Summary
जैविक नमूनों की पृष्ठभूमि autofluorescence अक्सर प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग तकनीक पेचीदा, विशेष रूप से मानव postmitotic ऊतकों वृद्ध में । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इन नमूनों से autofluorescence प्रभावी रूप से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रकाश उत्सर्जक डायोड प्रकाश स्रोत का उपयोग करने के लिए immunostaining से पहले नमूना photobleach हटा सकते हैं ।
Abstract
इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक आम विधि के लिए उपसेलुलर डिब्बों कल्पना और एक ऊतक नमूने के भीतर विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उच्च गुणवत्ता इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के अधिग्रहण के लिए एक महान बाधा अंतर्जात जैसे lipofuscin के रूप में या आम नमूना तैयारी प्रक्रियाओं द्वारा एल्डिहाइड निर्धारण के रूप में उंर बढ़ने pigments के कारण ऊतक के autofluorescence है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बहुत photobleaching के माध्यम से कम हो सकता है सफेद फास्फोरस प्रकाश उत्सर्जक डायोड का उपयोग कर सकते है (एलईडी) फ्लोरोसेंट जांच के साथ उपचार से पहले arrays । सफेद फास्फोरस एल ई डी के व्यापक स्पेक्ट्रम उत्सर्जन उत्सर्जन चोटियों की एक श्रेणी में fluorophores के ब्लीचिंग के लिए अनुमति देते हैं । photobleaching तंत्र बंद से निर्माण किया जा सकता है-शेल्फ बहुत कम लागत पर घटकों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रासायनिक शमन करने के लिए एक सुलभ विकल्प प्रदान करता है । एक photobleaching पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा पीछा ऊतक के पूर्व उपचार पृष्ठभूमि autofluorescence से मुक्त छवियों को उत्पन्न करता है । की तुलना में स्थापित रासायनिक बुझती है जो जांच के रूप में अच्छी तरह से पृष्ठभूमि संकेतों को कम किया, photobleaching उपचार जांच प्रतिदीप्ति तीव्रता पर कोई प्रभाव नहीं था, जबकि यह प्रभावी ढंग से कम पृष्ठभूमि और lipofuscin प्रतिदीप्ति । हालांकि photobleaching पूर्व उपचार के लिए और अधिक समय की आवश्यकता है, उच्च तीव्रता एलईडी arrays photobleaching समय को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस सरल विधि संभवतः ऊतकों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से postmitotic ऊतकों कि ऐसे मस्तिष्क और हृदय या कंकाल की मांसपेशियों के रूप में lipofuscin जमा ।
Introduction
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विशेष प्रोटीन लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी नियमित रूप से सेल संस्कृति और ऊतकों में रुचि के प्रोटीन कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस में स्पष्ट और निश्चित छवियों के अधिग्रहण के लिए एक प्रमुख जटिलता autofluorescence है, जो स्तनधारी ऊतक में आयु वर्णक lipofuscin द्वारा और ऐसे elastin और कोलेजन1के रूप में प्रोटीन द्वारा endogenously कारण हो सकता है, 2. autofluorescence के अन्य स्रोतों जैसे एल्डिहाइड निर्धारण3के रूप में नमूना तैयारी चरणों के माध्यम से पेश किया जा सकता है । Lipofuscin granules, मुख्य रूप से oxidatively संशोधित प्रोटीन और लिपिड गिरावट के अवशेषों से बना है, वृद्धि की उंर के साथ लंबे समय से रहने वाले कोशिकाओं में जमा2। इस तरह के मस्तिष्क और हृदय या कंकाल की मांसपेशियों के रूप में इमेजिंग postmitotic ऊतकों में कठिनाइयों का कारण बनता है, lipofuscin के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के रूप में व्यापक और चर, अक्सर आम fluorophores के लिए इस्तेमाल के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ मेल लेबलिंग4। इन कारकों frontotemporal लोबार अध (FTLD) के रूप में देर से शुरुआत neurodegenerative रोगों के मामलों से मानव मस्तिष्क ऊतक की इमेजिंग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाते हैं ।
autofluorescence को कम करने के लिए, हमने एक ऐसी तकनीक ईजाद की है जिसमें हम एक सफ़ेद प्रकाश उत्सर्जक डायोड (LED) सरणी के साथ एक घरेलू डेस्क लैंप5का उपयोग करके स्लाइड-माउंटेड ऊतक अनुभागों को विकीर्ण हैं । यह सरल तकनीक ऐसी तकनीकों का विकल्प प्रदान करती है जो CuSO4 जैसे अमोनियम एसीटेट में, या वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध इस तरह के सूडान ब्लैक बी और Eriochrome ब्लैक टी6जैसे रंगों के रूप में रासायनिक शमनकों का उपयोग करते हैं । यह भी multispectral एलईडी लैंप photobleaching तकनीक पर महत्वपूर्ण लागत की बचत है और जटिलताओं और ऐसे वर्णक्रमीय संयुक्त राष्ट्र के मिश्रण7,8के रूप में डिजिटल autofluorescence हटाने के तरीकों से उत्पन्न कलाकृतियों से बचा जाता है । सफेद फास्फोरस एल ई डी एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम, उच्च चमक और कम विनिर्माण लागत है, photobleaching chromophores की एक किस्म के लिए एक बंद-the-शेल्फ घटक के रूप में उन्हें आदर्श बनाने5,9.
इस प्रोटोकॉल में, हम सुलभ घटकों का उपयोग करके एक photobleaching तंत्र के निर्माण का प्रदर्शन करते हैं और एंटीबॉडी तौ के लिए विशिष्ट phosphorylated का उपयोग करके ताऊ-पॉजिटिव समावेशन (FTLD-टी) युक्त FTLD ऊतक के मामले में photobleaching लागू करते हैं । हम इमेजिंग फ्लोरोसेंट पर photobleaching के प्रभाव का प्रदर्शन-दो सामांयतः-प्रयुक्त chromophores: Alexa ४८८ और टेक्सास रेड को रोजगार के एंटीबॉडी । photobleaching बनाम अनुपचारित वर्गों या एक वाणिज्यिक रासायनिक शमन के साथ उन लोगों के इलाज के प्रभाव मात्रा और तुलना कर रहे हैं । इस photobleaching पूर्व उपचार किसी भी मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल में एक जैविक नमूने में autofluorescence को दूर करने के लिए शामिल किया जा सकता है ।
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Protocol
- स्टॉक समाधान तैयार करें ।
- तैयार 1x स्टॉक Tris के 1 एल-बफर खारा (1x टीबीएस) समाधान (१५० mM NaCl, ५० मिमी Tris-सीएल, पीएच ७.४) को भंग करके ८.७७ ग्राम के NaCl और ६.०६ ग्राम के Tris बेस के ८०० मिलीलीटर में ddH 2 हे और एचसीएल का उपयोग कर पीएच को ७.४ से समायोजित करें । 1 L और आटोक्लेव तक वॉल्यूम लाएं ।
- 10% (200x स्टॉक) सोडियम azide को भंग करके 10 मिलीलीटर में सोडियम azide की ddH 2 ओ (10%, 200x स्टॉक) तैयार करें ।
- के लिए 1-3 मानक आकार स्लाइड, एक स्लाइड चैंबर के रूप में एक एकल १०० मिमी x १०० मिमी पारदर्शी, वर्ग पेट्री डिश का उपयोग करें । एक एकल स्लाइड चैंबर के लिए, ०.०५% azide-टीबीएस समाधान बनाने के लिए 1x टीबीएस की ५० मिलीलीटर में ०.२५ मिलीलीटर 200x सोडियम azide स्टॉक जोड़ें । स्टैक 2-3 स्लाइड कक्ष अनुलंब रूप से अतिरिक्त स्लाइड को संसाधित करने के लिए । प्रत्येक चैंबर के लिए एक अतिरिक्त ५० मिलीलीटर azide-टीबीएस समाधान तैयार करें ।
- एक पाड़ बनाने के लिए स्लाइड चैंबर (ओं) ऐसी है कि एक चिराग सिर के नीचे फिट कर सकते है तरक्की ।
एक १०० मिमी x १०० मिमी स्लाइड चैंबर के लिए
- , नीचे और एक १०० मिमी x १०० मिमी x 30 मिमी प्लास्टिक खाद्य कंटेनर और पलटने कंटेनर के पक्षों में कटौती की । सुनिश्चित करने के पक्ष के उद्घाटन काफी बड़े है एक एलईडी प्रकाश स्रोत फिट और नीचे खोलने यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि प्रकाश स्रोत से प्रकाश बाधा बिना नमूना कक्ष तक पहुंचता है काफी बड़ा है ।
- पाड़ के लिए विद्युत टेप लागू पाड़ और नमूना चैंबर के बीच पकड़ बढ़ाने के लिए/benchtop । पाड़ का निर्माण करने के लिए किसी भी वैकल्पिक सामग्री का उपयोग करें ताकि यह सुरक्षित रूप से नमूना तक पहुंचने से प्रकाश में बाधा के बिना स्लाइड चैंबर को ऊंचा कर सके ।
- डेस्क लैंप है कि सीधे नमूना (यदि संभव हो) तक पहुंचने से एलईडी प्रकाश में बाधा हो सकती है और एलईडी सरणी ऊपर की ओर ओरिएंट से किसी भी विसारक या अपारदर्शी प्लास्टिक निकालें । पाड़ और स्लाइड चैंबर (ओं) एलईडी सरणी के ऊपर रखें । आसान हेरफेर के लिए एक लचीला गर्दन के साथ एक चिराग का प्रयोग करें ।
- एक काफी बड़ी स्लाइड चैंबर और एल्यूमीनियम पंनी के साथ पाड़ को कवर बॉक्स के अंदर अस्तर द्वारा तंत्र के लिए एक चिंतनशील गुंबद कवर का निर्माण । एक एकल कक्ष या एक १५० मिमी x १५० मिमी x १५० मिमी गत्ता बॉक्स के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप बॉक्स का उपयोग करें एकाधिक, खड़ी कक्षों के लिए ।
- में एक 4 & #186; ग शीत कक्ष, शीत कैबिनेट, या फ्रिज, पाड़ के नीचे दीपक ओरिएंट और पाड़ पर नमूना चैंबर जगह है । नमूना चैंबर में azide-टीबीएस समाधान के ५० मिलीलीटर डालो.
- जलमग्न ऊतक वर्गों azide-टीबीएस स्वच्छ संदंश का उपयोग युक्त स्लाइड चैंबर में मानक कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार. एकाधिक स्लाइड्स के लिए, सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स कक्ष में एक ही परत पर रखी गई हैं ।
- चिंतनशील गुंबद के साथ तंत्र को कवर, एलईडी लैंप पर बारी, और ४८ के लिए गर्मी में 4 & #186; C.
- phosphorylated के लिए ऊतक दाग DAPI counterstain और Alexa ४८८ का उपयोग कर ताऊ-और टेक्सास लाल-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, पहले प्रतिजन पुनः प्राप्ति, permeabilization, अवरुद्ध, और प्राथमिक के लिए समाधान तैयार एंटीबॉडी बंधनकारक आहे.
- तैयार प्रतिजन की पुनर्प्राप्ति बफर के ५०० मिलीलीटर (10 मिमी साइट्रिक एसिड, 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड, ०.०५% के बीच 20; पीएच ६.२) को भंग करके साइट्रिक एसिड और ethylenediaminetetraacetic एसिड की ०.३७ ग्राम (EDTA) के ५०० मिलीलीटर में ddH 2 O. पीएच समायोजित करें NaOH के साथ ६.२ के लिए और के बीच के ०.२५ मिलीलीटर जोड़ें 20.
- ५०० एमएल के ०.०२५% ट्राइटन x-१०० को टीबीएस सॉल्यूशन (टीबीएस-ट्राइटन) में ०.१२५ मिलीलीटर जोड़कर ट्राइटन x-१०० से ५०० मिलीलीटर 1x टीबीएस में तैयार करें ।
- 10 मिलीलीटर BSA में ०.१ g टीबीएस भंग करके एक 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान टीबीएस (BSA-टीबीएस बफर) में तैयार करें ।
- 1% BSA/टीबीएस. के १.८ मिलीलीटर के लिए सामान्य बकरी सीरम के ०.२ मिलीलीटर जोड़कर एक अवरुद्ध समाधान तैयार प्रत्येक स्लाइड के लिए
- , तैयार १५० & #181; l के प्राथमिक एंटीबॉडी हल (1:100 कमजोर पड़ने) से pipetting १.५ & #181; l के विरोधी phospho-PHF-तौ pSer202 + Thr205 (AT8) एंटीबॉडी में १४८.५ & #181; l 1% BSA-टीबीएस बफर और बर्फ पर छोड़ दें.
- antigen पुनर्प्राप्ति करने के लिए, photobleached स्लाइड अनुलंब रूप से 25 मिलीलीटर antigen पुनर्प्राप्ति बफ़र के साथ एक स्लाइड संग्राहक में मर्ज करें । कलेक्टर को टेप और/या तार के साथ सुरक्षित करें ऐसे में कलेक्टर जल स्नान में नहीं आते हैं । एक पानी में स्नान में कलेक्टर हीट ९० & #186; सी के लिए 30 मिनट और स्लाइड हटाने से पहले कलेक्टर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । स्लाइडों को तुरंत न निकालें क्योंकि इससे अनुभागों के सूखने का कारण होगा ।
- टीबीएस-ट्राइटन के 30 मिलीलीटर से भरा एक धुंधला जार में प्रतिजन है़ कलेक्टर से स्लाइड स्थानांतरण और कोमल मिलाते के साथ एक कक्षीय शेखर पर 5 मिनट के लिए वर्गों धो. ताजा टीबीएस-ट्राइटन के साथ एक बार धो दोहराएं । एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ दूर अतिरिक्त बफर बाती और एक hydrophobic कलम के साथ ऊतक रूपरेखा । ध्यान रखें कि स्लाइड को सूखने न दें ।
- प्रत्येक स्लाइड के लिए, ऊतक ब्लॉक pipetting २०० & #181 के द्वारा; ऊतक पर समाधान अवरुद्ध के एल और एक humidified कक्ष में स्लाइड जगह है । एक पिपेट टिप एक गीला कागज तौलिया युक्त बॉक्स के अंदर एक स्लाइड रैक रखकर चैंबर का निर्माण । एक स्तर की सतह पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । सुनिश्चित करें कि अवरुद्ध समाधान पूरी तरह से ऊतक शामिल है ।
- आकांक्षा और पिपेट द्वारा अवरुद्ध समाधान निकालें 100-150 & #181; ऊतक पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एल । एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए मौजूद है और यह है कि खंड एक स्तर की सतह पर एक तरफ एंटीबॉडी समाधान के पूलिंग से बचने के लिए है । पर एक humidified चैंबर में रात भर 4 & #186; सी में मशीन ।
- द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण और DAPI नाभिकीय counterstain तैयार करते हैं ।
प्रत्येक स्लाइड के लिए
- , तैयार १५० & #181; l के माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण (1:100 कमजोर पड़ने) को जोड़कर १.५ & #181; बकरी विरोधी माउस Alexa ४८८ के एल और १.५ & #181; l बकरी विरोधी माउस टेक्सास के लाल को १४७ & #181; l के BSA-टीबीएस और बर्फ पर छोड़ दें.
- तैयार ०.१ & #181; छ/एमएल DAPI counterstain सीरियल कमजोर पड़ने से । स्टॉक सॉल्यूशन को अच्छी तरह मिलाएं और पतला करके 1 & #181; L शेयर 5 mg/मब DAPI के ९९९ में टीबीएस के 1 मिलीलीटर को 5 & #181; g/ml सॉल्यूशन । प्रत्येक स्लाइड के लिए, पतला 3 & #181;l का 5 & #181; g/मब हल के साथ १४७ & #181; टीबीएस के l को अंतिम एकाग्रता के लिए ०.१ & #181; g/ml.
चेतावनी: DAPI एक ज्ञात mutagen है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।
आकांक्षा द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी को
- निकालें । टीबीएस-ट्राइटन के 30 मिलीलीटर युक्त एक गिलास धुंधला जार में स्लाइड जलमग्न और एक कक्षीय शेखर पर कोमल मिश्रण के साथ 5 मिनट के लिए धो लें । ताजा टीबीएस-ट्राइटन के साथ धो कदम दोहराएं । बाती दूर अतिरिक्त टीबीएस-ट्राइटन और पिपेट १०० से १५० & #181; प्रत्येक स्लाइड को माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के एल.
- सुनिश्चित ऊतक एंटीबॉडी मिश्रण द्वारा पूरी तरह से कवर किया जाता है । अंधेरे में humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
- आकांक्षा द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण को दूर करने और एक गिलास धुंधला जार में स्लाइड हस्तांतरण टीबीएस (कोई ट्राइटन) के 30 मिलीलीटर युक्त । एक कक्षीय शेखर पर कोमल मिश्रण के साथ 5 मिनट के लिए धो लें । ताजा टीबीएस के साथ धो कदम दोहराएं । लागू १०० से १५० & #181; L के ०.१ & #181; छ/एमएल DAPI counterstain प्रत्येक स्लाइड को और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
- एक गिलास धुंधला टीबीएस युक्त जार करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण और 5 मिनट प्रत्येक के लिए कोमल मिश्रण के साथ 3 बार धोने, प्रत्येक धोने के लिए ताजा टीबीएस का उपयोग कर । दुष्ट दूर अतिरिक्त बफर.
- ऊतक के लिए जलीय बढ़ते मध्यम के 3 बूंदें लागू होते हैं । संदंश का उपयोग करना, धीरे ऊतक पर एक साफ गिलास coverslip कम, एक किनारे के साथ शुरू और धीरे से हवा के बुलबुले के फँसाने से बचने के लिए अन्य बढ़त को कम. ध्यान रखना coverslip अगर इमेजिंग तुरंत हटाना नहीं है । अंयथा, बढ़ते मध्यम को अंधेरे में 4 & #186; C पर संग्रहीत करने से पहले सूखने दें ।
- प्रतिदीप्ति लैंप, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर पर बारी और दीपक 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप अवस्था में सना हुआ ऊतक स्लाइड्स रखें. 10x आवर्धन पर ऊतक खोजने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवि का प्रयोग करें.
- coverslip सतह के लिए ddH 2 ओ की एक बूंद लागू करते है और एक 20x जल विसर्जन उद्देश्य लेंस (NA = 1.0) का उपयोग करें । 4-पंक्ति औसत विमान स्कैन सेटिंग का चयन करें । 1 हवादार इकाई है कि ~ 3 माइक्रोन के एक ऑप्टिकल टुकड़ा देता है pinhole आकार सेट करें । सबसे अच्छा संकेत के लिए अलग पटरियों में प्रत्येक fluorophore के लिए लेजर उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करें.
ध्यान: Alexa ४८८: & #955; ex = ४८८ एनएम (आर्गन लेजर) & #955; em = 493-570 एनएम; टेक्सास रेड: & #955; ex = ५६१ एनएम (DPSS ५६१ एनएम लेजर), & #955; em = 601-635 एनएम; DAPI: & #955; ex = ४०५ nm (डायोड ४०५ लेज़र), & #955; em = 410-507 nm.- लेजर शक्ति को समायोजित करने और प्रत्येक ट्रैक के लिए संकेत तीव्रता का अनुकूलन करने के लिए सेटिंग्स हासिल । समग्र छवि को इकट्ठा करने और बचाने के लिए । एक अलग स्लाइड में प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करने के लिए एक ही लेज़र सेटिंग्स का उपयोग करें ।
- प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता के दृश्य के लिए, RGB प्रोफ़ाइल उपकरण मैक्रो के लिए स्थापित करें ImageJ < सुप वर्ग = "xref" > १० . मैक्रो को किसी पाठ फ़ाइल (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt) के रूप में वेबपेज से सहेजें । ImageJ मेनू से, प्लगइंस चुनें-& #62; मैक्रोज़-& #62; स्थापित करें; RGB प्रोफ़ाइल उपकरण स्थापित करने के लिए पाठ फ़ाइल का चयन करें ।
- ImageJ में फोकल इमेज फाइल को खोलें और 3 स्टैक्स से कम्पोजिट इमेजेस को आरजीबी में कन्वर्ट करके निम्न कार्य करें: image-& #62; रंग-& #62; चैनल टूल । चयन & #34; समग्र & #34; ड्रॉपडाउन मेनू से और सभी तीन चैनलों की जांच करें । फिर, छवि का चयन करें-& #62; Type-& #62; आरजीबी रंग.
- & #160; RGB प्रोफ़ाइल उपकरण चिह्न का चयन करें और profiled होने के लिए छवि में अनुभाग में एक पंक्ति बनाएं । प्लॉट करने के लिए तीव्रता डेटा को स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें.
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Representative Results
photobleaching पूर्व उपचार चरण एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए तुरंत पहले प्रतिजन पुनः प्राप्ति और immunostaining (चित्र 1a) के लिए जोड़ा जा सकता है । photobleaching तंत्र के विधानसभा भी विभिंन, सस्ती, बंद-the-शेल्फ घटकों का उपयोग किया जा सकता है (चित्र 1b) । सफेद फास्फोरस एल ई डी के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उन्हें व्यापक रेंज photobleaching के लिए उपयुक्त बनाता है जो तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल किया गया, पिछले रिपोर्टों के साथ सहमत (चित्रा 1C)5,11. ४८ ज photobleaching के बाद, speckles कि lipofuscin के रूप में अच्छी तरह से सामांय पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के समान की तीव्रता दोनों उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में काफी कम हो गया था FTLD-टी (चित्रा 1 डी) के एक दाग अनुभाग में । photobleaching की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम दो अलग माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग FTLD टी के एक मामले में रोग ताऊ समावेशन कल्पना करने के लिए hyperphosphorylated ताऊ के लिए दाग. ताऊ शामिल किए जाने के विभिंन आकार और लेबलिंग के लिए दो chromophores का उपयोग भी हमें विश्वास के लक्ष्य से फ्लोरोसेंट सुविधाओं को आत्मविश्वास से अलग करने के लिए तकनीक मांय की अनुमति देता है ।
कम आवर्धन पर समग्र छवियों में, ताऊ-सकारात्मक समावेशन, Alexa ४८८ और टेक्सास लाल चैनलों के संयोजन से सना हुआ पीले रंग की आकृति विज्ञान, कम सेल प्रक्रियाओं है कि ' के रूप में संदर्भित कर रहे हैं के अंगूठी के आकार का संग्रह के होते हैं astrocytic सजीले टुकड़े ' (चित्रा 2a-सी) । यह आकृति विज्ञान corticobasal अध (सीबीडी)12,13की विशेषता है, जो इस मामले की पैथोलॉजी रिपोर्ट से सहमत है । अनुपचारित नमूने में, कई संरचनाओं ताऊ शामिल किए जाने के समान नहीं था कि समग्र छवि में मौजूद हैं, और लाल चैनल में मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति दिखाया, सुझाव है कि यह autofluorescence के बजाय इरादा एंटीबॉडी धुंधला है. दृश्य (चित्र 2a) के पूरे क्षेत्र में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का एक महत्त्वपूर्ण स्तर इस चैनल में भी दिखाई देता है । इन फ्लोरोसेंट सुविधाओं को हटा दिया जाता है और समग्र छवि बहुत क्लीनर प्रकट होता है जब नमूनों photobleaching (पंजाब) और रासायनिक शमन (चित्र बी-सी) के साथ इलाज किया गया ।
हम तो प्रत्येक नमूने में एक छोटे क्षेत्र की रूपरेखा द्वारा इन नमूनों में प्रतिदीप्ति मतभेद मात्रा । एक एकल astrocytic पट्टिका तुलना (चित्रा 2d-आर) के लिए प्रत्येक उपचार हालत में प्रस्तुत किया है । अनुपचारित नमूने में, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति सभी तीन चैनलों में मौजूद है, लेकिन दोनों Alexa ४८८ और टेक्सास लाल एंटीबॉडी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति अपेक्षाकृत उच्च (अंजीर 2h) था । हालांकि, अनुपचारित नमूने में मौजूद फ्लोरोसेंट संरचनाओं टेक्सास लाल माध्यमिक एंटीबॉडी कि ताऊ के लिए दाग (चित्रा 2h) के लिए तुलनीय में प्रतिदीप्ति में तीव्रता का था । यदि लक्ष्य प्रोटीन हमारे मामले में ताऊ के रूप में एक अलग, पूर्वानुमान आकृति विज्ञान नहीं था, ऊतक में autofluorescence छवि प्रतिपादित किया है ।
इसके विपरीत, जब photobleaching पूर्व उपचार immunostaining से पहले लागू किया गया था, Alexa ४८८ और टेक्सास लाल चैनलों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति काफी अनुपचारित नमूने की तुलना में कम था, और immunostained ताऊ की प्रतिदीप्ति अप्रभावित रहे (चित्रा 2i-एम) । वाणिज्यिक रासायनिक शमन photobleaching के रूप में बस के रूप में प्रभावी रूप से Alexa ४८८ चैनल में autofluorescence बुझती । यह भी DAPI पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, जो ४८ ज photobleaching उपचार (चित्रा 2 एम) से प्रभावित नहीं था दबा दिया । हालांकि, रासायनिक शमनकर्ता भी टेक्सास लाल माध्यमिक और DAPI संकेतों की तीव्रता कम, उल्टा शमन (चित्रा 2n-आर) की एक निश्चित डिग्री का सुझाव ।
चित्र 1 : एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस कार्यप्रवाह में photobleaching पूर्व उपचार के आवेदन । A) ऊतक अधिग्रहण से इमेजिंग करने के लिए मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल की सरलीकृत योजनाबद्ध. प्राथमिक और माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के आवेदन कार्टून द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । एक प्रतिनिधि माइक्रोस्कोप छवि का उत्पादन किया है । स्केल बार = १०० µm. B) एक प्रतिनिधि photobleaching उपकरण का उपयोग कर निर्मित बंद-the-शेल्फ घटकों (चिंतनशील ढक्कन नहीं दिखाया गया है) । ग) सफेद एलईडी सरणी के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम । ४५० एनएम और ५५० एनएम पर एक व्यापक चोटी पर एक संकीर्ण उत्सर्जन चोटी मनाया जाता है । घ) Alexa ४८८ (493-570 एनएम) और टेक्सास लाल (601-635 एनएम) उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में FTLD-टी ऊतक के अंतर्जात पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर photobleaching का प्रभाव । lipofuscin speckles जैसी फ्लोरोसेंट ४८ एच photobleaching के बाद कम दिख रहे हैं । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2:विरोधी phosphorylated ताऊ immunostaining के साथ FTLD-टी ऊतक के एक मामले की छवि गुणवत्ता पर autofluorescence हटाने का प्रभाव. एक-सी) कम आवर्धन, समग्र इम्यूनोफ्लोरेसेंस में देखने के प्रतिनिधि क्षेत्रों की छवियां अनुपचारित (क), photobleached के लिए ४८ ज (ख) और रासायनिक शमनकर्ता इलाज (सी) के नमूने । रंग उनके संबंधित प्रकाश स्रोतों द्वारा उत्तेजना के माध्यम से निंनलिखित चैनलों में प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व: Alexa ४८८ (हरा): λपूर्व = ४८८ एनएम (आर्गन लेजर) λem = 493-570 एनएम; टेक्सास लाल (लाल): λपूर्व = ५६१ एनएम (DPSS ५६१ एनएम लेजर), λem = 601-635 एनएम; DAPI (नीला): λex = ४०५ एनएम (डायोड ४०५ लेजर), λem = 410-507 एनएम । स्केल बार = १०० µm । d-r) अनुपचारित (डी जी), photobleached (i-l) और रासायनिक शमनकर्ता (एन क्यू) नमूनों, अलग प्रतिदीप्ति चैनलों के साथ, विलय छवि, और मात्रा प्रतिदीप्ति संकेत प्रोफाइल में बिंदीदार क्षेत्रों की उच्च आवर्धन छवियों । मर्ज किए गए चैनल (g, l, q) में डॉटेड रेखाएं उस पंक्ति को दर्शाती है जिस पर सिग्नल प्रोफ़ाइल (h, m, r) जनरेट की गई थीं । स्केल बार = ५० µm. फ्लोरोसेंट कणों (वायुसेना),immunolabeled तौ प्रतिदीप्ति (ताऊ) और नाभिक संकेत (nuc) के संकेत हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस पांडुलिपि में वर्णित ऊतकों के photobleaching पूर्व उपचार बंद-the-शेल्फ घटकों का उपयोग कर autofluorescence के प्रभावी उंमूलन के लिए अनुमति देता है । प्रोटोकॉल formalin में phosphorylated ताऊ समुच्चय के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का वर्णन-फिक्स्ड मानव मस्तिष्क Alexa ४८८ और टेक्सास लाल को माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग ऊतक, DAPI के साथ एक परमाणु counterstain के रूप में । अन्य ऊतकों के लिए विधि लागू करने के लिए, हम एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में नमूना के लिए एक ४८ एच photobleaching पूर्व उपचार प्रदर्शन की सलाह देते हैं. photobleaching के बाद, निर्माता की सिफारिशों के बाद एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग कर ब्याज की सुविधाओं के लिए मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं । यदि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अभी भी मौजूद है, photobleaching अवधि और/या एंटीबॉडी धुंधला चरण संशोधित करने की आवश्यकता है । photobleaching की अवधि के लिए उपकरण और नमूने में autofluorescence के स्तर के निर्माण के लिए चयनित लैंप के आधार पर भिंन होगा । प्रत्येक अद्वितीय लैंप तंत्र के लिए इष्टतम ब्लीचिंग समय निर्धारित किया जाना चाहिए । यह एक दाग photobleaching द्वारा किया जा सकता है, coverslipped ऊतक खंड टीबीएस-azide में घुड़सवार और एक अंतर्जात माइक्रोस्कोप का उपयोग 12 एच अंतराल पर स्लाइड के प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति को मापने । पिछले रिपोर्टों में, हम कण विश्लेषण और घातीय क्षय कार्य के लिए वक्र फिटिंग द्वारा lipofuscin photobleaching मॉनिटर5, लेकिन सादगी के लिए, नियमित अंतराल पर वर्गों के दृश्य अवलोकन के लिए समान रूप से प्रभावी हो सकता है ंयायाधीश अवधि जिस पर प्रतिदीप्ति के अधिकांश बुझती हो जाता है । lipofuscin pigments, एक ८०० लक्स लैंप के साथ ४८ एच मशीन के उच्च मात्रा युक्त मस्तिष्क ऊतक आयु वर्ग के हमारे मामले में पर्याप्त था । यदि विशिष्ट संकेत photobleaching के बाद पृष्ठभूमि की तुलना में कमजोर रहता है, धुंधला के दौरान प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता बढ़ाने पर विचार करें । यह भी पृष्ठभूमि संकेत गैर-विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी बाइंडिंग द्वारा कारण नहीं है सुनिश्चित करने के लिए एक द्वितीयक एंटीबॉडी-केवल नियंत्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है । एंटीबॉडी का चयन करने के लिए ध्यान रखना है कि पार नहीं प्रतिक्रिया, खासकर जब कई लक्ष्यों के लिए धुंधला । इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि विशिष्ट संकेतों अनजाने में धुंधला प्रक्रिया के दौरान नहीं बुझती हैं । उदाहरण के लिए, Nissl दाग (ंयूरॉंस के लिए दाग) BSA द्वारा बुझती है । इस उदाहरण में, अवरुद्ध समाधान के BSA घटक जैसे मछली त्वचा जिलेटिन5विकल्प के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।
photobleaching के लिए सफेद फास्फोरस एल ई डी का उपयोग कुछ सीमाओं ६५० एनएम के लिए ४२० एनएम से अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के कारण है । इस प्रकार, यूवी तरंग दैर्ध्य में कोई महत्वपूर्ण photobleaching संभव है । इसके अलावा, व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के कारण, विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के photobleaching chromophores अवांछित उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य बाहर फिल्टर करने के लिए एलईडी सरणियों के ऊपर रंग फिल्टर शीट ओवरले के रूप में संशोधनों की आवश्यकता है । साथ ही, photobleaching ऊतक की अन्य विधियों से अधिक समय तक संसाधन की आवश्यकता हो सकती है । इस मामले में, मस्तिष्क ऊतक की आयु (एक ८९ वर्षीय व्यक्ति से) और अधिक से अधिक 2 दिनों की लंबी एल्डिहाइड निर्धारण अवधि के कारण, एक ४८ h photobleaching अवधि की आवश्यकता थी । हालांकि कोई सक्रिय संसाधन समय की आवश्यकता है, एक को ध्यान में photobleaching समय ले और तदनुसार सत्र की योजना बनानी चाहिए । उच्च चमक या कई लैंप के उपयोग के एलईडी लैंप काफी फोटॉन फ्लक्स में सरल वृद्धि द्वारा photobleaching समय को कम कर सकते हैं ।
मौजूदा तरीकों की तुलना में, हमारी तकनीक कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में स्कैनिंग पराबैंगनीकिरण का उपयोग photobleaching के विपरीत, हम एलईडी photobleaching का उपयोग कर हमारे नमूनों की तस्वीर प्रेरित क्षति का कोई संकेत नहीं मनाया. हमारे तंत्र का एक अंय प्रमुख लाभ अंय तकनीकों पर लागत में उल्लेखनीय कमी है । हमारे तंत्र के विधानसभा की लागत लगभग $१० अमरीकी डालर है, और तंत्र के विधानसभा काफी लचीला है कि किसी भी प्रयोगशाला photobleacher के अपने संस्करण को गोद ले सकते हैं । इसकी तुलना में, अंय तरीकों mutispectral का उपयोग कर कस्टम स्लाइड धारकों और शीतलक मंडलों के साथ एलईडी arrays को $१००० USD तक की आवश्यकता है8का निर्माण । इसके अलावा, वाणिज्यिक रासायनिक शमन करने वाले उपभोग्य सामग्रियों है कि १०० स्लाइड के लिए $१२० अमरीकी डालर की लागत और नमूने में संभावित अवांछित यौगिकों परिचय । वर्तमान अध्ययन की संभावना में तुलना के लिए इस्तेमाल रासायनिक शमनकर्ता लिपिड बाध्यकारी सूडान ब्लैक डाई, जो लिपो के immunostaining के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल हैं.
कुल मिलाकर, photobleaching पूर्व उपचार और नमूना के immunostaining में सबसे महत्वपूर्ण कदम immunostaining के दौरान खंड के हैंडलिंग शामिल है । यह महत्वपूर्ण है कि एक बार खंड photobleaching के दौरान reहाइड्रेटेड है, यह किसी भी बाद में कदम से बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है । स्लाइड के सुखाने एंटीबॉडी के असमान वितरण का कारण है और uncreated कलाकृतियों पैदा करेगा । समय और संभावित कीमती नमूनों की हानि से बचने के लिए, देखभाल प्रोटोकॉल में कई चरणों में लिया जाना चाहिए । प्रतिजन पुनः प्राप्ति के बाद, ऊतक टीबीएस-ट्राइटन permeabilization समाधान करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । हवा के लिए भी क्षणिक जोखिम जब नमूना उच्च तापमान को गर्म है ऊतक के तात्कालिक सुखाने का कारण होगा । यह भी सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी, अवरुद्ध, या counterstain समाधान पूरी तरह से आवेदन के दौरान ऊतकों को कवर । यह सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से hydrophobic पेन द्वारा रेखांकित समाधान रन से बचने के लिए और है कि सभी समाधान एक स्तर की सतह पर एक humidified कक्ष में लागू कर रहे है द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । यह रातोंरात गर्मी (प्राथमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी) के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ।
photobleaching के सफल आवेदन सफेद फास्फोरस एल ई डी का उपयोग करने से पहले दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस के ऊतकों संग्रहीत करने के लिए तरीकों के आवेदन की सुविधा हो सकती है । यह एक बहुमुखी और सस्ती इलाज है कि हम भविष्य में नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदाई होने की उंमीद है । हालांकि हम केवल मानव मस्तिष्क ऊतक के लिए इस पद्धति को लागू किया है, इस तकनीक को आसानी से किसी भी दाग प्रोटोकॉल जिसमें autofluorescence वांछनीय परिणाम, विशेष रूप से postmitotic ऊतक में ऐसे हृदय या कंकाल के रूप में रोक रहा है में शामिल किया जा सकता मांसपेशियां जहां lipofucin ज्यादा जमा होने की संभावना है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन में पूरे या भाग में समर्थन किया गया था कनाडा के Neurodegeneration और एजिंग (CCNA) के कंसोर्टियम, कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), कनाडा के एस सोसायटी (एस कनाडा), और कनाडा के अल्जाइमर सोसायटी (ए एस सी) । लेखक Spatio-लौकिक लक्ष्यीकरण और विकिरण प्रतिक्रिया (STTARR) कार्यक्रम और इसके संबद्ध के प्रवर्धन से FTLD मस्तिष्क के ऊतकों, मिलान गांगुली प्रदान करने के लिए समुद्री मस्तिष्क ऊतक बैंक से सुल्तान Darvesh और एंड्रयू रीड शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ऊतक embedding और अनुभाग सेवाओं के लिए अनुदान एजेंसियों, और सूक्ष्म उपकरणों प्रदान करने के लिए उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा (AOMF). केविन हेडली को पांडुलिपि की अहम समीक्षा के लिए धन्यवाद दिया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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