Summary
هنا، استخدمت السلطة من الإدراج عشوائي ينقول بوساطة عنصر الحمض النووي غير الترميز حل موقفها صبغية أمثل.
Abstract
كان المواقف صبغية أمثل لعنصر محدد من الحمض النووي/هي التي تحدد الإدراج عشوائي بوساطة ينقول متبوعاً بالتحديد اللياقة البدنية. في البكتيريا، يمكن أن يكون أثر سياق الوراثية على وظيفة عنصر الوراثية صعوبة تقييم. عدة آليات، بما في ذلك آثار طوبولوجي، تدخل النسخي من الجينات المجاورة، و/أو جرعة الجينات المرتبطة النسخ المتماثل، قد تؤثر على وظيفة عنصر وراثية معينة. هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح بإدماج عنصر الحمض النووي عشوائي في كروموسوم الإشريكيّة القولونية وتحديد المواقع الأكثر ملائمة مسابقة نمو بسيط باستخدام التجربة. الأسلوب الذي يستفيد من نظام قائم على أساس ينقول وصف جيد للإدراج عشوائية، إلى جانب مجموعة مختارة من clone(s) الأصلح بميزة النمو، هو إجراء قابل للتعديل بسهولة إلى الاحتياجات التجريبية. ويمكن تحديد طبيعة clone(s) الأصلح بتسلسل الجينوم كلياً على سكان متعددة الاستنساخ معقدة أو بالجينات من السهل سيرا على الأقدام للتعرف السريع على استنساخ المحدد. هنا، كمنطقة الحمض النووي غير الترميز DARS2، التي تتحكم في بدء النسخ المتماثل كروموسوم في كولاي، على سبيل مثال. وظيفة DARS2 المعروف أن تتأثر بالجينات المرتبطة بتكرار الجرعة؛ يحصل توثيق DARS2 الأصل لتكرار الحمض النووي، فإنه يصبح أكثر نشاطا. تم إدراج DARS2 عشوائياً في الكروموسوم من DARS2-حذف السلالة. المستنسخين الناتجة التي تحتوي على الإدخالات الفردية المجمعة وتتنافس ضد بعضها البعض لمئات الأجيال. وأخيراً، تتسم المستنسخين الأصلح وتبين تحتوي على DARS2 إدراجها بالقرب من الموقع الأصلي DARS2 .
Introduction
يمكن أن تتأثر وظيفة أي عنصر الوراثية إلى موقعها في الجينوم. في البكتيريا، وهذا ينتج أساسا من التدخل بالنسخ من الجينات المجاورة والمحليه الحمض النووي طبولوجيا الجرعة الجينات المرتبطة بالنسخ المتماثل. على وجه الخصوص، تخضع عمليات النسخ المتماثل للحمض النووي والعزل، على الأقل في جزء، وحسب المناطق الكروموسومات غير الترميز1، ووظيفة مناسبة لهذه المناطق يعتمد على السياق/موقع جينومي. في القولونية، هي أمثلة على الموقع التنمية المتكاملة للأسرة ، والمطلوبة للأخت كروموسوم القرار2؛ تسلسلات كوبس، المطلوبة ل العزل الصبغي3؛ ومن البيانات، DARS1، ومناطق DARS2 ، اللازمة لمراقبة النسخ المتماثل الصبغية السليم (أدناه؛ 4)-نقدم وسيلة تسمح بنقل عشوائي، واختيار، وتحديد سياق الجينية المثلى لأي عنصر من عناصر وراثية معينة، يتجلى هنا في دراسة المنطقة غير الترميز DARS2 .
في دنا كولاي، هو البادئ البروتين مسؤولة عن حبلا الحمض النووي فتح في النسخ المتماثل واحد المنشأ، أوريتش، وعن تجنيد هيليكاز دناب5،،من67. دنا ينتمي إلى AAA+ (أي، أتباسيس المرتبطة بأنشطة متنوعة) البروتينات ويمكن ربط ATP و ADP مع ارتفاع مماثل الانتماءات5. مستوى دناATP إلى الذروة في بدء8، حيث يشكل دناATP مولتيمير على أوريتش التي يطلق الحمض النووي الافتتاحية المزدوجة9. وبعد البدء، أوريتش غير متوفرة مؤقتاً لبدء إعادة سبب تنحية تقدمت إليه تشمل ربط البروتين سيكا إلى هيميميثيلاتيد أوريتش10،11. أثناء الحجز، يتم تخفيض مستوى دناATP بآليات اثنين على الأقل: المنظمة التنظيمية دنا (رضا)12،13 و البيانات-تعتمد دناATP التحلل المائي (دة)14 ،15. رضا وده تشجيع تحويل دناATP إلىADPدنا. قبل جولة جديدة من البدء، دناADP إعادة تنشيط دناATP في تسلسل إعادة تنشيط دنا معين (درس):16، DARS1 و DARS217. الصبغية البيانات، DARS1،DARS2 و المناطق هي غير الترميز وتتصرف بطريقة شبيهة بوصي تعدل دناATP/DnaAشرطة إينتيركونفيرسيون. هذه المناطق، يقع خارج أصل النسخ المتماثل، تمكين الجمعية دنا المعقدة أما المنظمة (بيانات؛ 14) أو التنشيط (DARS1 و DARS2؛ 17) من دنا. حذف DARS2 في زنزانة لا يغير جماعية مضاعفة الوقت ولكن النتائج في النسخ المتماثل غير متزامنة الشروع في15،،من1618. ومع ذلك، DARS2-تحتوي الخلايا قاصرة على اللياقة بدنية التكلفة مقارنة wildtype وأﻻ اسوي كلا المنافسة النمو المستمر في المتوسط غنية أو أثناء إقامة الاستعمار في الأمعاء الفأر18. وهذا يشير إلى أن تغييرات طفيفة حتى في تركيز أسينتشروني/الأصل له تأثير سلبي على اللياقة البدنية البكتيرية. كولاي، هناك ضغط انتقائي للحفاظ على التماثل (أي سنتين تقريبا متساوية الطول النسخ المتماثل الأسلحة) كروموسوم19. البيانات، و DARS1، ومناطق DARS2 بنفس المسافة النسبية أوريتش في جميع كولاي تسلسل السلالات18، على الرغم من الاختلافات الكبيرة في حجم الكروموسوم.
هنا، نحن استخدام منطقة DARS2 كولاي كمثال لتحديد المواقف صبغية أمثل لوظيفتها. تم إدراج DARS2 في ينقول نكبور، ونكبور الناتجة:: ينقولDARS2 بعد ذلك إدراج عشوائياً في جينوم MG1655 ΔDARS2. نحن وبالتالي إنشاء مجموعة من الخلايا، ووضع كل حيازة DARS2 في موقع مختلف على الكروموسوم. وأجرى في المختبر منافسة تجربة، حيث تجمع كافة الخلايا في جمع وتنافس ضد بعضها البعض من خلال النمو المستمر في رطل أجيال ما يقدر 700،. التجربة المنافسة تم رصد/تحديد النتائج استخدام الجنوب وصمة عار والمشي السهل الجينات وتسلسل الجينوم الجامع (WGS؛ الشكل 1). استنساخ نقطة النهاية حلها بالمشي الجينات سهلة اتسمت بالتدفق الخلوي لتقييم المعلمات دورة الخلية. في تحليل تدفق سيتوميتريك، ويمكن قياس حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي وبدء التزامن لعدد كبير من الخلايا. أثناء التدفق الخلوي، تدفقا للخلايا المفردة يمر شعاع ضوء من الطول الموجي المناسب لإثارة الحمض الخلوي الصبغي الملون، ثم مسجلة من فوتومولتيبليرس التي تقوم بجمع الأسفار المنبعثة، مقياسا لمحتوى الحمض النووي، وفي وقت واحد شريطة خلايا ملطخة للحمض النووي. على ضوء متناثرة إلى الأمام مقياس للخلية الجماعية20.
ويستخدم في المختبر المنافسة التجربة نحن الحاضرين هنا لمعالجة المسائل المتصلة بأهمية الموقف الصبغية وسياق عنصر الوراثية الجينوم. الأسلوب غير متحيز وسهلة الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-مجموعة "المكتبة ينقول"
ملاحظة: تم استنساخ موضع DARS2 الصبغية في تينيسي ميني 10-أساس ينقول، نكبور (في بنكبور) 21، مما أدى إلى نكبور:: DARS2 (pJFM1). ويمكن الحصول على الإنترنت 22 بنكبور. بنكبور هو ناقل على أساس R6K انتحارية التي تتطلب π البروتين البادئ للنسخ المتماثل 23. ولذلك pJFM1 بلازميد قادرة على تكرار في كولاي سلالة (مثلاً، Dh5α بير λ) تحتوي على نسخة الكروموسومات الجينات شرطة التدخل السريع. ومع ذلك، عندما تتحول wildtype تفتقر إلى بير MG1655 pJFM1، pJFM1 لا يمكن نسخ، المؤدية إلى الاختيار من الحيوانات المستنسخة كاناميسين المقاوم المتولدة عن الملاحق عشوائية من نكبور:: DARS2 في الكروموسوم البكتيري. للبساطة، وهذه هي المشار إليها كعمليات الإدراج DARS2. انظر الشكل 1 لعرض تقديمي تخطيطي المنهجية.
- Δ اليكتروكومبيتينت MG1655 تحضير DARS2 من تزايد نشاط الخلايا في ليسوجيني مرق (رطل) نمت في 37 درجة مئوية 24-
- اليكتروبوراتي pJFM1 في Δ اليكتروكومبيتينت MG1655، DARS2 ذكر جونزاليس et al. 24
- إضافة 1 ميكروغرام من pJFM1 (في 1 ميليلتر من الماء) إلى 40 ميليلتر من Δ اليكتروكومبيتينت MG1655 كولاي DARS2 ونقل هذا الخليط إلى ومبومو فجوة 0.2 سم مبردة مسبقاً، وعقيمة. إدراج في ومبومو في قاعة انهانسر. اليكتروبوراتي في 18 كيلو فولت و 500 Ω µF 25؛ يجب أن يكون وقت ثابت ~5.0 مرض التصلب العصبي المتعدد، والانحناء لا ينبغي أن يحدث.
- بسرعة استرداد تعليق البكتيرية التي ريسوسبيندينج أنه في 1 مل مرق LB المعالجون مسبقاً ونقل إلى أنبوب اختبار 15 مل. واسمحوا
- الخلايا استرداد التي تفرخ تحت ظروف النمو الخلوية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، دون اختيار المضادات الحيوية. لوحة البكتيريا على لوحات أجار رطل وتستكمل مع كاناميسين 50µg/mL واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- عد المستعمرات من انهانسر: يعتبر مستعمرة واحدة يساوي واحد ينقول صبغية الإدراج.
ملاحظة: يمكن أن تحسب المستعمرات بالعين المجردة أو بعداد مستعمرة. عدد المستعمرات تناسبا عكسيا مع متوسط المسافة التي تفصل ترانسبوزونات الموجود في الكروموسوم من كل استنساخ. - إضافة 1 مل من مرق رطل لكل لوحة ويغسل جميع المستعمرات؛ 1 مل مرق LB ينبغي أن يكون كافياً يغسل ~ 100,000 المستعمرات. إعادة استخدام نفس 1 مل من مرق رطل لزيادة تركيز البكتيريا. تجمع جميع المستعمرات في أنبوب 50 مل نفسه.
- دوامة الأنبوب وتجميد المواد ابدأ (t = 0). لتجميدها، مزيج 1 مل تعليق خلية مع 1 مل والغليسيرول 50% على الجليد. نقل الأنابيب الجافة الثلج لمدة 10 دقائق. حالما يتم تجميد الثقافات، نقلها إلى ثلاجة-80 درجة مئوية.
ملاحظة: تركيز خلية من 50,000 زيمبابوي/مل كحد أدنى من المتوقع في هذه الخطوة.
2. تجربة المنافسة في رطل
- ذوبان المكتبة ينقول من-80 درجة مئوية على الجليد. مزيج من بيبيتينج-
- نقل 100 ميليلتر من المكتبة ينقول إلى 10 مل رطل في أنبوب اختبار 15 مل.
- تنمو الخلايا، والرغوة بالهز المستمر (250 لفة في الدقيقة)، عن ح 8 في 37 درجة مئوية للمرحلة ثابتة (أي OD 600 = ~ 4.0). ضبط هذه المعلمات لظروف مختلفة للنمو، كما هو مطلوب. نشر
- سكان الجرثومي بنقل مستمر في المتوسط بريوارميد جديدة كل الأجيال ~ 10. القيام بذلك بنقل 10 ميليلتر من ثقافة المرحلة السابقة الثابتة إلى 10 مل رطل الطازجة والمتنامية لآخر 8 ح إلى مرحلة ثابتة (أي OD 600 = ~ 4.0).
ملاحظة: حسب الكثافة البصرية البداية والنهاية هي نفسها، إضعاف 1,000-fold يناظر ~ 10 أجيال نمو (2 10 = 1,024). سكان الجرثومي يمكن أما نشرها مباشرة في المتوسط بريوارميد الطازجة أو المحفوظة في 0-4 درجة مئوية (على الجليد) ونشرها في اليوم التالي. رطل واستخدمت هنا لضمان أكبر عدد من دوبلينجس الخلوية في أقصر وقت ممكن (وقت مضاعفة ما يقرب من 22 دقيقة)- - بعد كل الأجيال 100 من المنافسة، حفظ خمس عينات 1 مل في-80 درجة مئوية (كما هو موضح في الخطوة 3، 3)-
- إذا اللياقة البدنية الاختلافات بين الخلايا التي تحتوي على عمليات الإدراج ينقول الفردية يتوقع أن تكون صغيرة، والحفاظ على مدة المنافسة منذ فترة طويلة؛ وهنا، 700 الأجيال (t = 700) استخدمت.
3. تحليل لطخة الجنوبية لرصد "تجربة المنافسة على مر الزمن"
- إعداد التحقيق للجنوب وصمة عار (القسم 1-كيلو بايت نكبور) بأداء بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) التضخيم باستخدام كبسولة تفجير محددة: NKBOR_Probe_FW : جاتجتجاكجاجتكجات و NKBOR_Probe_RV: كجتاكاتكككتجكتجت-
- إينكوباتي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تمسخ الأولى. ثم، تنفيذ دورات 35 عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، و 72 درجة مئوية ل 45 s. للتمديد النهائي، استخدام 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10
ملاحظة: القالب لتفاعل PCR كان بلازميد بنكبور المنقي 21- - تسمية الجزء PCR الناتجة مع داتب [α-32 ف] استخدام نظام التمهيدي عشوائي، وفقا لسميث 25-
- إينكوباتي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تمسخ الأولى. ثم، تنفيذ دورات 35 عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، و 72 درجة مئوية ل 45 s. للتمديد النهائي، استخدام 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10
- تحضير الحمض الخلوي مجموع وفقا Løbner-اوليسن وفريسليبين فون 26 ل t = النقاط الزمنية 0 والمحدد حتى t = 700 تقدر الأجيال المنافسة.
- هضم الحمض النووي الخلوي المجموع مع بفو الأول، الذي يقطع نكبور التي تحتوي على المنطقة للفائدة مرة واحدة فقط في منطقة لا تغطيها التحقيق؛ والوحدة 1 من بفو أنا يمكن استخدامها تماما هضم 1 ميكروغرام من الركازة الحمض النووي-
ملاحظة: أن التحقيق سوف تعترف الشظايا التي تحتوي على جزء من ينقول، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الكروموسومات ذات أطوال مختلفة، اعتماداً على موقع الإدراج. - أداء حركتك الجنوبية استخدام 0.7% [اغروس] هلام وفقا Løbner-اوليسن وفريسليبين فون 26-
4. تحديد المستنسخين الأصلح
- استخدام الجينات السهل سيرا على الأقدام، كما وصفها هاريسون et al. 27، لتحديد مواقع الإدراج DARS2 من استنساخ واحد (معزول في لوحات رطل) بعد أجيال ما يقدر 700 من المنافسة؛ عصابات أكثر في الجنوب وصمة عار، يلزم يعزل أكثر لتغطية جميع الملاحق ينقول.
- عزل الدنا الجينومي لقالب PCR. انتشار البكتيريا على صفيحة أجار رطل يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تنمو المستعمرات واحدة بين عشية وضحاها في مرق رطل في 37 درجة مئوية في وقت لاحق نقل ميليلتر 20 إلى 200 ميليلتر من الماء المقطر يعقم (أو استخدام تنقية الحمض النووي، كما هو الحال في الخطوة 3، 2).
- دوامة المزيج. تسخين المزيج عند 100 درجة مئوية لإنقاذ 10 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة للحد الأدنى 5 الخلية ليساتي في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل-
- تصميم ثلاث الإشعال المتداخلة يصلب داخل ينقول الاختيار (انظر الشكل 2 لتمثيل رسومي لاستراتيجية PCR).
ملاحظة: تصميم "كبسولة تفجير متداخلة" ينبغي ضمان أن تتداخل التمهيدي 3 تقع الأقرب إلى 5 المعروفة ' نهاية ينقول الحمض النووي، تليها متداخلة 2 كبسولة تفجير و 1. التباعد بين متداخلة التمهيدي 3 و 5 ' نهاية تي المعروفةرانسبوسون الحمض النووي ينبغي أن يكون كافياً للقراءة تسلسل من الحمض النووي المعروف بالحمض النووي غير معروف (العثور على موقع الإدراج ينقول صبغية معينة). واستخدمت نكبور الإشعال المتداخلة التالية: pNKBOR_Nested3_RV: جكاججكتتاتجاتككا، pNKBOR_Nested2_RV: تكاجكاكاككتكتكاكج، و pNKBOR_Nested1_RV: أكتتتكتجكتجاتجاتج. كما تستخدم كبسولة تفجير عشوائية تتضمن الاعتراف بالمواقع المعروفة تقييد الإنزيمات. لضمان نتيجة لذلك، يجب استخدام أحد كبسولة تفجير عشوائية مختلفة اثنين على الأقل. تقييد مواقع إنزيمات التقييد (e.g.,Sau 3AI و هين ديي) يجب أن يكون موجوداً في ال 3 ' إنهاء ومسبوقة بعشر قواعد عشوائية حتى أن 5 '-ننننننننننجاتك-3 ' و 5 '-نننننننننناجكت-3 ' هي كبسولة تفجير تحتوي على موقع 3AI ساو (جاتك) وموقع ديي هين (آجكتت)، على التوالي، حيث ن = A, T, G أو جيم - استخدام 200 نانوغرام من الحمض النووي في 20 ميليلتر بكر رد فعل. احتضان عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تمسخ الأولى. إجراء دورات 25 عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة 4. للتمديد النهائي، استخدام 72 درجة مئوية لاستخدام الحد الأدنى 10 التمهيدي أزواج تتكون من 1 التمهيدي متداخلة وواحدة من الإشعال العشوائي.
- باستخدام أزواج التمهيدي تتكون من 2 التمهيدي متداخلة ونفس التمهيدي عشوائية من التضخيم الثانية، استخدام 1 ميليلتر من فعلها السابقة كقالب.
- كرر الخطوة 4.1.4 مع أزواج التمهيدي تتكون من 3 التمهيدي متداخلة والتمهيدي عشوائي نفس.
- تشغيل المنتجات من تفاعل PCR النهائي على 1.5% [اغروس] هلام ووصمة عار مع اثيديوم بروميد. قطع عصابة في النطاق 100-800 شركة بريتيش بتروليوم، وعزل الحمض النووي باستخدام أي جل الحمض النووي التجاري استخراج عدة وفقا للشركة المصنعة ' الاتجاه s. ريسوسبيند الحمض النووي في 15 ميليلتر من الماء.
ملاحظة: الحذر. اثيديوم بروميد سامة ويجب التعامل معها بحذر- - تسلسل الفرقة معزولة في الخطوة السابقة (الخطوة 4.1.6)، مع 3 التمهيدي متداخلة كتسلسل التمهيدي، استخدام سانغر التسلسل في موفر تجارية-
- عزل الدنا الجينومي لقالب PCR. انتشار البكتيريا على صفيحة أجار رطل يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تنمو المستعمرات واحدة بين عشية وضحاها في مرق رطل في 37 درجة مئوية في وقت لاحق نقل ميليلتر 20 إلى 200 ميليلتر من الماء المقطر يعقم (أو استخدام تنقية الحمض النووي، كما هو الحال في الخطوة 3، 2).
- أداء WGS.
- WGS أداء مجموع استخراج الحمض النووي من تحديد العينات التي تم جمعها من خلال التجربة بالمنافسة، كما وصفها فريموت مولر وآخرون 4-
- إجراء تحليل التسلسل.
- يقرأ نهاية الاقتران على محاذاة إلى 150 نانوثانية متجاورة إلى نكبور، AF310136.1 1,904 … 2,204 باستخدام Bowtie2 28 مع فاصل زمني بين السلاسل الفرعية البذور (S، 1، 1، 15) والحد أقصى لعدد الأحرف الغامضة (ل، 0، 0.9).
- حدد ما يلي تمت محاذاته، وثم إعادة محاذاة لكلا ref MG1655 | NC_000913.3 ونكبور جيجابايت | AF310136 باستخدام بلاستن 29
- تعيين تبديل المواقف الإدراج في تقاطعات MG1655-نكبور-
5. التدفق الخلوي
- جمع عينات للتدفق الخلوي-
- رصيد كل ثقافة بالإبقاء عليه في مرحلة النمو الأسى للأجيال 10 على الأقل. تحقق OD 600 والتأكد من أنه لم يتجاوز 0.3-
- جمع نوعين من عينات التدفق.
- للريف-تحكم مركب، نقل 1 مل ثقافة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 30 ميليلتر من الريف-مركز دراسات الحدود (300 ميكروغرام/مل والريفامبيسين وسيفاليكسين 36 ميكروغرام/مل يذوب في هيدروكسيد الصوديوم 12.5 ملم). اتركه في 37 درجة مئوية للحد ني ح 4 الهز.
ملاحظة: كتل الريفامبيسين غير مباشر بدء النسخ المتماثل كروموسوم بينما يسمح لجولات مستمرة للنسخ المتماثل الاستمرار في إنهاء. سيفاليكسين يمنع انقسام الخلايا، مما يؤدي النسخ المتماثل تحكم مركب (ريف-تحكم مركب) وتراكم الخلايا مع الكروموزومات متماثلة تماما. عدد الكروموسومات منسوخة تماما مساو لعدد الأصول في وقت المعاملة مع الريفامبيسين وسيفاليكسين 20- - للحصول على نموذج أكسب، نقل 1 مل تنامي الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل على مدت أضعافاً مضاعفة
- للريف-تحكم مركب، نقل 1 مل ثقافة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 30 ميليلتر من الريف-مركز دراسات الحدود (300 ميكروغرام/مل والريفامبيسين وسيفاليكسين 36 ميكروغرام/مل يذوب في هيدروكسيد الصوديوم 12.5 ملم). اتركه في 37 درجة مئوية للحد ني ح 4 الهز.
- إصلاح الخلايا كما يلي. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من المثلج 10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5 درجة مئوية. وإضافة 1 مل من المثلج 77% إيثانول. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
- وصمة عار الخلايا كما يلي. حصاد 100-300 ميليلتر من الخلايا الثابتة باستخدام الطرد المركزي في 15,000 س ز على 15 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 130 ميليلتر من " الحل تلطيخ DNA " (90 ميكروغرام/مل ميثراميسين، 20 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد، 10 مم مجكل 2 ، و 10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5). وضع العينات في الثلج وفي الظلام؛ العينات على استعداد لتحليل التدفق الخلوي بعد 10 دقيقة
ملاحظة: بقع أخرى الحمض النووي من اثيديوم بروميد وميثراميسين يمكن أيضا أن تستخدم 30 ، 31- - تحديد منشأ كل خلية وكتلة الخلية النسبي ومحتوى الحمض النووي النسبي بتحليل التدفق الخلوي-
- إجراء التدفق الخلوي، كما هو موضح سابقا 32. تشغيل تحكم مركب الريف واكسب-العينات باستخدام الشركة المصنعة سيتوميتير تدفق ' s تعليمات . للخلايا ميثراميسين--واثيديوم بروميد الملون، استخدام الإثارة أطوال موجية 395 و 440 نانومتر وجمع الأسفار أعلاه 565 نانومتر.
- لتحديد الخلية النسبي الشامل والنسبية الحمض النووي المحتوى، تشغيل EXP-العينات للحصول على معلمة واحدة إلى الأمام-الضوء المبعثر مقابل المدرج الإحصائي رقم الخلية وكثافة fluorescence مقابل المدرج الإحصائي رقم الخلية للحد ني أحداث 30,000 المقابلة لإشارة الخلية.
- استخدام منتشرة في الأمام الخفيفة معلمة واحدة التوزيع لقياس نسبة متوسط الخلية ماساشوستس
ملاحظة: الضوء المتناثرة إلى الأمام مقياس ل متوسط الخلية الجماعية 20- - استخدام fluorescence كثافة توزيعات معلمة واحدة لقياس الحمض النووي متوسط محتوى 20-
- الحصول على تركيز الحمض النووي كالنسبة من متوسط محتوى الحمض النووي ل أسلحة خلية متوسط 20-
- تحديد عدد أصول كل خلية.
- تشغيل الريف-تحكم مركب العينات للحصول على كثافة fluorescence معلمة واحدة مقابل الخلية المدرج الإحصائي رقم للحد ني أحداث 30,000 المقابلة لإشارة الخلية.
- استخدام fluorescence كثافة توزيعات معلمة واحدة لتحديد عدد الكروموسومات في كل خلية 20-
- إجراء التدفق الخلوي، كما هو موضح سابقا 32. تشغيل تحكم مركب الريف واكسب-العينات باستخدام الشركة المصنعة سيتوميتير تدفق ' s تعليمات . للخلايا ميثراميسين--واثيديوم بروميد الملون، استخدام الإثارة أطوال موجية 395 و 440 نانومتر وجمع الأسفار أعلاه 565 نانومتر.
- حساب مؤشر أسينتشروني (منظمة العفو الدولية)-
- حساب منظمة العفو الدولية، كما وصفها اوليسن Løbner et al. 32، استخدام التوزيعات معلمة واحدة fluorescence كثافة العينات تحكم مركب الريف ومنظمة العفو الدولية الصيغة = (f3 + f5 f6 + f7)/(f2 + f4 + f8)، حيث أن العملات الأجنبية هو الخلايا الكسر مع x عدد الكروموسومات منسوخة تماما. النظر المبدئية غير متزامن عندما A > 0.1-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اسطوانة جنوب تم التحقق من أن DARS2 كانت موزعة بشكل عشوائي الكروموسوم في مكتبة ينقول (t = 0) وأن المستنسخين الأصلح أن تستمر على مر الزمن. أجرى وصمة عار الجنوبي على الحمض النووي المستخرج من تجمع ينقول الأولية (عند t = 0) وكل ما يقدر 100 من أصل 700 الأجيال للمنافسة (الشكل 3). هنا، كان مجموع الحمض النووي الخلوي من كل وقت نقطة يهضم مع بفوإنزيم التقييد، المعروف بقطع ينقول نكبور::DARS2 مرة واحدة فقط في منطقة غير مشمولة بالتحقيق. وكان سبر وصمة عار الجنوبي مع بالاشعاع مسمى الحمض النووي جزء مكمل لجزء من نكبور. وكما يتضح من الشكل 3، تجمع DARS2 الأولية (t = 0) تفتقر إلى نطاقات مميزة، مما يدل على أن DARS2 تم إدراجها عشوائياً في جميع أنحاء الكروموسوم. وظهر نمط على مر الزمن، حيث تطورت تجمع كبير الأولية لاستنساخ DARS2 واحد أو عدد قليل فقط من استنساخ DARS2 المستمرة (الشكل 3; t = 0 إلى t = 700).
في المثال الموضح، حددت مواقع الإدراج DARS2 من التجربة المنافسة استخدام وغس والجينات السهل سيرا على الأقدام. هنا، تم استخدام الأفرقة العاملة لتحديد مواقع الإدراج من تجمع ابدأ (t = 0) وبعد 300، 400، و 700 الأجيال من المنافسة. ملاحظة أن التغطية في تسلسل العميقة الحالية غير كافية لوضع خرائط كاملة لمواقع الإدراج في t = 0؛ ومع ذلك، أنه يعطي مجموعة فرعية تمثيلاً للعدد الإجمالي لعمليات الإدراج. WGS أكدت النتيجة وصمة عار الجنوبي (أي اختيار الأصلح المستنسخين DARS2 )، تنتهي مع ما يقرب من 98 في المائة من جميع DARS2 الملاحق قريبة من wildtype موقع الصبغية DARS2 (DARS2 الأشعة تحت الحمراء استنساخ واستنساخ ربف)، بينما نسبة 2 في المائة المتبقية في أماكن أخرى على الصبغي (الشكل 4). وهذا يوحي بقوة أن موقف wildtype الأمثل بالنسبة للدالة DARS2 . عند t = 400، عثر على إدراج على عكس الذراع النسخ المتماثل مع على مسافة مماثلة تقريبا أوريتش ك wildtype DARS2 موقف (الشكل 4)، ولكن هذا الإدراج لم يتم استرداد بعد أجيال 700. وهكذا، لا يمكن أن تكون الجرعة الجينات المرتبطة النسخ المتماثل محدد واحد للوضع الأمثل.
سهل الجينات المشي استخدمت لتحديد مواقع عمليات الإدراج DARS2 في استنساخ واحدة معزولة بعد أجيال ما يقدر 700 من المنافسة. هنا، تم تحديد موقعين الإدراج DARS2 المذكورة أعلاه (استنساخDARS2 الأشعة تحت الحمراء واستنساخ ربف). الجينات يسهل المشي تم فقط على استنساخ 20، وهذا ما يفسر لماذا حددت جميع الملاحق DARS2 المواقع المعينة في الأفرقة العاملة لم تكن. DARS2--الخلايا ناقصة وعرضت سابقا لبدء النسخ المتماثل في أسينتشروني وأن يكون انخفاض في تركيز المنشأ بالنسبة إلى wildtype الخلايا4،،من1617، 18. ولذلك استخدمنا التدفق الخلوي لحل التزامن في الشروع في المحتوى المنشأ النسخ المتماثل والخلوية الحمض النووي لسلالات مختارة اثنين (DARS2 "استنساخ الأشعة تحت الحمراء" واستنساخ ربف) الذي، في كلتا الحالتين، أعيدت إلى wildtype مستويات (الشكل 5). ويرد مثال ممثل من سلالة تمتلك نسخة واحدة من DARS2 الموجودة في المحطة (الشكل 5ه). هنا، وجود عنصر DARS2 في المحطة لا إعادة التزامن أو المحتوى المنشأ الخلوي إلى مستويات wildtype، حين استنساخ المحدد DARS2 الأشعة تحت الحمراء، و ربف .
الشكل 1 : منهجية عامة. العرض التخطيطي للمنهجية. هو استنساخ المنطقة DARS2 الصبغية إلى ميني Tn10 في بنكبور، خلق pJFM1. يتم تحويل pJFM1 إلى MG1655 كولاي ΔDARS2، الذي يقوم بتشغيل إدراج عشوائية من DARS2 ترتبط Tn10 على الكروموسوم MG1655 كولاي ΔDARS2. استنساخ 70,000 تقريبا، تحتوي كل منها على إدراج DARS2 صبغية مختلفة، تم تجميع وتنافس مباشرة ضد بعضها البعض في مرق LB عند 37 درجة مئوية. وأجرى التجربة منافسة مباشرة في المرق رطل لأجيال 700 المقدرة، حيث تم عزل عينة لكل الأجيال 100 من المنافسة المباشرة. الحمض النووي المجموع المستخرجة من كل عينة معزولة وتستخدم لجنوب النشاف وتحديد عمليات الإدراج DARS2 من الأفرقة العاملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الرسوم البيانية من الجينات يسهل المشي. يوضح هذا الشكل قالب دنا جينومي من تسلسل الحمض النووي غير معروف المتاخمة لتسلسل معروفة مع مواقع فتيلة للتمهيدي عشوائي والإشعال المتداخلة 1 و 2 و 3. نتائج إيضاحات مسهبة المتعاقبة الثلاث إجراء استخدام الإشعال المتداخلة مصممة بثلاثة موضحة أدناه. المنتج النهائي (من جولة 3) يتم تعيين تسلسل استخدام 3 التمهيدي متداخلة. وهذا الرقم تم تكييفها من هاريسون et al. 27- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : وصمة عار جنوب سبر نكبور. تحليل لطخة جنوبي من الملاحق DARS2 في DARS2-سلالة ناقصة. الحمض النووي المستخرج من كل الأجيال ~ 100 من المنافسة المباشرة، بدءاً من t = 0 وتنتهي عند الأجيال 700، وقد استوعبت أنا مع بفوومجزأ هلام. تم تهجين وصمة عار مع نكبور التحقيق (انظر البروتوكول). t تشير إلى عدد أجيال منافسة. وهذا الرقم تم تكييفها من مولر فريموت et al. 4-حمو و LMW هي الوزن الجزيئي العالية والوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تمثيل رسومي ريسولفمواقع عمليات الإدراج ينقول اد في ΔDARS2. المواقف أوريتش، يتم الإشارة إلى البيانات، DARS1، DARS2، وتيرك . مواقع الإدراج DARS2 في ΔDARS2 في t = 0 (أشرطة سوداء)، تي = 400 (أشرطة زرقاء خفيفة)، t = 500 (أشرطة حمراء)، و t = 700 (أشرطة خضراء)، تحل بتسلسل الجينوم الكامل. وهذا الرقم تم استخدام دنابلوتير33 وكان مقتبس من مولر فريموت et al. 4- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الممثل التدفق الخلوي رسوم بيانية ينقول المواقع العثور على الجينات السهل سيرا على الأقدام في t = 700- كانت تزرع الخلايا في متوسط الحد الأدنى AB تستكمل مع الجلوكوز 0.2%، 10 ميكروغرام/مل الثيامين، والأحماض كاسامينو 0.5% عند 37 درجة مئوية. يبين Wildtype و ΔDARS2 A و B، على التوالي. تظهر مشتقات سلالة wildtype MG1655 خالية من DARS2 في المكان الأصلي، وبدلاً من ذلك تحمل نسخة من DARS2 في موقع ينقول حل ررف، الأشعة تحت الحمراء، والمحطة (ترك) في ج، د، ه، على التوالي. وهذا الرقم تم تكييفها من مولر فريموت et al. 4 لإظهار موقع DARS2 الذي ينتج شذوذ دورة الخلية (تيرك) أو أن يعيد النمط الظاهري wildtype(ررف، الأشعة تحت الحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المنهجية المستخدمة هنا يستفيد من الدولة من أحدث التقنيات للإجابة على سؤال صعبة فيما يتعلق بموقف أحد العناصر الوراثية المجينية الأمثل. الإدراج عشوائي للعنصر الوراثي (توسط في ينقول) يتيح جمع سريعة وسهلة للآلاف من الحيوانات المستنسخة، التي ثم يمكن أن تتنافس ضد بعضها البعض لتحديد موضع العنصر الوراثي التحقيق الأمثل (أي ، استنساخ الأصلح).
وأدرج هنا، DARS2 في تينيسي ميني10-على أساس ينقول، نكبور. من المهم اختيار ينقول لتحليل المتلقين للمعلومات من مواقع عمليات الإدراج. ترانسبوزونات مختلفة عديدة قد استخدمت في تجارب التسلسل (تراديس) توجه ينقول الإدراج-الموقع، مثل ميني-تينيسي5كم 234 واختيار أكثر شعبية، همار الأول مارينر ينقول35، 36 (لاستعراض أجرى مؤخرا لهذا، انظر van أوبيجنين وكاميلي36). أننا هدف للملاحق العشوائية الأولى 70,000 من DARS2، الذي يعطي ما يقرب من إدراج DARS2 إيفرت 65 شركة بريتيش بتروليوم في الجينوم MG1655. وهذا يمكن تعديلها بسهولة بتقليل أو زيادة تجمع الأولية للمستعمرات التي تم جمعها.
هنا، اخترنا لنقل مستمر في الثقافات دفعة رطل، ولكن يمكن أيضا إجراء هذه التجربة المنافسة في وسيلة مختلفة أو تحت ظروف مختلفة، بما في ذلك استخدام chemostat37. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل الإجراء لاستيعاب أي شروط للاختيار، بما في ذلك تؤكد مختلف، مثل الإجهاد التأكسدي، ناضح، أو المضادات الحيوية. للتحقق من وجود الحيوانات المستنسخة المستمرة على مر الزمن، أحد القيام بثلاثة أشياء على الأقل: الأفرقة العاملة؛ ينقول التسلسل (Tn-Seq)؛ أو، هنا، "لطخة" الجنوب. أخيرا، يمكن أن يتم الجينات يسهل المشي على استنساخ قليلة، مع ميزة أخرى أن يتم تحديد مواقع الإدراج ينقول في استنساخ واحدة، أن يمكن تحليل أثر موقع الإدراج الخاصة فينوتيبيكالي.
يعتمد اختيار المقايسة المظهرية لتقييم نتائج تجربة المنافسة في المنطقة التحقيق. قمنا باستخدام التدفق الخلوي، الذي وسيلة قوية لقياس بارامترات دورة الخلية من البكتيريا. هنا، والتدفق الخلوي كشفت أن المواقف الصبغية مختارة من DARS2، (أي، الملاحق DARS2 قريبة من موقف DARS2 wildtype) أدى إلى التنظيم الصحيح (بدء النسخ المتماثل أي، تتسق وتركيز الحمض النووي). واختيرت المواقف صبغية أمثل ل DARS2 في الجزء الواجب الجرعة المناسبة الجينات المرتبطة النسخ المتماثل وجزئياً بسبب الأجواء الجينوم المحلية أن من المهم ل الدالة DARS2 4.
هنا، كان التحقيق عنصرا الحمض النووي غير ترميز، ولكن يمكن توسيع هذا إلى أي منطقة الترميز المفضل. وجدت دراسة حديثة أن مستوى التعبير الجيني يختلف ~ 300-fold، تبعاً لموقفها بشأن الكروموسوم، دون مسح الارتباط للجينات المرتبطة بتكرار الجرعة38. يمكن أن يعطي النهج المذكور هنا أهمية نظرة ثاقبة العلاقة بين موقع جينومي جين معين، ونشاطها النسخي وميزة اللياقة البدنية المرتبطة. يمكن أن يساعد هذا في نظرية مع اختيار المناصب الجينوم، مما يؤدي إلى التعبير أقوى من جين معين، التي بدورها يمكن أن تكون ذات فائدة للهندسة سلالات جديدة ومحسنة لإنتاج البروتين المؤتلف.
أن كولاي تحتوي على مناطق محدودة إينتيرجينيك39، الملاحق ينقول، في معظم الحالات، يؤدي إلى تعطيل gene(s). وهذا قد أحياناً إنشاء المغلوطة التي لا يتم فيها اختيار clone(s) الأصلح بسبب موقف الصبغية الأمثل للعنصر الوراثي في السؤال، ولكن بدلاً من ذلك نظراً لتعطل أحد جينات--الذي، بطرق أخرى، يوفر ميزة اللياقة بدنية خلال تجربة المنافسة4.
هذه المنهجية يستفيد من نظام ينقول سهلة الاستخدام، حيث يمكن أن تكون أي منطقة الاختيار المتكاملة بشكل عشوائي مواقع. يمكن تعديل مسابقة تصميم التجربة تشمل أي عدد من القوات التحديد خلاف النمو الصرفة، كما يتضح هنا. يمكن أيضا تعديل الإعداد بحتة تستند Seq تينيسي، التي تعطي قرارا تسلسل أكبر من مواقع عمليات الإدراج من الأفرقة العاملة، تستخدم هنا. ينبغي استخدام هذا النهج غير منحازة لإلقاء الضوء على الميزات الجديدة والمثيرة في الكائنات أونتشاراكتيريزيد حتى الآن، والتي قد تبين وجود اتجاهات مشتركة في منظمة Eubacteria صبغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ومولت المؤلفين المنح من مؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة Lundbeck، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية (DNRF120) من خلال المركز "استجابة الضغط البكتيرية" واستمرار (يتصل).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R.
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G.
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
