить куски капсулы в трубу. Повторите эти шаги с вторым яичком.
- Инкубируйте очищенные семенных канальцев в коническую пробирку, содержащую HEB на льду за 30-60 мин, в зависимости от размера яичек. Инкубировать семенных канальцев с пару семенников, весом 30 мг или менее 30 мин, трубочки с пару семенников, весом 31-50 мг за 30-45 минут и больше яичек на 60 минут. Не изменяйте значения времени для одного яичка.
Примечание: Оптимальной инкубации время может варьироваться в зависимости от опыта экспериментатора, реагентов, используемых, и мышей анализируются. - В то время как семенных канальцев инкубации в евр, используйте маркер или карандаш для обозначения матовое концы precleaned слайдов с помощью мыши, номер, номер слайда и дата. Затем поместите предварительно очищенных слайды в Coplin jar, содержащий фиксирующие решения.
- После инкубации Налейте трубочки и HEB чистой Петри и отдельные трубочки в приблизительно 3 мм диаметром сгустки. Каждый куст дает 2 горки и количество слайдов принесли зависит от размера яичек.
Примечание: Мы получаем 8 слайдов от дикого типа и 6 слайды из subfertile Chtf18-null P16 яичек (которые меньше благодаря снижению числа meiotic и митотического зародышевые клетки8). Ожидается, что один взрослый яички, весом 100 мг и более будет приносить 16 слайдов. - 23 место мкл раствора сахарозы 100 мм в одно кольцо тефлон печатных, 3 кольцо слайд и добавить один комок семенных канальцев в кольцо. Затем с помощью Изогнутый пинцет Совет провести комок, нежно фарш трубочки с лезвием размер 11 до тех пор, пока решение становится мутным.
Примечание: Не overmince как это приведет к фрагментации хромосом. Обратите внимание, что фрагментарный хромосом может быть также свидетельствует о черепашки фенотип. - Удаление мусора, еще 23 мкл раствора сахарозы и использовать микропипеткой, чтобы мягко Пипетка смеси вверх и вниз несколько раз, чтобы помочь отдельных клеток в суспензии.
- Удалить слайд, замачивания в Coplin jar, содержащий фиксирующие решения и наклона слайд над банку, так что один богатый капли собирает в нижнем углу слайда.
- Накапайте 20 мкл суспензии клеток сахарозы из кольца тефлон печатных 3 кольцо сползания фиксирующие капелька на премиум матовое стекло и пипетки подвески вверх и вниз 2 - 3 раза.
Примечание: Фиксирующие капелька должно быть достаточно большой объем, так что добавление 20 мкл суспензии клеток сахарозы к нему позволяет охват через весь слайд, когда смесь распределяется (см. ниже 2.11).
- Накапайте 20 мкл суспензии клеток сахарозы из кольца тефлон печатных 3 кольцо сползания фиксирующие капелька на премиум матовое стекло и пипетки подвески вверх и вниз 2 - 3 раза.
- Медленно наклоните слайд в сторону напротив капли для распространения суспензию клеток по длине слайда. Затем медленно наклоните слайд обратно для распространения суспензию клеток вдоль ширины слайда, чтобы покрыть ее полностью. Избегайте распространения подвески над той же области слайда более чем один раз иначе клетки будут пересекаться друг с другом.
- Сразу же место слайд квартиру в камере увлажненные и повторить шаги 2.8 до 2,11 до все кусты семенных канальцев были использованы для делать слайды. Важно не для перемещения увлажненные камеры во время процесса сушки, чтобы избежать перекрытия клетки и разрыву.
- Разрешить слайды для инкубации в камере покрыты увлажненной при комнатной температуре в течение 2,5 ч, так что они высыхают медленно и не полностью. Высокая влажность и медленного высыхания на этом этапе важно обеспечить надлежащее распространение хроматина. Затем снять крышку камеры и позволить слайды высохнуть полностью дополнительные 30 мин.
- Слайды (спина к спине или узором зигзаг) в опарник Coplin содержащих 0,4% раствор ПБС фото-Flo 200/1 и мыть дважды, слайды 5 мин, нежно агитацию Coplin банку на платформе вращение шейкер. Использовать свежие решения для каждого мыть и хранить слайды из разных мышей в отдельных банках для каждого из стирок.
- Вымойте слайды в Coplin jar, содержащий 0,4% фото-Flo 200/dH2O решение для 5 мин один раз во время агитацию.
- Удалить слайды из Coplin jar (последний мыть), тщательно протрите края и дно слайды, чтобы удалить лишнюю жидкость и место слайды на угловой, почти вертикально позиции для просушки. Экспериментатор, который владеет в этот метод может обрабатывать и подготовка поверхности распространение ядер из 4 или 5 мышей в один день.
- После высыхания (15-20 мин), процесс слайды сразу для иммунофлюоресценции пятнать или магазина на-80 ° С в плотно закрытой слайд ящик, защищенном от света для максимум 3 недели (в зависимости от оцениваемой; белков-мишеней оптимальные результаты могут быть получены при Витражи же день или в течение 2 недель).
- При температуре-80 ° C, затем позволяют слайды, чтобы прийти к комнатной температуре и мыть в опарник Coplin содержа 1 ПБС или блока за 5 мин до окрашивания.
Примечание: Многие различные иммунофлюоресценции пятная протоколы обеспечит хорошие результаты; обратитесь к Берковиц et al. для протокола иммуноокрашивания8.
- При температуре-80 ° C, затем позволяют слайды, чтобы прийти к комнатной температуре и мыть в опарник Coplin содержа 1 ПБС или блока за 5 мин до окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность этого метода для предоставления большого количества поверхности распространяться ядер, содержащие нетронутыми гомолог зависит от трех основных факторов: 1) соответствующие инкубации время семенных канальцев в гипотонический буфера (т.е. Евр.) для получения адекватного пополнили Сперматоцит ядра, которые лопаются, но не разрушаются от длительного инкубации в евр, 2) micropipetting сахарозы капельки клеток для получения суспензию ядра, которые не сгруппировать вместе, и 3) каждый Фиксатор наклона покрытием слайд в одном направлении за один раз и не взад и вперед. После подготовки поверхности ядра может быть immunostained с дневно обозначенные антитела для протеинов интереса и затем образы с помощью микроскопии (представитель примеры приведены на рисунке 1 и на рисунке 2. Рисунок 1 показывает примеры дикого типа pachytene ядер, которые являются хорошо распространение (A), ядер, содержащие неравномерно immunostained, драный появляясь гомолог благодаря инкубации в Евр слишком долго (B), плохо распространение перекрывающихся ядер (C) и содержащий ядер фрагментированные гомолог благодаря «overmincing» из семенных канальцев (D). Когда метод выполняется хорошо, множества ядер, представляющих основные 5 подэтажи профаза я можно получить. Рисунок 2 демонстрирует leptotene, zygotene, pachytene, diplotene и diakinesis этапов профазе I в ядрах дикого типа сперматоцитах от несовершеннолетних мужчин.
Рисунок 1: Поверхность распространение ядер дикого типа сперматоцитах от несовершеннолетних мышей.
Pachytene Сперматоцит ядер окрашивали с анти SYCP3 (зеленый), который пятна осевой/боковые элементы синаптонемного комплекса (A) хорошо распространение ядер. (B) ядра от семенных канальцев инкубировали в Евр слишком долго. (C) плохо распространение перекрывающихся ядер. (D) разрозненных гомолог благодаря «overmincing» из семенных канальцев (стрелки указывают две небольшие гомолога фрагментов). Линейки-5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Примеры ядер от подэтажи профазе I.
Дикого типа сперматоцитах от несовершеннолетних мужчины были окрашенных с ГРЕБНЕМ сыворотки (красный), который пятна центромеры, и анти SYCP3 (зеленый), который пятна осевой/боковые элементы синаптонемного комплекса. Leptotene, zygotene, pachytene, diplotene и diakinesis профаза, соответственно, отображаются этапы. Линейки-5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Количество | Конечная концентрация |
| 1 М трис-Cl (рН 8,2) | 1,5 мл | 30 мм |
| Сахароза | 0.85575 g | 50 мм |
| Тринатрия цитрат дигидрат | 0,25 г | 17 мм |
| 0.5 М ЭДТА | 500 МКЛ | 5 мм |
| Дитиотреитол (DTT) | 0.00385 g | 0,5 мм |
| 0,2 М Phenymethylsulfonyl фторид (PMSF) | 25 МКЛ | 0,1 мм |
Таблица 1: Рецепт гипотонический извлечения буфер (Евр).
Добавление реагентов для сверхчистого лаборатории 50 мл класс воды и приспособиться к рН 8,2-8.4 (при необходимости использовать 1 N NaOH раствора или 1 N HCl). Подготовьте свежие HEB каждый раз, держать на льду и использовать в течение 2 ч подготовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для получения большого количества ядер Сперматоцит хорошо спред, хорошее качество, наиболее важные шаги настоящего Протокола включают соответствующие инкубации время семенных канальцев в евр, соответствующие фарша из семенных канальцев, и техника, используемых для Суспензию клеток сахарозы распространился фиксирующие покрытием слайды. Мы инкубировать семенных канальцев от семенников дикого типа мужчин, начиная от послеродового день 15 до совершеннолетия в Евр 45 мин, а яички от соответствующе возрасте Chtf18-null мышей инкубируют всего 30 мин, потому что половина размера яичек и содержат значительно меньше клетки семенозачатка8. По нашему опыту, инкубации Chtf18-null яичек для больше чем 30 мин подрывает целостность клеток, что приводит к плохо решен гомолог. Семенных канальцев фарш только для получения суспензии клеток облачно сахарозы, и каждый слайд должен содержать щедрой капли фиксатор до распространения (см. 2.10). Слайды наклонены в одном направлении, в то время и не взад и вперед. Этот метод идеально подходит для изучения мейоз, я, но она ограничена во многом подэтажи профаза я. Однако ядер в premeiotic S-фазе, метафазы I и II можно наблюдать и были сообщил7,9.
Это простой метод, который требует некоторой практики, чтобы получить компетенцию и лучшие результаты. Субоптимальные результаты может произойти по разным причинам. Ядер может не быть хорошо распространение, приводило кластеризованным или ячейки перекрываются. Это может произойти, если сахарозы суспензию клеток не накапаны адекватно или нет достаточно фиксатором на слайд, чтобы распространять ядер хорошо. Если слайды не покрыты с достаточно остаточные фиксатором или суспензию клеток не распространился на слайд в одном направлении гладкая или повторно распространять взад и вперед, клетки перекрываются и слипаются. Если семенных канальцев являются «overminced» гомолог может быть раздроблена или появляются несколько измельченных. Потому что мутантный яичек может быть меньше, содержат меньше сперматоцитах и более восприимчивы к «overmincing» или фрагментации семенных канальцев, мы рекомендуем тренируется несколько раз на яичках управления (например, дикого типа) для оптимизации технику в руки новичком.
Подготовка поверхности распространение ядер является основных техника, используемая для изучения ключевых нормативных мер и прогрессирования мейоз, а также охарактеризовать meiotic фенотипов мышей. Таким образом мы используем этот метод широко и научить все новые члены лаборатории для выполнения его. Как только освоил эту технику, множество других методов могут использоваться впоследствии и совместно с ним. Например, несколько видов иммуноокрашивания или микроскопия включая widefield или конфокальный эпифлуоресцентного, или электронная микроскопия могут быть выполнены. Помимо изучения мейоз специфических белков, таких как компоненты синаптонемного комплекса, тех, кто взаимодействует с ПК, таких как cohesins, multiprotein комплексы, которые посредником сплоченности, может оцениваться (обзор в 10,11 12). Регулирование кроссовер образование, обработка и созревания ДНК может быть и также были изучены с этой техникой13. In addition, эта техника была выполнена после использования методов для получения конкретных популяций мыши сперматоцитах: 1) после культуры сперматоцитах в okadaic кислоты, чтобы побудить прогрессии G2/ми перехода, уступая увеличение числа diplotene, diakinesis и я спреды,14,15 и 2 метафаза) после методы, используемые для изоляции обогащенного населения pachytene сперматоцитах14.
Техника подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах описал и продемонстрировал, что здесь является чрезвычайно полезным и простым методом. Это типичный для каждой лаборатории, которая изучает мейоз, используя мышей в качестве модельного организма, но требует некоторых практики и утонченность для достижения наилучших результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают технической помощи Abigail Харрис. Они также признают Паула Коэн и Ким Holloway для помогая оптимизировать протокол подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах. Авторы также признательны критических чтении рукописи, Карен Schindler.
Эта работа была поддержана NIH R01 GM106262 для K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
