Summary
وكثيراً ما يعقد أوتوفلوريسسينسي الخلفية من العينات البيولوجية تقنيات التصوير القائم على الأسفار، لا سيما في الأنسجة بوستميتوتيك البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين. هذا البروتوكول ويصف كيف يمكن إزالة أوتوفلوريسسينسي من هذه العينات فعالية استخدام ضوء متاحة تجارياً التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي المصدر إلى فوتوبليتش العينة قبل إيمونوستينينج.
Abstract
الفلورة الطريقة شائعة المستخدمة لتصور المقصورات سوبسيلولار وتحديد إضفاء الطابع المحلي على بروتينات محددة داخل عينة أنسجة. عقبة كبيرة للحصول على صور ذات جودة عالية الفلورة أوتوفلوريسسينسي الذاتية للأنسجة سبب أصباغ الشيخوخة مثل ليبوفوسسين أو بعينه إعداد العمليات الشائعة مثل التثبيت ألدهيد. ويصف هذا البروتوكول كيف يمكن تخفيض fluorescence الخلفية إلى حد كبير من خلال استخدام الفوسفور الأبيض الضوء التي تنبعث منها صفائف صمام ثنائي (LED) قبل المعالجة مع تحقيقات الفلورسنت فوتوبليتشينج. واسعة الطيف انبعاث الفوسفور الأبيض المصابيح تسمح للتبييض من فلوروفوريس عبر مجموعة من الحدود القصوى للانبعاثات. جهاز فوتوبليتشينج يمكن بناؤها من المكونات الجاهزة تكلفة منخفضة جداً ويوفر بديلاً موجوداً على كوينتشيرس الكيميائية المتاحة تجارياً. فوتوبليتشينج ما قبل معالجة من الأنسجة تليها تلطيخ الفلورة التقليدية يولد الصور خالية من أوتوفلوريسسينسي الخلفية. مقارنة للمنشأة قوينتشيرس الكيميائية التي خفضت التحقيق، فضلا عن خلفية الإشارات العلاج فوتوبليتشينج قد أي تأثير على كثافة fluorescence التحقيق في حين أنها خفضت فعالية الفلورية الخلفية وليبوفوسسين. على الرغم من أن فوتوبليتشينج يتطلب المزيد من الوقت لما قبل المعالجة، يمكن استخدام صفائف الصمام كثافة أعلى للحد من الوقت فوتوبليتشينج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسيط يحتمل أن تكون لمجموعة متنوعة من الأنسجة، ولا سيما بوستميتوتيك الأنسجة التي تتراكم lipofuscin مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى.
Introduction
الأسفار مجهرية باستخدام الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات المحددة يستخدم بشكل روتيني أن تصور البروتينات ذات الاهتمام في زراعة الخلايا والأنسجة. مضاعفات رئيسية للحصول على صور واضحة ونهائية في الفلورة هو أوتوفلوريسسينسي، الذي يمكن أن يكون سبب اندوجينوسلي في أنسجة الثدييات lipofuscin الصباغ العمر والبروتينات مثل الايلاستين والكولاجين1، 2. ويمكن إدخال مصادر أخرى من أوتوفلوريسسينسي من خلال خطوات إعداد عينة مثل التثبيت ألدهيد3. حبيبات Lipofuscin، تتكون أساسا من البروتين أوكسيداتيفيلي المعدلة والدهن تدهور المخلفات، تتراكم في الخلايا الحية منذ فترة طويلة مع زيادة السن2. هذا يسبب صعوبات في التصوير بوستميتوتيك الأنسجة مثل الدماغ وعضلات القلب أو الهيكل العظمى، كما طيف انبعاث fluorescence lipofuscin الواسع والمتغير، غالباً ما تتزامن مع الطول الموجي الانبعاثات من فلوروفوريس الشائعة المستخدمة تصنيف4. وهذه العوامل تجعل تصوير أنسجة المخ البشري من حالات الإصابة بأمراض الأعصاب أواخر ظهور مثل انحطاط فصي فرونتوتيمبورال (فتلد) لا سيما تحدي.
للحد من أوتوفلوريسسينسي، وضعنا أسلوب الذي نحن تشعيع أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة مع ضوء أبيض التي تنبعث منها مجموعة صمام ثنائي (LED) باستخدام مصباح مكتب منزلية5. يوفر هذا الأسلوب بسيطة كبديل للتقنيات التي تستخدم كوينتشيرس الكيميائية مثل CuSO4 في خلات الأمونيوم، أو المتاحة تجارياً تبريد الأصباغ مثل "السودان ب أسود" و "أسود اريوتشرومي ر"6. كما أنها أكثر فورات كبيرة متعددة الأطياف قيادة مصباح فوتوبليتشينج التقنيات ويتجنب المضاعفات والآثار المتولدة من طرق إزالة أوتوفلوريسسينسي الرقمية مثل الطيفية خلط الأمم المتحدة7،8. الفوسفور الأبيض لها المصابيح أطياف الانبعاث، والإضاءة العالية والتصنيع منخفضة التكلفة، يجعلها مثالية كأحد مكونات جاهزة لمجموعة متنوعة من صباغات5،9فوتوبليتشينج.
في هذا البروتوكول، تثبت بناء جهاز فوتوبليتشينج باستخدام مكونات موجوداً، وتطبيق فوتوبليتشينج على حالة الأنسجة فتلد المحتوية على تاو-إيجابية تضمينات (فتلد-T) باستخدام جسم محددة تاو فوسفوريلاتيد. نظهر تأثير فوتوبليتشينج على تصوير الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي توظيف اثنين من صباغات المستخدمة بشكل شائع: 488 أليكسا وتكساس الأحمر. أثر فوتوبليتشينج مقابل المقاطع غير المعالجة أو تلك التي تعامل مع تقضي المواد كيميائية تجارية كمياً والمقارنة. هذا فوتوبليتشينج قبل العلاج يمكن إدراجها في أي بروتوكول المصبوغة الفلورة القياسية لإزالة أوتوفلوريسسينسي في عينة بيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: إنجاز الأعمال المقدمة وفقا للمعايير الدولية المعترف بها، بما في ذلك "المؤتمر الدولي" في مواءمة (معنوي)، مجلس الدولية المنظمات للعلوم (الطبية) ، ومبادئ "إعلان هلسنكي". وكان استعمال الأنسجة البشرية بموافقة "مجلس أخلاقيات البحث شبكة الصحة جامعة". تم جمع عينات الدماغ البشري كجزء من بنك أنسجة الدماغ البحرية. في وقت جمع، وكان الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المرضى.
1-بناء جهاز فوتوبليتشينج والحلول
- تحضير حلول الأسهم.
- 1 إعداد ل 1 × الأسهم تريس مخزنة المالحة (1 x TBS) الحل (150 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس-Cl، درجة الحموضة 7.4) بتذويب 8.77 ز من كلوريد الصوديوم وز 6.06 من تريس قاعدة في 800 مل ddH 2 س وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام HCl. إحضار يصل حجم 1 لتر والاوتوكلاف.
- إعداد أزيد الصوديوم 10% (200 x الأسهم) بإذابة 1 غ أزيد الصوديوم في 10 مل من ddH 2 س (10%، الأسهم 200 x)-
- للشرائح الحجم القياسي، 1-3 استخدام طبق بيتري شفافة، ومربع واحد 100 × 100 مم كغرفة لشريحة. إنشاء دائرة شريحة واحدة، إضافة 0.25 مل أسهم أزيد الصوديوم x 200 إلى 50 مل x TBS 1 لجعل حل أزيد-تبس 0.05%. المكدس عمودياً على عملية شرائح إضافية الدوائر الشريحة 2-3. إعداد 50 مل إضافية لحل أزيد-تبس لكل دائرة.
- إنشاء سقالة للارتقاء الغرفة (ق) الشريحة مثل احتواء رأس مصباح تحت.
قص الفتحات في الجانبين 100 مم × 100 مم × 30 مم من البلاستيك الغذائي الحاوية والسفلي
- 100 ملم × 100 ملم الشريحة الدائرة، وعكس الحاوية. ضمان الفتحات الجانبية كبيرة بما يكفي احتواء مصدر ضوء LED وضمان فتح أسفل كبيرة بما يكفي أن يصل الضوء من مصدر الضوء إلى الدائرة بعينه دون عائق.
- تطبيق الشريط الكهربائية على سقالة لزيادة القبضة بين السقالة وعينه الدائرة/benchtop. استخدام أي مواد بديلة لبناء السقالة طالما أنه يرفع بشكل أمن الدائرة الشريحة دون إعاقة الضوء من الوصول إلى العينة-
- إزالة أي الناشرون أو بلاستيك معتمة من مصباح مكتب التي قد تعيق الصمام الخفيفة من الوصول مباشرة إلى العينة (إذا أمكن) وتوجيه الصفيف الصمام صعودا. ضع سقالة والشريحة الغرفة (ق) أعلاه الصفيف الصمام. استخدام مصباح برقبة مرنة للتلاعب السهل. تغطية
- بناء قبة الانعكاسية للجهاز ببطانة داخل مربع كبيرة بما يكفي لتغطية الدائرة الشريحة والسقالة مع رقائق الألومنيوم. استخدم مربع تلميح ماصة 1 مل لدائرة واحدة أو من 150 مم × 150 مم × 150 الورق المقوى مم متعددة، عمودياً مكدسة الدوائر.
2. ما قبل المعالجة فوتوبليتشينج لأقسام الأنسجة
ملاحظة: إعداد قسم الأنسجة قد تختلف تبعاً للمصدر من الأنسجة وتثبيت وترسيخ الأساليب المستخدمة. هنا، تم إصلاح أنسجة المخ (جيري أوربيتوفرونتال) من حالة من فتلد-T ~ 2 يوما في الفورمالين، تشغيل من خلال تدرج سكروز والمضمنة في أكتوبر، وقص على 10 أقسام ميكرومتر سميكة كريوستات باستخدام-
غرفة- في 4 درجة مئوية الباردة، الباردة مجلس الوزراء، أو الثلاجة، توجيه المصباح تحت السقالة ووضع الدائرة عينة على السقالة. صب 50 مل من محلول أزيد-تبس في قاعة عينة- أقسام الأنسجة سوبميرجي
- شنت على الزجاج القياسية مجهر الشرائح في قاعة الشريحة التي تحتوي على أزيد-تبس استخدام الملقط نظيفة. لشرائح متعددة، وضمان أن يتم وضع الشرائح في قاعة في طبقة واحدة-
- تغطي على الجهاز مع قبة العاكسة وتشغيل مصباح LED واحتضانها ح 48 في درجة مئوية 4-
3. الفلورة
- بوصمة عار الأنسجة تاو فوسفوريلاتيد باستخدام كونتيرستاين DAPI واليكسا 488-والأجسام المضادة الثانوية مترافق "الأحمر تكساس"، أولاً بإعداد حلول لاسترجاع مستضد permeabilization وعرقلة، والابتدائية جسم ملزمة.
المخزن المؤقت
- إعداد 500 مل من استرجاع مستضد (حمض الستريك 10 مم، 2 مم الإيثيلين حمض، 0.05% 20 توين؛ ودرجة الحموضة 6.2) بتذويب 0.92 غ حمض الستريك وز 0.37 حمض الإيثيلين (يدتا) في 500 مل من ddH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 مع هيدروكسيد الصوديوم وإضافة 0.25 مل 20 توين.
- إعداد 500 مل من 0.025% X-100 تريتون في حل تبس (TBS-تريتون) عن طريق إضافة مل 0.125 من Triton X-100 إلى 500 مل 1 × tbs.
- تحضير حلاً ألبومين المصل بقرى 1% (BSA) في تبس (جيش صرب البوسنة-تبس المخزن المؤقت) بتذويب ز 0.1 جيش صرب البوسنة في 10 مل tbs.
- إعداد حل حظر بإضافة 0.2 مل مصل الماعز العادي إلى 1.8 مل من 1% جيش صرب البوسنة/tbs.
- لكل شريحة، تعد 150 ميليلتر من جسم الابتدائي الحل (تخفيف 1: 100) من ميليلتر 1.5 بيبيتينج المضادة-والرمات-هوكي-تاو pSer202 + Thr205 الأجسام المضادة (AT8) في ميليلتر 148.5 1% جيش صرب البوسنة-تبس المخزن المؤقت وترك على مدت
- لتنفيذ استرداد مستضد، تغرق الشرائح فوتوبليتشيد عمودياً في جامع شريحة التي تحتوي على 25 مل من المخزن المؤقت لاسترجاع مستضد. تأمين وجامع مع الشريط و/أو سلاسل مثل أن لا تقع المجمع في حوض ماء. الحرارة في المجمع في حمام مائي في 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة والسماح في مجمع لتبرد بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل إزالة الشرائح. هل عدم إزالة الشرائح الفور لأنها سوف تتسبب في الفروع لتجف. نقل الشرائح من جامع استرجاع مستضد في جرة المصبوغة مليئة 30 مل تبس-تريتون
- وتغسل الأجزاء لمدة 5 دقائق في شاكر مداري مع الهز لطيف. تكرار الغسيل مرة واحدة مع تريتون تبس الطازجة. الفتيل العازلة الزائدة بعيداً مع أنسجة خالية من الوبر ومخطط الأنسجة بقلم مسعور. الحرص على عدم السماح للشرائح تجف.
- لكل شريحة، كتلة الأنسجة التي بيبيتينج ميليلتر 200 من عرقلة الحل على الأنسجة ووضع الشريحة في دائرة هوميديفيد. بناء قاعة بوضع حامل شرائح داخل مربع تلميح ماصة تحتوي على منشفة ورقية رطبة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2 على سطح مستوى. التأكد من أن الحل حظر كامل يغطي الأنسجة.
- إزالة الحل حظر بالطموح و "الماصة؛" 100-150 ميليلتر من محلول جسم الأولية على الأنسجة. التأكد من حجم كاف من جسم موجود وأن القسم على سطح مستو لتجنب تجميع حل جسم لجانب واحد. احتضان في درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها في قاعة هوميديفيد-
- إعداد خليط جسم الثانوية وكونتيرستين النووية DAPI.
- لكل شريحة، تعد 150 ميليلتر من خليط جسم الثانوي (تخفيف 1: 100) بإضافة 1.5 ميليلتر من الماعز المضادة الماوس 488 أليكسا و 1.5 ميليلتر من الماعز المضادة الماوس "الأحمر تكساس" إلى 147 ميليلتر من جيش صرب البوسنة-تبس وترك على مدت
- تحضير 0.1 ميكروغرام/مل DAPI كونتيرستين بإضعاف المسلسل. مزيج الحل الأسهم جيدا وتمييع 1 ميليلتر من الأسهم 5 ملغ/مل DAPI في 999 تبس جعل 1 مل من 5 ميكروغرام/مل محلول. لكل شريحة، يضعف 3 μL من 5 ميكروغرام/مل الحل مع 147 ميليلتر من TBS بتركيز نهائي من 0.1 ميكروغرام/ملليلتر-
تنبيه: DAPI مطفر معروف وينبغي التعامل معها بحذر-
- إزالة الأجسام المضادة الأولية بالطموح. غمر الشرائح في زجاج تلطيخ جرة تحتوي على 30 مل تريتون TBS والغسيل لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري. كرر الخطوة يغسل مع تريتون تبس الطازجة. فتيلة تبس الزائدة بعيداً-تريتون و "الماصة؛" 100 إلى 150 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية لكل شريحة.
- ضمان الأنسجة مغطى تماما بخليط جسم. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة في قاعة هوميديفيد في الظلام-
- إزالة الخليط جسم الثانوية بالطموح ونقل الشريحة في زجاج تلطيخ جرة تحتوي على 30 مل TBS (لا تريتون). المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف على شاكر مداري. كرر الخطوة يغسل مع tbs جديد. تنطبق 100 إلى 150 ميليلتر من 0.1 ميكروغرام/مل DAPI كونتيرستين على كل شريحة واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام-
- نقل الشرائح إلى زجاج تلطيخ جرة تحتوي على TBS ويغسل 3 مرات مع خلط لطيف لمدة 5 دقائق كل، استخدام تبس الطازجة لكل غسل. المخزن المؤقت الزائدة بعيداً الفتيل.
- تطبيق 3 قطرات من تصاعد المائية المتوسطة والأنسجة. استخدام الملقط، أقل بلطف ساترة زجاجية نظيفة على الأنسجة، بدءاً من حافة واحدة وخفض الحافة الأخرى لتجنب الملائمة لفقاعات الهواء ببطء. الحرص على عدم إزاحة ساترة إذا التصوير فورا. وبخلاف ذلك، تسمح المتوسطة المتصاعدة لتجف قبل تخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام-
4. مجهر الأسفار
- بدوره على مصباح الأسفار والمجهر وجهاز الكمبيوتر والسماح للمصباح الحارة ل 15 دقيقة مكان النسيج الملون الشرائح في مرحلة مجهر الأسفار. استخدام صورة مشرقة الحقل لتحديد موقع الأنسجة في التكبير x 10-
- تطبيق قطره ddH 2 س على السطح ساترة واستخدام عدسة هدف غمر مياه 20 x (NA = 1.0). حدد التفحص الطائرة متوسط 4-خط الإعداد. تعيين حجم الثقب 1 وحدة المشرقة التي تعطي شريحة ضوئية ~ 3 ميكرون. حدد موجات الإثارة وانبعاث الليزر لكل فلوروفوري في مسارين منفصلين لإشارة أفضل.
ملاحظة: أليكسا 488: λ ت = 488 نانومتر (الأرجون ليزر) λ م = 493-570 نانومتر؛ تكساس الأحمر: λ ت = 561 نانومتر (561 والعسف نانومتر الليزر)، λ م = 601-635 نانومتر؛ DAPI: λ ت = 405 نانومتر (405 صمام ثنائي ليزر)، λ م = 410 507 نانومتر. ضبط السلطة الليزر- والحصول على الإعدادات لتحسين كثافة إشارة لكل مسار. جمع صورة مركبة وحفظها. استخدام نفس إعدادات الليزر مقارنة كثافات fluorescence في شريحة مختلفة-
- للتصور، من شدة الأسفار في كل قناة وتثبيت الماكرو الأدوات الشخصية RGB ل ImageJ 10. حفظ الماكرو من صفحة ويب كملف نصي (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). حدد من القائمة إيماجيج، الإضافات-> وحدات الماكرو-> تثبيت؛ حدد الملف النصي لتثبيت الأداة ملفات RGB.
افتح ملف الصورة [كنفوكل] في إيماجيج
- وتحويل الصور المركبة من الكدسات 3 إلى RGB بالقيام بما يلي: صورة-> لون-> "أداة القناة". حدد " مركب " من القائمة المنسدلة والتحقق من جميع القنوات الثلاثة. ثم، حدد الصورة-> نوع-> لون RGB. حدد رمز أدوات الشخصية RGB
- ورسم خط عبر المقطع في أن يكون لمحة عن الصورة. حفظ كثافة البيانات كجدول بيانات للتآمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إضافة في الخطوة ما قبل المعالجة فوتوبليتشينج لبروتوكول قياسي الفلورة فورا قبل استرداد antigen وإيمونوستينينج (الشكل 1A). الجمعية جهاز فوتوبليتشينج يمكن أن يؤديها أيضا استخدام مختلف مكونات رخيصة، والجاهزة للاستخدام (الشكل 1B). طيف انبعاث الفوسفور الأبيض المصابيح يغطي طائفة واسعة من الأطوال الموجية مما يجعلها مناسبة لنطاق واسع فوتوبليتشينج، الاتفاق مع السابقة تقارير (الشكل 1)5،11. بعد فوتوبليتشينج ح 48، خفض كثافة البقع أوتوفلوريسسينت التي تشبه lipofuscin، فضلا عن الخلفية العامة الأسفار إلى حد كبير في كل الأطوال الموجية الانبعاثات في فرع أونستاينيد من فتلد-T (الشكل 1). البرهنة على فعالية فوتوبليتشينج، نحن الملون تاو هايبرفوسفوريلاتيد لتصور تضمينات تاو المرضية في حالة فتلد-T باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية المختلفة. شكل تضمينات تاو متميزة واستخدام صباغات اثنين لوضع العلامات كما يسمح لنا بثقة تميز ميزات أوتوفلوريسسينت من الأهداف المقصودة للتحقق من صحة هذا الأسلوب.
في الصور المركبة في التكبير أقل، مورفولوجية تضمينات تاو-إيجابية، الملون الأصفر من مجموعة القنوات 488 أليكسا وتكساس الأحمر، يتكون من مجموعات على شكل حلقة من عمليات الخلية قصيرة أن يشار إلى ' أستروسيتيك لويحات (الشكل 2 أ-ج). هذا التشكل من خصائص كورتيكوباسال تنكس (اتفاقية التنوع البيولوجي)12،13، الذي يتفق مع تقرير علم الأمراض في هذه القضية. في العينة غير المعالجة، هياكل عديدة موجودة في الصورة المركبة التي لا تشبه تضمينات تاو، وأظهر fluorescence أساسا في القناة الحمراء، مما يوحي بأن من أوتوفلوريسسينسي بدلاً من تلطيخ جسم المقصود. مستوى ملحوظ من الأسفار الخلفية مرئياً أيضا في هذه القناة في جميع أنحاء مجال الرؤية (الشكل 2a). تتم إزالة هذه الميزات أوتوفلوريسسينت وتظهر الصورة الشاملة أنظف بكثير عندما كانت تعامل العينات مع فوتوبليتشينج (PB) وتقضي المواد الكيميائية (الشكل 2-ج).
ثم أننا كمياً الفروق fluorescence في هذه العينات بالتنميط منطقة أصغر في كل عينة. لوحة أستروسيتيك واحد يرد في كل حالة العلاج للمقارنة (الشكل 2d-r). في العينة غير المعالجة، الأسفار الخلفية موجودة في جميع القنوات الثلاث، ولكن الأسفار جسم الثانوية للأجسام المضادة 488 أليكسا وتكساس الأحمر مرتفعا نسبيا (التين ح 2). بيد أنه أوتوفلوريسسينت الهياكل الموجودة في العينة غير المعالجة كثافات fluorescence في قناة "الأحمر تكساس" مماثلة للأجسام المضادة الثانوية "تكساس الأحمر" الملون تاو (ح الشكل 2). إذا لم يكن البروتين المستهدف مورفولوجيا متميزة، ويمكن التنبؤ بها مثل تاو في حالتنا، أوتوفلوريسسينسي في الأنسجة أن جعلت الصورة أونينتيربريتابل.
وفي المقابل، عندما تم تطبيق العلاج قبل فوتوبليتشينج قبل إيمونوستينينج، الخلفية الفلورية في 488 أليكسا وقنوات "الأحمر تكساس" انخفضت انخفاضا كبيرا مقارنة بالعينة غير المعالجة، والأسفار من تاو إيمونوستينيد وظلت لا تتأثر (الشكل 2 طاء-م). يحتوي الكيميائية التجارية مروي أوتوفلوريسسينسي في قناة 488 أليكسا فقط أكبر قدر من الفعالية فوتوبليتشينج. كما أنها قمعت DAPI الخلفية الفلورية، الذي لم يتأثر بالعلاج فوتوبليتشينج ح 48 (الشكل 2 م). ومع ذلك، تقضي المواد الكيميائية كما خفضت كثافة "تكساس الأحمر" الثانوية وإشارات DAPI، مما يوحي بوجود درجة معينة من نتائج عكسية التبريد (الشكل 2n-r).
الشكل 1 : تطبيق ما قبل المعالجة فوتوبليتشينج في سير العمل قياسية الفلورة. A) التخطيطي المبسطة البروتوكول الفلورة القياسية من اقتناء الأنسجة للتصوير. ويمثل تطبيق أجسام مضيئة الابتدائي والثانوي الرسوم. ويتم إنتاج صورة مجهر ممثل. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. ب) جهاز فوتوبليتشينج تمثيلية التي شيدت باستخدام المكونات الجاهزة (لا يظهر غطاء العاكسة). ج) طيف الانبعاث من الأبيض LED الصفيف. ذروة انبعاث ضيقة في 450 نانومتر وذروة واسعة في 550 لوحظت شمال البحر الأبيض المتوسط. د) أثر فوتوبليتشينج على الأسفار الخلفية الذاتية أنسجة فتلد-T في أليكسا 488 (493-570 نانومتر) و "تكساس الأحمر" (601-635 نانومتر) الانبعاثات أطوال موجية. تلامس أوتوفلوريسسينت تشبه lipofuscin هي انخفاض واضح بعد فوتوبليتشينج ح 48. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2:تأثير إزالة أوتوفلوريسسينسي على جودة الصورة لحالة الأنسجة فتلد-T مع تاو المضادة فوسفوريلاتيد إيمونوستاينينج. أ-ج) تضخم منخفض، والصور الفلورة مركب من الحقول لعرض الممثل في غير المعالجة (أ)، فوتوبلياتشيد ح 48 (ب) ويحتوي الكيميائية تعامل العينات (ج). تمثل الألوان الفلورية في القنوات التالية عن طريق الإثارة بكل مصادر الضوء: أليكسا 488 (الأخضر): λت = 488 نانومتر (الأرجون ليزر) λم = 493-570 نانومتر؛ تكساس الأحمر (أحمر): λت = 561 نانومتر (561 والعسف نانومتر الليزر)، λم = 601-635 نانومتر؛ DAPI (أزرق): λت = 405 نانومتر (405 صمام ثنائي ليزر)، λم = 410 507 نانومتر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. د-r) الصور التكبير أعلى المناطق المنقطة في غير المعالجة (د-ز)، فوتوبليتشيد (i-l) والعينات الكيميائية يحتوي معاملة (ن-س)، مع قنوات منفصلة الأسفار، دمج الصور، وكمياً fluorescence إشارة التشكيلات الجانبية. تمثل الخطوط المنقطة في قنوات المدمجة (غ، ل، ف) الخط على الإشارات التي تم إنشاؤها التشكيلات الجانبية (ح، م، ص). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. أوتوفلوريسسينت الجسيمات (بالعربية)،يتم الإشارة إلى إيمونولابيليد تاو الفلورية (تاو) ونواة إشارة (نشاط). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح بالمعالجة المسبقة فوتوبليتشينج للأنسجة الموصوفة في هذه المخطوطة للقضاء الفعلي على أوتوفلوريسسينسي باستخدام العناصر الجاهزة للاستخدام. وصف البروتوكول تصوير الفلورة المجاميع تاو فوسفوريلاتيد في أنسجة المخ البشري الفورمالين--الثابتة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق 488 أليكسا و "تكساس الأحمر"، مع DAPI كونتيرستين نووية. لتطبيق الأسلوب على الأنسجة الأخرى، نوصي بإجراء فوتوبليتشينج 48 ساعة قبل معالجة للعينة كنقطة انطلاق. وبعد فوتوبليتشينج، أداء الفلورة القياسية تلطيخ البروتوكول للميزات لمصلحة استخدام جسم تخفيف أثر توصيات الشركة المصنعة. إذا كانت الأسفار الخلفية لا تزال موجودة، مدة فوتوبليتشينج و/أو جسم تلطيخ الخطوات تحتاج إلى تعديل. تختلف مدة فوتوبليتشينج مصباح المحددة لبناء الجهاز ومستوى أوتوفلوريسسينسي في العينة. يجب أن تحدد الوقت تبيض الأمثل لكل جهاز مصباح فريدة من نوعها. يمكن أن يتم ذلك قبل فوتوبليتشينج قسم أنسجة كوفيرسليبيد أونستاينيد، شنت في تبس أزيد وقياس fluorescence الذاتية للشريحة في فترات ح 12 استخدام مجهر الأسفار. في التقارير السابقة، يمكننا رصد فوتوبليتشينج ليبوفوسسين بتحليل الجسيمات ووظائف ملائمة لتحلل أسي منحنى5، ولكن ببساطة، الملاحظة البصرية للمقاطع على فترات منتظمة يمكن أن تكون نفس القدر من الفعالية القاضي يصبح تطفئ المدة في معظم الأسفار. وفي حالتنا أنسجة المخ أعمارهم التي تحتوي على كميات عالية من أصباغ lipofuscin، حضانة 48 ساعة مع مصباح لوكس 800 كان كافياً. إذا كانت إشارة محددة لا يزال ضعيفا بالمقارنة مع الخلفية بعد فوتوبليتشينج، النظر في زيادة تركيز الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي خلال تلطيخ. من المهم أيضا لتنفيذ عنصر تحكم جسم فقط ثانوية لضمان الإشارات الخلفية لا ينتج عن ربط جسم الثانوي غير محددة. الحرص على تحديد الأجسام المضادة التي لا كروسريكت، ولا سيما عندما تلطيخ لأهداف متعددة. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن إشارات محددة لا مروي عن غير قصد أثناء عملية المصبوغة. على سبيل المثال، هو مروي نسل وصمة عار (لتلطيخ الخلايا العصبية) بجيش صرب البوسنة. في هذه الحالة، يستعاض عن عنصر جيش صرب البوسنة لعرقلة الحل مع بدائل مثل الأسماك الجلد الجيلاتين5.
استخدام الفوسفور الأبيض المصابيح فوتوبليتشينج ببعض القيود بسبب لها طيف الانبعاث من 420 نانومتر إلى 650 نانومتر. وبالتالي، لا يوجد فوتوبليتشينج كبيرة في أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية من الممكن. أيضا، بسبب انبعاث الطيف الواسع، صباغات فوتوبليتشينج لأطوال موجية محددة يتطلب تعديلات مثل تراكب أوراق مرشح اللون أعلاه صفائف الصمام لتصفية أطوال موجية الانبعاثات غير مرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك، قد تتطلب فوتوبليتشينج أنسجة أوقات تجهيز أطول من الأساليب الأخرى. وفي هذه الحالة، بسبب سن أنسجة المخ (من فرد 89 عاماً) وفترة التثبيت ألدهيد طويلة لأكثر من يومين، لمدة 48 ساعة فوتوبليتشينج كان مطلوباً. على الرغم من أن لا وقت المعالجة النشطة غير مطلوب، واحد يجب أن تأخذ في الاعتبار الوقت فوتوبليتشينج ووفقا لخطة الدورة المصبوغة. مصابيح LED للإضاءة أعلى أو استخدام مصابيح متعددة قد يقلل الوقت فوتوبليتشينج بزيادة بسيطة في التدفق الفوتوني.
بالمقارنة مع الأساليب القائمة، لدينا أسلوب يوفر العديد من المزايا الهامة. على عكس فوتوبليتشينج باستخدام الليزر المسح في الفحص المجهري الأسفار، لاحظنا أي علامات على الضرر الناجم عن صور لدينا العينات باستخدام فوتوبليتشينج LED. ميزة كبرى أخرى لجهازنا هو الانخفاض الكبير في التكلفة على تقنيات أخرى. تكلفة جمعية جهازنا هو حوالي 10 دولار من دولارات الولايات المتحدة، والجمعية العامة جهاز مرنة ما يكفي أن أي مختبر يمكن اعتماد الصيغة الخاصة بهم فوتوبليتشير. وبالمقارنة، أدت أساليب أخرى موتيسبيكترال باستخدام صفائف مع أصحاب الشرائح المخصصة وتبريد الدوائر يتطلب تصل إلى 1000 دولار لتشييد8. وبالإضافة إلى ذلك، كوينتشيرس الكيميائية التجارية هي المواد الاستهلاكية التي تكلفة 120 دولاراً من دولارات الولايات المتحدة للشرائح 100 وإدخال المركبات غير المرغوب فيها في العينة. يحتوي الكيميائية المستخدمة للمقارنة في هذه الدراسة يحتمل يحتوي على صبغ "الأسود السودان" الدهن الملزمة، التي قد تتداخل مع إيمونوستينينج من البروتينات الدهنية.
عموما، يتضمن الخطوات الأكثر أهمية في المعالجة المسبقة فوتوبليتشينج وإيمونوستينينج للعينة مناولة القسم أثناء إيمونوستينينج. من المهم أن مرة واحدة هي امهاء القسم أثناء فوتوبليتشينج، فإنه لا يسمح لتجف في أي من الخطوات اللاحقة. تجفيف الشريحة سوف تتسبب في التوزيع غير المتكافئ للأجسام المضادة وإنشاء الأعمال الفنية أونينتيربريتابل. لتفادي ضياع الوقت وعينات يحتمل أن تكون ثمينة، يجب الحرص على عدة خطوات في البروتوكول. بعد استرجاع مستضد، والسماح للأنسجة لتبرد قبل نقل إلى الحل permeabilization تريتون TBS. حتى لحظة التعرض إلى الهواء عندما يتم تسخين العينة بارتفاع درجات الحرارة سيتسبب التجفيف الفوري للأنسجة. أيضا التأكد من أن جسم أو حجب أو حلول كونتيرستين تماما تغطي الأنسجة أثناء التطبيق. يمكن تحقيق هذا عن طريق التأكد من أن الأنسجة ويرد كاملا بالقلم مسعور لتجنب الإعادة الحل وأن تطبق جميع الحلول في دائرة هوميديفيد على سطح مستوى. وهذا مهم بشكل خاص خلال إينكوبيشنز بين عشية وضحاها (جسم الابتدائي ملزمة).
التطبيق الناجح لاستخدام الفوسفور الأبيض المصابيح قبل تلطيخ فوتوبليتشينج قد ييسر تطبيق أساليب الفلورة على الأنسجة المحفوظة في الأرشيف. هو علاج متعددة وغير مكلفة التي نتوقع أن تكون قابلة لمجموعة واسعة من العينات في المستقبل. على الرغم من أننا فقط بتطبيق هذا الأسلوب لانسجة المخ البشري، هذا الأسلوب يمكن إدراجها بسهولة في أي بروتوكول المصبوغة في أوتوفلوريسسينسي الذي هو منع النتائج المرجوة، لا سيما في الأنسجة بوستميتوتيك مثل القلب أو الهيكل العظمى عضلات من المرجح أن تتراكم فيها ليبوفوسين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذه الدراسة كلياً أو جزئيا "كونسورتيوم نيوروديجينيريشن الكندي" والشيخوخة (CCNA)، المعهد الكندي للصحة البحوث (استوفوا)، جمعية المرض من المرض (كندا)، وجمعية الزهايمر من كندا (ASC). المؤلف يود أن يشكر سلطان درفش وأندرو ريد من البنك أنسجة الدماغ البحري لتوفير أنسجة المخ فتلد، "ميلان وغانغولي" من البرنامج "تستهدف" الزمانية والتضخيم من الإشعاع استجابة (ستار) ولها المنتسبة تمويل الوكالات للأنسجة التضمين وتمزيقها الخدمات، ومتقدمة بصرية مجهرية مرفق (أومف) لتوفير أدوات الفحص المجهري. وشكر هادلي كيفن هو استعراض نقدي للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T.
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al.
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
